玉米基因zmspl1和zmspl2及其用图

玉米基因zmspl1和zmspl2及其用图
【专利摘要】提供了玉米基因ZmSPL1和ZmSPL2。还提供了由这些基因编码的蛋白和这些基因的用途。
【专利说明】
玉米基因 ZMSPL1和ZMSPL2及其用途
技术领域
[0001 ]本发明设及植物转基因技术的领域，特别是玉米基因 ZmSPLl和ZmSPL2及其用途。
[0002] 发明背景
[0003] 器官大小是植物形态的一个重要特征。在相同生长条件下，在具有相同基因型和 相同物种内的个体间的器官大小中存在较少差异。对于不同物种，种子和其它器官的大小 变化很大，而属于一个物种的个体具有相对一致的种子和类似大小的其它器官的大小。运 些事实显示，植物的器官大小严格地在遗传控制下。同时，植物器官的形态受外部环境(包 括因素，诸如:光、溫度和营养)强烈影响。因此，控制植物器官大小的机制是非常复杂的，因 为是植物的内部机制，其精确地控制器官当最终长大时的预定大小。植物器官大小是重要 的产量性状。因此，关于植物的种子或其它器官的大小的研究将为可用于开发转基因高产 量作物的可能遗传修饰提供理论基础和一些新颖遗传来源。
[0004] 植物器官大小可W根据物种而变化很大。除了自然条件的限制，人工选择在植物 器官大小中具有显著影响。尽管植物的器官大小自我控制的机理仍不清楚，但存在至少两 种支配植物的器官大小（即细胞数目和细胞大小）的已知潜在因素。通常，不同物种的相同 器官的大小由其中的细胞数目确定。然而，单独地改变细胞数目或细胞大小并不总是导致 器官大小的变化。运是因为一种因素的变化可由其它因素代偿。例如，器官的细胞数目的减 少可能不会导致更小的植物器官，因为植物可W通过增加总细胞体积而弥补细胞数目的减 少，使得整个器官维持相同大小。运种细胞生长的协调机制提示植物本身的内源调节。一些 最近研究已经发现通过影响细胞数目、细胞大小或两者而发挥作用W控制器官大小的基因 途径的一些关键基因。
[0005] 发明概述
[0006] 在一个方面，本发明提供分离的核酸分子，其包含定位W提供多核巧酸的表达的 在植物细胞中有功能的启动子，所述多核巧酸具有W下核巧酸序列：
[0007] (l)SEQ ID NO: 1或3中所示的序列，或其互补序列；
[000引（2)在严格杂交条件下与SEQ ID NO: 1或3中所示的序列杂交的序列；
[0009] (3)与沈Q ID N0:1 或3中所示的序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %、98.5 %、99 %或99.5 %序列同一性的序列，其编码表现出控制植物 器官大小的功能的蛋白；或
[0010] (4)由通过缺失、取代、插入或添加一个或多个核巧酸而衍生化SEQ ID NO: 1或3中 所不的序列获得的序列。
[0011] 在另一个方面，本发明提供分离的核酸分子，其包含定位W提供多核巧酸的表达 的在植物细胞中有功能的启动子，所述多核巧酸具有W下核巧酸序列：
[001^ (1)序列，其编码沈Q ID N0:2或4中所示的多肤；
[0013] (2)序列，其编码与SEQ ID N0:2或4中所示的序列具有至少85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%序列同一性的多肤;或
[0014] (3)序列，其编码由通过缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸而衍生化SEQ ID N0:2或4中所示的序列获得的多肤。
[0015] 在又一个方面，本发明提供包含上述核酸分子的重组DNA构建体。
[0016] 在又一个方面，本发明提供分离的多肤，其选自：
[0017] (1)具有沈Q ID N0:2或帥所示的氨基酸序列的多肤;和
[0018] (2)衍生自（1)的多肤，其包含SEQ ID N0:2或4中所示的氨基酸序列中取代、缺失 或添加一个或多个氨基酸残基，并且表现出控制植物器官大小的功能。
[0019 ]在又一个方面，本发明提供包含上述核酸分子或重组DNA构建体的植物细胞。
[0020]在又一个方面，本发明提供包含上述核酸分子或重组DNA构建体的转化植物。
[0021 ]在根据本发明的方面的一个实施方案中，转化植物与未转化植物或野生型植物相 比具有改变的性状，其中所述改变的性状选自增加的种子大小、增加的种子数目、增加的种 子重量、增加的巧粒大小、增加的巧粒数目、增加的巧粒重量、增加的叶片大小、增加的叶片 面积、增加的叶片数目、增加的叶片细胞数目、增加的主根长、增加的侧根数、增加的根鲜重 和增加的产量。总之，运也可W导致植物的器官大小增加和/或植物的生物量增加。
[0022] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，转化植物是单子叶植物或双子叶植物， 优选作物植物。
