：35循环，94°C，30s, 60°C，Imin ;72°C，7min。PCR产物 经过I %琼脂糖凝胶电泳分离，获得7. Ikb的hF VDI基因全长片段。并进行凝胶回收。
[0046] (2)第二次PCR获得B结构域两端的两个基因片段。
[0047] 以第一次PCR扩增后回收的F VDI全长DNA为模板，分别米用primer-3和primer-4 为一对引物；及采用primer-5和primer-6为一对引物分别进行PCR，扩增条件为：30循 环，94°C，lmin，62°C，Imin ;72°C，2miruPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分别获得了 2. 3kb 和2. Ikb的两个DNA片段。并分别进行凝胶回收。
[0048] (3)第三次PCR获得B区缺失的hF VDI的基因片段。
[0049] 以第二次PCR扩增后回收的两个DNA片段为模板，以primer-3和primer-6为引 物进行PCR，扩增条件为：35循环，94°C，lmin，60°C，Imin ;72°C，4min。经过1%琼脂糖凝 胶电泳，获得4. 4kb的目的基因片段，并进行凝胶回收，即获得B区完全缺失的hF VIfl目的基 因。
[0050] 2. 2重组表达质粒构建。
[0051] 将B区完全缺失型hF VDI的目的基因片段和表达载体pMSG分别经限制性内切酶 NheI和XhoI双酶切37°C过夜，并分别进行胶回收，然后用T4连接酶4°C过夜连接，将连接 产物转化到克隆菌株JM109中，从转化的氨苄青霉素抗性平板上挑取单菌落提取质粒进行 鉴定，最后获得含有重组质粒的单克隆菌株，进而对目的基因核苷酸序列测定，测序结果和 理论序列一致，证明重组质粒构建成功。
[0052] 3. B区部分缺失型重组人凝血因子VID表达质粒构建。
[0053] 本项目采用pMSG载体作为重组人凝血因子VID的表达载体。通过两次PCR获得B 区部分缺失的人凝血因子VID基因片段。经过限制性内切酶NheI和XhoI双酶切目的基因片 段和pMSG载体，连接后转化至克隆菌株JM109中筛选，获得B区部分缺失型pMSG-hF VID重 组真核表达载体。重组质粒测序结果显示，目的基因序列与理论序列一致。具体构建方法 如下。
[0054] B区部分缺失的hF VIfl目的基因获得。
[0055] 3. 1引物设计。
[0056] 目的基因序列为B区中间区域缺失的hF VDI片段，且左右两片段以接头连接、目的 基因两端有NheI和XhoI限制性内切酶酶切位点。
[0057] 全长两端设计引物primer-lF和primer-2R，B区缺失区域两端设计带有接头的引 物 primer-lR 和 primer_2F。其中 primer-lF 和 primer-lR 用于片段 1 的合成，primer_2F 和primer-2R用于片段2的合成。
[0058] 目的基因两端设计引物primer-3和primer-6,用于目的基因全序列的获得。其中 primer-3含有NheI酶切位点和提高外源基因表达量的Kozak序列（GCCACC)，primer-6含 有XhoI酶切位点。具体位置如图2所示。
[0059] 引物序列如下。
[0060] primerl-F ：5' -ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTTTGCGATTCTG CTTTAGTGCC-3'，
[0061] primerl-R ：5' -GGAGTAGGCG TCGGCTTGGC AGCCGCCTCT TTTGCGGGATAGCCCATGTG GAGTA-3'（划线部分为接头序列）
[0062] primer2-F :5' -CGCAAAAGAG GCGGCTGCCA AGCCGACGCC TACTCCCACCAATCATGCAA TAGCAGCAAT-3'（划线部分为接头序列）
[0063] primer2-R :5' -TCAGTAGAGG TCCTGTGCCT CGCAGCCCAG AACCTCCATCCTCAGGGCAA TCTGGTGCAC-3'
[0064] primer-3 :5' -CTA GCT AGC CAC CAT GCA AAT AGA GCT CTC CAC C-3'（划线部分为 NheI酶切位点，粗体部分为Kozak序列）
[0065] primer-6 :5' -CCG CTC GAG TCA GTA GAG GTC CTG TGC C-3'（划线部分为 XhoI 酶切 位点）
[0066] 3. 2目的基因序列获得PCR扩增。
