床阶段肿瘤样本肥R2的DM、RNAW 及蛋白质的表达水平，结果显示，25%的仅手术切除前列腺癌的患者（UNTtumor)，59%的 手术前接受抗雄激素治疗的患者（TAAtumor)和78%的雄激素治疗失败后并且发生骨转移 (雄激素非依赖型AI)的患者存在过表达的肥R2。
[00巧]妨肺癌：肺癌中肥R2的过表达主要与基因转录和转录后修饰有关。国内研究显 示，肥R2过表达主要发生在非小细胞肺癌，且主要是腺癌，而不是鱗癌。但是，国外88 例匈牙利非小细胞肺癌患者的检测结果显示，仅有5例存在肥R2过表达，且均为鱗状细 胞癌，研究结果存在差别。此外，对肥R2在肺癌中过表达与细胞分化程度的关系也有不 同的结论。
[0016] 针对肥R2祀点的抗体药物；曲妥珠商品名为赫赛汀化rceptin，是W肥R2为祀点 的人源化单克隆抗体。Herceptin是通过基因工程方法将非特异性的人IgG的稳定区与鼠 的抗肥R2蛋白IgG的抗原决定簇嵌合在一起获得的，其不仅对肥R2受体有高度亲和力， 同时还解决了鼠源性抗体应用于人体的免疫源性问题，能减少人抗鼠抗体的产生，从而避 免被网状内皮系统清除。体内外实验研究表明，应用Herceptin下调的表达，能使细胞生长 减慢，并能显著提高其对放化疗的敏感性。1998年美国抑A批准该药用于肥R2过表达的转 移性乳腺癌二线和S线治疗，是第一个也是唯一一个被批准用于治疗肥R2/neu蛋白表达 阳性转移性乳腺癌和早期乳腺癌的人源化单克隆抗体药物。
[0017] 3.双特异性抗体技术发展
[0018] 双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原 表位的抗体。
[0019] 抗体药物是W细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物 大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定祀点定向制备等优点。单克隆抗体在临 床上主要应用于W下=个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗W及抗感染治疗。其中肿瘤的治 疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗产品中，用于肿 瘤治疗的产品数量占比大概为50%。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异祀点刺 激免疫系统来杀伤祀细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的 效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之 一，现已成为抗体工程研究领域的热点。
[0020] 用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在 祀细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗 中具有广阔的应用前景。
[0021] 4.双特异性抗体制备
[0022] 双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交一杂交 瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连 接在一起，制备出了双特异性单克隆抗体，该是最早的双特异性单克隆抗体概念。杂交一杂 交瘤法是通过细胞杂交法或者=元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，该些细胞杂交 瘤或者=元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋己细胞 融合而得到的，只能生产出鼠源的双特异性抗体，它的应用受到了极大的限制。而随着分子 生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化双特异性抗体的多种构建模式，并主要分 为双特异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体，多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数 种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。
[0023] 5.肿瘤的过继免疫治疗
[0024] 肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者 体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活 的T淋己细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于 晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合 应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿 瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手 术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛 的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是，双特异性抗体一端可W结合培养好的免疫细 胞的表面抗原CD3,并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细 胞的表面抗原；该样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免 疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。通过该种方法可有效解决肿瘤细 胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗S大传统治疗方式后的"不彻底、易转移、副作用大" 等弊端。
【发明内容】
[0025] 术语和缩略语
[0026] BiAb:双特异性抗体 〇3ispecific antibody)
[0027]TA:肿瘤抗原（tumorantigen)
[0028]VH:重链可变区化eavychainvari油leregion)。
[0029]VL:轻链可变区（li曲tchainvari油leregion)。
[0030]化；轻链恒定区（^constant region of li曲t chain)。
[0031]CDR;是英文Complementaritydeterminingregions(CDRs)的缩写，是指抗体的 抗原互补决定区。
[003引ScFv;单链可变区抗体片段（single-chainvari油lefragment)，又称为单链抗 体。
[003引 化D:细胞系开发（celllinedevelopment)
[0034]FACS;巧光激活细胞分选（Fluorescence-activatedcellsorting)，也称为流式 细胞分选术。
[0035] 本发明针对常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法进行的 新分子-双特异性抗体的创制，在传统单克隆抗体主要通过CDC，ADCC和调亡能力来杀伤肿 瘤细胞的基础上，增加了介导T细胞的免疫疗法，大大提高了免疫系统杀伤肿瘤细胞的功 效。
[0036] 具体地，本发明提供了W下的技术方案：
[0037] 在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含；(a) 单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细 胞；优选地，该轻链-重链对对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；和化）单链单 元，为融合肤，该融合肤包含单链可变片段Scfv和具有较链区、C肥结构域和C册结构域的 化片段，其中该融合肤针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选地该肿瘤细胞表 面抗原是肥R2、CD20、CD30和CD133,更优选地该肿瘤细胞表面抗原是肥R2。
[003引在一种实施方式中，所述双特异性抗体的单链单元的C肥结构域位于ScFv片段和C册结构域之间。
[0039] 在一种实施方式中，双特异性抗体的单链可变片段由轻链可变区和重链可变区结 构域组成，它们都祀向于抗原表位肥R2。
[0040] 在一种实施方式中，在单价单元中，轻链通过二硫键与重链结合；重链通过一个或 多个二硫键与所述融合肤结合。
[0041] 在一种实施方式中，单链单元包括针对肥R2的抗体抗-肥R2,单价单元包括针对 CD3的抗体抗-CD3 ;优选地，所述抗-CD3重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列， 抗-CD3的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，W及所述抗-HER2Scfv-化的 氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列；并且抗-CD3重链在222位点上的半脱氨酸与 抗-CD3的轻链212位点上的半脱氨酸W二硫键的形式连接，所述的抗-CD3重链在228和 231位点上的半脱氨酸与抗-HER2Scfv-化的258和261位点上的半脱氨酸分别W二硫键的 形式连接，所述的抗-CD3重链在370和401位点上与抗-HER2Scfv-化的441和424位点 上形成盐桥连接，所述的抗-CD3重链在409位点上与抗-HER2Scfv-化的398位点上形成 隆突-入-穴连接。
[0042] 在一种实施方式中，单价单元中的重链包含人或者人源化的化片段，优选地，该 重链的化片段包含人IgGWc片段；所述融合肤的化片段包含人或者人源化的化片段，优 选地，该融合肤的化片段包含人IgGWc片段。
[0043] 在一种实施方式中，所述单价单元的人IgGl化段和所述单链单元的IgGl化通过 盐桥和隆突-入-穴结构连接。
[0044] 在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体的制备方法，所述方法包括：
[0045] (1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第 二表达载体上；
[0046] (2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；
[0047] (3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述细胞是CHO-S细 胞；或者优选地，所述分离步骤包括：蛋