[0023] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物选自玉米(Zea mays)、芸苔属 (Brassica)物种（例如，卷屯、菜型油菜（B.napus)、宪菁（B.rapa)、芥菜（B. juncea))、首猜 (Medicago sativa)、水稻（0;ryza sativa)、黑麦（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor , Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennisetum glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龙爪稷（Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花（Carthamus tinctorius)、小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、渡萝 (Ananas comosus)、相橘属果树（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鳄梨（Persea americana)、无花果化i州s casica)、番石恼 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄揽（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树 (Primus amygdalus)、糖用甜菜（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麦、草替、蓝 替和大麦。
[0024] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是拟南芥（Arabidopsis thaliana)、水稻或玉米。
[0025] 在又一个方面，本发明提供上述基因、DNA分子、重组DNA构建体或蛋白在控制植物 器官大小中的用途。
[0026] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述控制植物器官大小是增加植物器官 大小，且所述植物器官是植物种子、叶或根。
[0027] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物， 优选作物植物。
[0028] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物选自玉米(Zea mays)、芸苔属 (Brassica)物种（例如，卷屯、莱型油莱（B.napus)、宪菁（B.rapa)、芥莱（B. juncea))、首猜 (Medicago sativa)、水稻（0:ryza sativa)、黑麦（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龙爪稷化leusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花（Carthamus tinctorius)、小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、聽萝 (Ananas comosus)、丰甘橘属果树（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鳄梨（Persea americana)、无花果化icus casica)、番石楷 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄才览（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树 (F*runus amygdalus)、糖用甜莱（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麦、草霉、蓝 霉和大麦。
[0029] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是拟南芥、水稻或玉米。
[0030] 在又一个方面，本发明提供用于培育转基因植物的方法，其包括将上述基因引入 靴植物^获得转基因植物，其中所述转基因植物具有比原始目标植物更大的植物器官大 小。
[0031] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物， 优选作物植物。
[0032] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物选自玉米(Zea mays)、芸苔属 (Brassica)物种（例如，卷屯、莱型油莱（B.napus)、宪菁（B.rapa)、芥莱（B. juncea))、首猜 (Medicago sat iva)、水稻（0:ryza sat iva)、黑麦（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龙爪稷化leusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花（Carthamus tinctorius)、小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、聽萝 (Ananas comosus)、丰甘橘属果树（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鳄梨（Persea americana)、无花果化icus casica)、番石楷 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄才览（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树 (F*runus amygdalus)、糖用甜莱（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麦、草霉、蓝 霉和大麦。