[0067] 以7. Ikb的hF VDI基因全长片段为模板，分别以primer-lF、primer-lR和 primer-2F、primer-2R为引物进行PCR扩增，扩增条件为：30循环，94°C，lmin, 65°C，Imin ; 72°C，2min。获得2. 5kb的片段1和2. 2kb的片段2。
[0068] 以片段1和片段2为模板，以primer-3和primer-6为引物进行PCR反应，扩增条 件为：35 循环，94°C，lmin, 60°C，lmin ;72°C，4min。获得 4. 7kb 的 B 区部分缺失的 hF VID 目的基因片段。
[0069] 3. 3重组质粒构建。
[0070] 将目的基因片段和载体pMSG分别经NheI和Xh〇I37°C双酶切过夜，胶回收后用T4 连接酶4°C过夜连接。将连接产物转化到克隆菌株JM109中，从转化的氨苄青霉素抗性平板 上挑取单菌落提取质粒进行鉴定，获得含有B区缺失hF VDI结构重组质粒的单克隆菌株。重 组质粒测序结果显示，目的基因序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功。
[0071] 4.转染。
[0072] (1)质粒准备。
[0073] 过夜培养pMSG-hF VID /JM109,用质粒提取试剂盒提取pMSG-hF VID的质粒DNA，Seal 酶切使之线性化，酶切产物经PCR回收试剂盒回收，回收产物用于下一步细胞转染。
[0074] (2)细胞准备。
[0075] CHO DG44细胞经37°C复苏后，使用2mL含有10 %胎牛血清的a -MEM培养基（含 有核苷酸和脱氧核苷酸）悬浮细胞，以细胞密度2 X 105/孔接种于6-孔板，第二天用于细 胞转染。
[0076] (3)细胞转染。
[0077] 1)将准备用于转染的细胞用IXPBS漂洗两次，每孔加入ImLa -MEM培养基（含核 苷酸和脱氧核苷酸）孵育Ih。
[0078] 2)取 2ug 重组质粒 DNA 和 5. 3 μ L Dosper，并与 10. 4ng DHFR 表达质粒 pDCHIP - 起混匀，将混合物室温下孵育40min。
[0079] 3)将复合物加入细胞中，放入37°C孵育6h，将培养基换用2mL新鲜的含10%胎牛 血清的ct -MEM培养基（含核苷酸和脱氧核苷酸）。
[0080] 4)转染两天后，细胞经胰蛋白消化液消化后，用含10%胎牛血清的a -MEM培养基 (不含核苷酸和脱氧核苷酸；OnM MTX)重悬细胞，按照细胞密度300/200 μ L接种于96-孔 板继续培养。
[0081] 5)转染三周后，初次筛选的细胞分别从96孔板到6-孔板中依次逐步扩大培养。
[0082] 5.重组工程细胞克隆培养及筛选。
[0083] 5. IMTX 加压筛选。
[0084] 为了获得rhF VDI高表达的细胞株，最初筛选的细胞在传代过程中逐步提高筛选培 养基中MTX的浓度。首先，使用含10%胎牛血清的a -MEM培养基（不含核苷酸和脱氧核 苷酸；IOnM MTX)培养细胞，按照细胞密度4 X 105/孔接种于6-孔板中。接下来，传代细胞 过程中，筛选培养基的MTX浓度由IOnM增加为ΙΟΟηΜ，接下来再增加为ΙμΜΜΤΧ，最后，MTX 浓度增加至5μΜ。在MTX逐步增加浓度的过程中，保存每步筛选适应的细胞。不同浓度的 MTX筛选的细胞的rhF VID表达量采用ELISA法检测。根据ELISA检测结果，筛选出两个表达 水平高的细胞。
[0085] 5. 2单克隆筛选。
[0086] 将筛选的两个单克隆细胞分别经胰酶消化后，采用含10%胎牛血清的Cl-MEM培 养基（不含核苷酸和脱氧核苷酸；1 μ M或5 μ M的MTX)悬浮细胞，按照细胞密度0. 5/200 μ L 接种于96-孔板。培养四周后，34个单克隆细胞的被选出。每个单克隆细胞分别从96孔板 到 6孔板中依次逐步扩大培养。采用ELISA法检测各单克隆细胞的rhF VDI的表达量，根据 检测结果再次筛选出两个表达量较高的单克隆细胞。再次经过对筛选的两个表达水平较高 细胞的生长情况和rhF VDI表达量的比较，最终筛选的单克隆细胞并经过传代扩增，保存20 管于液氮中冻存。
[0087] 6.细胞库建立。
[0088] 经过筛选获得的高表达细胞株，以细胞密度为5X 105/mL接种于125mL摇瓶，在 37°C、140rpm±10的C02培养箱中培养两天后，同样按照细胞密度为5X105/mL接种于 250mL摇瓶；两天后再次进行细胞传代扩增，以细胞密度为5X 105/mL接种于500mL摇瓶； 两天后，以细胞密度为5 X 105/mL接种于IL摇瓶（内含有400mL培养液）；两天后，收集 细胞，按照3X 107/mL/管进行细胞保存，最后将细胞作为主细胞库保存于液氮罐中。从主 细