[0033] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是拟南芥、水稻或玉米。
[0034] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物器官是植物种子、叶或根。
[0035] 在又一个方面，本发明提供用于增加植物产量的方法，其中所述方法包括用上述 重组DNA构建体转化植物且获得与未转化植物或野生型植物相比显示增加产量的转化植 物。
[0036] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物， 优选作物植物。
[0037] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物选自玉米(Zea mays)、芸苔属 (Brassica)物种（例如，卷屯、莱型油莱（B.napus)、宪菁（B.rapa)、芥莱（B. juncea))、首猜 (Medicago sativa)、水稻（0:ryza sativa)、黑麦（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龙爪稷化leusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花（Carthamus tinctorius)、小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、聽萝 (Ananas comosus)、丰甘橘属果树（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鳄梨（Persea americana)、无花果化icus casica)、番石楷 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄才览（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树 (F*runus amygdalus)、糖用甜莱（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麦、草霉、蓝 霉和大麦。
[0038] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是拟南芥、水稻或玉米。
[0039] 在又一个方面，本发明提供产生具有改变的性状的转化植物的方法，其中所述方 法包括用上述重组DNA构建体转化植物且获得转化植物，与未转化植物或野生型植物相比， 所述转化植物显示选自^下的改变的性状:增加的种子大小、增加的种子数目、增加的种子 重量、增加的粹粒大小、增加的粹粒数目、增加的粹粒重量、增加的叶片大小、增加的叶片面 积、增加的叶片数目、增加的叶片细胞数目、增加的主根长、增加的侧根数、增加的根鲜重和 增加的产量。
[0040] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物， 优选作物植物。
[0041] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物选自玉米(Zea mays)、芸苔属 (Brassica)物种（例如，卷屯、莱型油莱（B.napus)、宪菁（B.rapa)、芥莱（B. juncea))、首猜 (Medicago sat iva)、水稻（0:ryza sat iva)、黑麦（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龙爪稷化leusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花（Carthamus tinctorius)、小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、聽萝 (Ananas comosus)、丰甘橘属果树（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鳄梨（Persea americana)、无花果化icus casica)、番石楷 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄才览（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树 (Primus amygdalus)、糖用甜菜（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麦、草替、蓝 替和大麦。
[0042] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述植物是拟南芥、水稻或玉米。
[0043] 在根据本发明的方面的一个实施方案中，所述产量相对于在类似条件下生长的非 转基因植物的产量增加约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。优选地，所 述植物是水稻，且1000-重量增加10-25 %。此外，优选地，所述植物是玉米，且100-重量增加 15-25%。
[0044] 附图简述
[0045] 图1显示ZmSPLl基因的全长CDS扩增产物。
[0046] 图2显示ZmSPLl和拟南芥AtS化的聚类分析结果。
[0047] 图3显示不同玉米组织中的ZmSPLl基因的表达。
[004引图4显示ZmSPLl过表达的转基因拟南芥中的种子的表型特征。
[0049] 图5显示ZmSPLl过表达的转基因拟南芥和野生型植物中授粉后的种子和胚的表型 特征。
[0050] 图6显示ZmSPLl过表达的转基因拟南芥中的根系的表型特征。
[0051] 图7显示ZmSPLl过表达的转基因拟南芥和野生型植物中的叶的表型特征。
[0化2] 图8显示ZmSPL2基因的全长CDS扩增产物。
[0化3] 图9显示ZmSPL2和拟南芥AtS化的聚类分析结果。
[0化4] 图10显示不同玉米组织中的ZmSPL2的表达。
[0055] 图11显示ZmSPL2过表达的转基因拟南芥中的种子的表型特征。
[0056] 图12显示ZmSPL2过表达的转基因拟南芥和野生型植物中授粉后的种子和胚的表 型特征。
[0057] 图13显示ZmSPL2过表达的转基因拟南芥中的根系的表型特征。
[005引图14显示ZmSPL2过表达的转基因拟南芥和野生型植物中的叶的表型特征。
[0059] 图15比较从ZmSPLl和ZmSPL2过表达的转基因水稻植物获得的巧粒和对照巧粒的 表型特征。
[0060] 图16比较从ZmSPLl和ZmSPL2过表达的转基因水稻和对照植物获得的巧粒的粒长 和粒宽。
[0061 ]图17比较从ZmSPLl和ZmSPL2过表达的转基因水稻和对照植物获得的巧粒的1000- 粒重量。
[0062] 图18显示过表达ZmSPL 1的转基因玉米幼苗的PCR鉴定的结果。
[0063] 图19对比ZmSPLl过表达的转基因玉米和Z肥NG-58玉米的穗部(spike)性状。
[0064] 图20比较ZmSPLl过表达的株系和Zhen58对照之间的穗长。
[00化]图21比较ZmSPLl过表达的株系和Zhen58对照之间的穗宽。
[0066] 图22比较ZmSPLl过表达的株系和Zhen58对照之间的穗长。
[0067] 图23比较ZmSPLl过表达的株系和Zhen58对照之间的穗宽。
[0068] 图24比较ZmSPLl过表达的株系和Zhen58对照之间的穗部中的粒行数。
[0069] 图25比较ZmSPLl过表达的株系和Zhen58对照之间的行中的粒数。
[0070] 图26比较ZmSPLl过表达的株系和Zhen58对照之间的粒径。
[0071] 图27比较ZmSPLl过表达的株系和Zhen58对照之间的100-粒重量。
[0072] 图28比较ZmSPkOX水稻和对照之间的粒长。
[0073] 图29比较ZmSPkOX水稻和对照之间的粒宽。
[0074] 图30显示平均粒长的比较。
[0075] 图31显示平均粒宽的比较。
[0076] 图32比较ZmSPLl和ZmSPL2转基因水稻和对照之间的巧粒表型。
[0077] 图33比较ZmSPLl和ZmSPL2转基因水稻和对照之间的粒长。
[007引图34比较ZmSPLl和ZmSPL2转基因水稻和对照之间的粒宽。
[0079] 图35比较ZmSPkOX水稻和对照之间的粒长。
[0080] 图36比较ZmSPkOX水稻和对照之间的粒宽。
[0081 ]图37显示平均粒长的比较。
[0082] 图38显示平均粒宽的比较。
[0083] 图39比较ZmSPLl和ZmSPL2过表达的转基因水稻和对照之间的1000-粒重量。
[0084] 发明详述
[0085] 提供W下定义和方法W更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员W实施本 发明。除非特别指出，术语应当根据相关领域的本领域普通技术人员的常规用法来理解。
[0086] 如本文所使用，"植物"包括完整植物、转基因植物、分生组织、枝条器官/结构（例 如，叶、茎和块茎）、根、花和花器官/结构(例如，巷、專片、花瓣、雄蕊、屯、皮、花药和胚珠）、种 子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房）、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细 胞(例如，保卫细胞、卵细胞、花粉、叶肉细胞等)及其后代。可W用于本公开方法中的植物种 类通常与可用于转化和育种技术处理的高等和低等植物的种类一样广泛，其包括被子植物 (单子叶和双子叶植物）、裸子植物、藤类植物、木贼类植物、裸藤植物、石松类植物、苔薛植 物和多细胞藻类。
[0087] 如本文所使用，"转基因植物"意指其基因组已经通过重组DNA的稳定整合而改变 的植物。转基因植物包括从最初转化的植物细胞再生的植物和来自转基因植物的后续生成 或杂交的后代转基因植物。
[008引如本文所使用，"对照植物"意指不含赋予增强性状的重组DNA的植物。对照植物用 于鉴定和选择具有增强性状的转基因植物。合适的对照植物可W是用于生成转基因植物的 亲本系的非转基因植物，例如，缺乏重组DNA的野生型植物。合适的对照植物也可W是含有 赋予其它性状的重组DNA的转基因植物，例如，具有增强的除草剂耐受性的转基因植物。在 一些情况下，合适的对照植物可W是被称为阴性分离子或阴性等值线（isoline)的不含重 组DNA的半合子转基因植物系的后代。
[0089]如本文所使用，"转基因植物细胞"意指用稳定整合的重组DNA转化(例如通过农杆 菌介导的转化或通过使用W重组DNA包被的微粒轰击或通过其它手段)的植物细胞。本公开 的植物细胞可W是最初转化的植物细胞，其作为微生物或作为子代植物细胞存在，其再生 为分化的组织，例如具有稳定整合的重组DNA的转基因植物，或衍生自子代转基因植物的种 子或花粉。
[0090] 如本文所使用，"性状"是植物或特定植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特 征。在一些情况下，该特征是人眼可见的，诸如种子或植物尺寸，或者可W通过生化技术(诸 如检测蛋白、淀粉、某些代谢物或种子或叶的油含量)或通过观察代谢或生理过程(例如通 过测量对水剥夺或特定盐或糖浓度的耐受性)或通过测量一种或多种基因的表达水平(通 过利用Nodhern分析、RT-PCR、微阵列基因表达测定法或报道基因表达系统)或通过农业观 察(诸如高渗胁迫耐受性和产量)来测量。然而，任何技术都可用于测量转基因植物中的任 何选择的化学化合物或大分子的量、比较水平或差异。
[0091] 如本文所使用，"增强性状"意指由于转基因植物中的重组DNA的稳定整合和表达 而导致的转基因植物的特性。运种性状包括，但不限于，增强的农艺性状，其特征在于增强 的植物形态、生理、生长和发育、产量、营养增强、疾病或害虫耐受性或环境或化学耐受性。
[0092] 如本文所使用，术语"分离的"是指将分子与其在其天然或自然状态下通常相关的 其它分子至少部分分离。在一个实施方案中，术语"分离的基卸'或"分离的DNA分子"是指与 在其天然或自然状态下通常侧接基因或DNA分子的核酸至少部分分离的基因或DNA分子。因 此，通过例如重组技术，融合至通常与其无关的调控或编码序列的基因或DNA分子在本文中 被认为是分离的。运种分子被认为是分离的，甚至当整合入宿主细胞的染色体中或与其它 DNA分子一起存在于核酸溶液中时。
[0093] 如本文所使用，术语"严格条件"是Sambrook等人，1989和化ymes等人，于:Nucleic Acid Hybridization,A Practical A卵roach,IRL Press,Washington,DC(1985)描述的那 些。促进DNA杂交的适当的严格条件，例如，6.0 X氯化钢/巧樣酸钢(SSC)，约45°C，随后在50 °C用2.0XSSC洗涂，是本领域技术人员是已知的，或可见于Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons，N.Y. (1989) ,6.3.1-6.3.6。例如，洗涂步骤中的盐 浓度可W选自在50°C的约2.0 X SSC的低严格度，至在50°C的约0.2 X SSC的高严格度。此外， 洗涂步骤中的溫度可W从室溫、约22°C的低严格条件增加至约65°C的高严格条件。溫度和 盐两者均可W变化，或者溫度或盐浓度保持不变，而另一变量改变。例如，中度严格条件是 在约2.0XSSC和约65°C。在本发明的一个方面，本发明的基因具有SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3中所示的核酸序列。在本发明的另一个方面，本发明的基因与SEQ ID N0:1或SEQ ID ^:3中所示的核酸序列共享80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%和99.5%序列同一性。在 本发明的进一步方面，本发明的基因与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3中所示的核酸序列共享 95%96%、97%、98%、98.5%、99%和99.5%序列同一性。
[0094] 本发明的基因还包含经由缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核巧酸而衍生自 SEQ ID NO: 1或3中所示的序列的变体序列。基因突变是指基因组DNA分子的突然且可遗传 的变异。在分子水平，基因突变意指碱基对组成或结构的排列序列的变化。基因突变的生成 可W是自发的或诱导的。用于人工诱导基因突变的方法包括物理因素(诸如丫射线、X射线、 UV、中子束等），化学因素(诸如烷基化剂、碱基类似物、抗生素等)和生物因素(诸如某些病 毒、细菌等）。此外，可W使用重组DNA技术在DNA分子中的指定位点引入特定变异，W便进行 定点诱变。本领域技术人员可W使用任何运些众所周知的诱变方法，W获得包含一个或多 个核巧酸的缺失、取代、插入和/或添加的SEQ ID NO: 1或3中所示的序列的变体序列。
[00M]如本文所使用，术语"重组体"是指自然界中通常不存在且因此通过人为干预生成 的DM和/或蛋白和/或生物体的形式。运种人为干预可W产生重组DM分子和/或重组植物。 如本文所使用，"重组DNA分子"是包含非天然一起存在并且是人为干预的结果的DNA分子的 组合的DNA分子，例如，包含W下的组合的DNA分子:至少两种彼此异源的DNA分子，和/或人 工合成且包含源自自然界中通常存在的多核巧酸序列的多核巧酸序列的DNA分子，和/或包 含人工引入宿主细胞的基因组DNA的转基因和宿主细胞基因组的相关侧接DNA的DNA分子。 重组DNA分子的实例是本文描述的源自将转基因插入拟南芥、玉米或水稻基因组、其可W最 终导致重组RNA和/或蛋白分子在该生物体中表达的DNA分子。
[0096] 如本文所使用，术语"转基因"是指人工引入宿主细胞的基因组中的多核巧酸分 子。运种转基因可W是与宿主细胞异源的。术语"转基因植物"是指包含运种转基因的植物。
[0097] 如本文所使用，"基因"或"基因序列"是指基因的部分或完全编码序列，其互补序 列，和其5'和/或3'非翻译区。基因也是遗传的功能单元，并且在物理方面是参与产生多肤 链的沿着DNA(或RNA，在RNA病毒的情况下）的分子的核巧酸的特定区段或序列。后者可W经 历后续处理，诸如化学修饰或折叠 W获得功能性蛋白或多肤。通过实例的方式，转录调苄基 因编码转录调节多肤，其可W是功能性的或需要加工W充当转录的引发剂。
[0098] 如本文所使用，术语"DNA序列"、"核巧酸序列"和"多核巧酸序列"是指DNA分子的 核巧酸序列，通常从5'（上游)端至3'（下游)端呈现。
[0099] 本领域技术人员众所周知的任何数量的方法都可W用于分离和操纵本发明中公 开的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链式反应)技术可用于扩增特定起始DNA分子和/ 或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段也可W通过其它技术来获得，诸如通过经由化学 方法直接合成片段，诸如使用自动化寡核巧酸合成仪。
[0100] 如本文所使用，术语"启动子"通常是指参与RNA聚合酶II和其它蛋白（反式作用转 录因子）的识别和结合W起始转录的DNA分子。启动子可W最初分离自基因的基因组拷贝的 5'非翻译区（5'UTR)。或者，启动子可W是合成产生或操纵的DNA分子。启动子也可W是嵌合 的，即通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的启动子。植物启动子包括获得自植物、 植物病毒、真菌和细菌诸如农杆菌和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)细菌的启动子DNA。
[0101] 在植物的所有或大多数组织中起始转录的启动子被称为"组成型"启动子。在发育 的特定时段或阶段过程中起始转录的启动子被称为"发育型"启动子。其表达在植物的特定 组织中相对于其它植物组织增强的启动子被称为"组织增强的"或"组织优选的"启动子。在 植物的特定组织内表达、且在其它植物组织中很少或没有表达的启动子被称为"组织特异 性"启动子。在植物的特定细胞类型、例如小抱子母细胞中表达的启动子被称为"细胞类型 特异性"启动子。"诱导型"启动子是响应于环境刺激诸如寒冷、干旱或光;或其它刺激诸如 创伤或化学应用而起始转录的启动子。植物中的许多生理和生化过程表现出具有约24小时 的周期的内源性节律。"昼夜启动子"是在昼夜振荡器的控制下表现出改变的表达概况的启 动子。昼夜调节经受环境输入诸如光和溫度W及生物钟的协调。
[0102] 如本文所使用，"多肤"包含多个连续的聚合氨基酸残基，例如，至少约15个连续聚 合的氨基酸残基。在许多情况下，多肤包含一系列的聚合的氨基酸残基，其为转录调节剂或 其结构域或部分或片段。此外，所述多肤可W包含：（i)定位结构域；（ii)活化结构域；（iii) 抑制结构域；（iv)寡聚化结构域；（V)蛋白-蛋白相互作用结构域；（vi)DNA结合结构域;或其 他。所述多肤任选地包含经修饰的氨基酸残基、不由密码子编码的天然存在的氨基酸残基、 非天然存在的氨基酸残基。
[010引如本文所使用，"蛋白"是指一系列氨基酸、寡肤、肤、多肤或其部分，无论是天然存 在的还是合成的。
[0104] 重组DNA构建体使用本领域普通技术人员已知的方法组装并通常包含可操作连接 至DNA(其表达提供增强的农艺性状）的启动子。其它构建体组分可W包括额外的调节元件， 诸如用于增强转录的5'前导序列和内含子，3'非编码区（诸如多腺巧酸化信号和位点），和 用于转换或祀向或信号肤的DNA。
[0105] "分离的多肤"，无论是天然存在还是重组的多肤，在细胞中（或细胞外）比在野生 型细胞中的其天然状态的多肤更富集，例如，富集超过约5%，富集超过约10%，或富集超过 约20%，或超过约50%，或更多，即，可替代地表示为:相对于W100%均一化的野生型富集 105% ,110% ,120% ,150%，或更多。运种富集不是野生型植物的自然反应的结果。可替代 地，或额外地，将分离的多肤与其它通常缔合的其它细胞组分分离，例如，通过任何各种蛋 白纯化方法。
[0106] 同一性百分比描述多核巧酸或蛋白区段在序列（例如核巧酸序列或氨基酸序列） 的比对中不变的程度。序列的比对通过W下生成:手动比对两个序列，例如作为参考的如本 文提供的所示序列和另一序列，W产生最高数目的匹配要素，例如个别核巧酸或氨基酸，同 时允许将缺口引入任一序列。与参考序列比对的序列的"同一性分数"是匹配要素的数目， 除W参考序列的全长，不包括由比对过程引入参考序列的缺口。如本文所使用，"百分比同 一性"（"％同一性"）是同一性分数乘W100。
[0107] 对于天然序列内的氨基酸的保守取代可W选自天然存在的氨基酸所属类别的其 它成员。运些各种类别内的代表性氨基酸包括，但不限于：（1)酸性(带负电荷)氨基酸，诸如 天冬氨酸和谷氨酸；（2)碱性(带正电荷)氨基酸，诸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；（3)中性极 性氨基酸，诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半脫氨酸、酪氨酸、天冬酷胺和谷氨酷胺;和(4)中 性非极性(疏水)氨基酸，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、鄉氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸 和甲硫氨酸。对于天然蛋白或多肤内的氨基酸的保守取代可W选自天然存在的氨基酸所属 组群的其它成员。例如，具有脂族侧链的氨基酸组群是甘氨酸、丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸和异 亮氨酸;具有脂族-径基侧链的氨基酸组群是丝氨酸和苏氨酸;具有含酷胺侧链的氨基酸组 群是天冬酷胺和谷氨酷胺;具有芳族侧链的氨基酸组群是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;具有 碱性侧链的氨基酸组群是赖氨酸、精氨酸和组氨酸;和具有含硫侧链的氨基酸组群是半脫 氨酸和甲硫氨酸。天然保守氨基酸取代组群是:鄉氨酸-亮氨酸、鄉氨酸-异亮氨酸、苯丙氨 酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸鄉氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酷胺-谷氨酷胺。本公 开的一个进一步方面包括，由于天然序列中的一个或多个氨基酸的缺失或插入导致与所述 蛋白序列的氨基酸相差一个或多个氨基酸的蛋白。
[0108] 具有特别经济利益的性状是增加的产量。产量通常被定义为来自作物的经济价值 的可测量的产生。运可W在数量和/或质量方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如， 器官的数目和大小、植物构造(例如，分枝的数目）、种子产生、叶衰老等。根发育、营养物摄 取、胁迫耐受性等也可W是决定产量的重要因素。
[0109] 种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物营养是重要 的。作物诸如玉米、水稻、小麦、油菜和大豆占人类总热量摄入的超过一半，无论是通过种子 本身的直接消耗还是通过由加工的种子饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业过程中使用 的糖、油和多种代谢物的来源。种子的发育设及许多基因，并且需要代谢物从根、叶和茎转 移入正在生长的种子。
[0110] 增加的植物生物量涵盖饲料作物如首猜、青胆玉米和干草的产量。巧粒作物中已 经使用产量的许多代用物(proxies)。运些中主要是植物或植物器官大小的估计值。植物大 小可W根据物种和发育阶段W许多方式进行测量，但包括植物总干重、地上干重、地上鲜 重、巧粒大小、巧粒数目、100-或1000-粒重、叶片面积、茎体积、植物高度、莲座直径、叶长、 根长、根质量和叶数。许多物种在给定发育阶段维持植物的不同部分的大小之间的保守比 率。运些异速生长(allometric)关系用于从运些大小度量中的一种外推至另一种（例如， Tittonell等人2005 Ag;ricEcosys&Envi;ronl05:213)。在早期发育阶段的植物大小将通 常与发育晚期的植物大小相关。具有较大叶面积的较大植物通常可W比较小植物吸收更多 的光和二氧化碳，因此，在相同时段期间将可能获得更大的重量(化soula&Tollenaar 2005 Maydica 50:39)。除了微环境或遗传优势的潜在延续W外，运是植物最初必须达到较大大 小。存在植物大小和生长速率的强遗传组分（例如，ter Steege等人2005 Plant 化ysiology 139:1078)，并且因此对于一定范围的多种基因型，在一种环境条件下的植物 大小可能与在另一环境条件下的大小相关化ittalmani等人2003 Theoretical Applied Genetics 107:679)。
[0111] 就作物诸如玉米、水稻等而言，产量意指收获巧粒的量，并且粒径和粒重性状在确 定产量中是关键的。因此，增加粒径和粒重对于增加增加作物的产量是重要的。
[0112] 控制器官大小，例如控制种子大小，特别是控制主要作物的种子大小，在农业产业 中具有显著的重要性。器官大小是重要的产量性状。因此，关于植物种子大小和器官大小的 研究为作物的遗传修饰中的高产量培育提供了理论基础和新颖基因来源。本发明人基于使 用S細技术的玉米杂交种和亲本植物的表型差异首次发现新颖的玉米ZmSPLl和ZmSPL2基 因，并且它们可用于控制玉米和其它植物(诸如拟南芥）的种子或其它器官的大小和水稻种 子的大小。在本发明中，控制器官大小意指增加植物器官(例如种子、根、叶等)的大小，并且 植物器官的大小增加约1 % -120 %、约10 % -110 %、约20 % -100 %、约30 % -90 %、约40 % - 80%或约50%-70%，例如，植物器官的大小增加约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、100%、110%、120%或上述范围内的任何值。
[0113] SSH是用于快速确定两个不同的生物材料之间的差异表达的分子生物学技术，并 且它是用于快速筛选差异表达的基因的有效方法，并且它是寻找新基因的重要方式。可W 通过经由SSH构建、文库评估和筛选(反向斑点杂交)获得阳性克隆、对阳性克隆测序和进行 生物信息学分析来确定差异基因的状况。此外，全长cDNA序列可W使用RACE技术获得，并使 用Nc化them印迹或实时PCR进行评估。通过对玉米Zong31 xP 138杂交胚的SSH文库分析，本发 明人发现杂交种和亲本植物之间的玉米ZmSPLl的表达是不同的，运提示ZmSPLl在胚胎发育 中发挥作用。ZmSPLl恰巧与拟南芥序列中的最长类的AtS化具有高相似性。本发明人针对拟 南芥AtSI^L蛋白序列用捜索玉米基因组网站中的玉米DNA数据库（http:// www.maizesequence.org,ht1:p://www.maizeg化.org)，并使用获得的基因组序列W便用 BLASTx捜索玉米EST数据库，因此推导并获得玉米基因组序列的外显子区域。通过人工剪接 运些序列而获得最长的cDNA序列（SEQ ID NO: 1)。当然，本领域技术人员也可W使用诸如 RACE等技术获得根据本发明的ZmSPLl基因的cDNA序列。
[0114] 拟南芥是一种小型开花植物，其被广泛用作植物生物学(包括遗传和植物发育研 究）中的模式生物体。拟南芥在植物学中具有与小鼠在医学中和果蛹在遗传学研究中相同 的作用。拟南芥具有W下优点：小植物(可能在一个杯中种植几株），生命周期短(从发芽到 种子成熟不超过6周），高种子产量(个别植物可W产生许多种子），和强活力(可W在普通培 养基上获得人工培养物）。拟南芥具有目前已知最小的植物基因组。每个单倍体染色体组(n =5)具有总共7千万个碱基对长度，也就是说，仅为小麦基因组的1/80。因此，由其克隆相关 基因相对容易。此外，已经在2000年测序了拟南芥的整个基因组，运是进行测序分析的首个 植物基因组。拟南芥是一种自花授粉植物，并且其基因高度纯合。并且当用理化因子处理 时，其显示高突变率，并且可W容易获得各种代谢功能缺陷的植物。例如，当用包含除草剂 的培养基筛选时，通常获得1/100000的抗除草剂突变率。由于上述优点，拟南芥是用于遗传 研究的较好材料。
[0115] 除了植物形态研究中的经典AB对莫型W外，在最近十年中，一些植物学家使用拟南 芥模型系统类似地研究不同的植物组织和器官的发育。通过分析大量拟南芥突变体，科学 家们广泛研究了植物根、茎、叶、花、胚和种子的发育，植物中的抗病性和胁迫抗性的机制和 参与各种生命活动的激素、光和环境因素诱导的信号传导，等等。运些极大延伸了我们关于 植物中的生命活动的内在机制的知识。
[0116] 为了确定由推定基因编码的蛋白的大小W及起始密码子和终止密码子的位置，本 发明人实施W下步骤:使用来自NCBI的0RF Finder软件化ttp://www.ncbi .nlm.nih.gov/ gorf/goW. html)对玉米ZmSPLl基因的推定cDNA序列进行开放阅读框（0RF)分析，并用 BLASTx确定正确的阅读框。基于获得的基因 0RF序列和相应的基因组序列，使用基因结构分 析软件Gene Shucture Display ServerAttp://gsds.cbi.pku.edu.cn/)对获得的玉米 ZmSPL 1基因进行结构分析。
[0117] 用玉米B73基因组图谱（Schnable，等人，2009)，本发明人将获得的序列定位于染 色体上，并在基因组中捜索上游序列。具体地，本发明人实施W下步骤：1)进行基因组BLAST 捜索；2)经由"基因组视图（Genome view)"观察基因组结构;和3)点击相应的染色体区域W 便通过相应区域的上游和下游基因定位基因的位置。
[0118] 本发明人进一步对获得的ZmSPLl基因进行多重序列比对和系统发生分析。为了分 析玉米ZmSPLl基因和拟南芥中的同源基因序列之间的差异，本发明人首先使用具有软件的 默认参数的ClusterW(Thompson,等人，1994)构建SPL序列的多重序列比对构型。本发明人 将多重序列比对结果引入GeneDoc化t1:p: //www. cris. com-Ketchup/genedoc. shtml)，并且 基于蛋白的多重序列比对结果，使用MEGA4.UKumar，等人，2004)进行系统发生树校正，W 经由邻接法生成拟南芥和玉米的SHJC族成员的无根系统发生树。
[0119] 本发明人通过实时巧光定量PCR研究不同植物部分中的ZmSPLl基因表达，并且发 现ZmSPLl在不同的组织或器官之间显示表达水平的显著变化。ZmSPLl基因在未成熟的玉米 果穗和雄穗中具有最高的表达水平，并且在正在发育的胚、胚乳、种皮、根和花丝中具有非 常低的表达水平。
[0120] 本发明人进一步研究ZmSPLl基因的功能和用途。可W通过各种常用的植物转基因 方法将根据本发明的ZmSPLl基因引入植物。例如，农杆菌介导的方法、基因枪方法、PEG介导 的方法、超声波法、子房注射法、花粉管途径法等。农杆菌是±壤中常见的革兰氏阴性菌，并 且可W在自然条件下趋化感染大多数双子叶植物的损伤部位W诱导冠瘦(crown gall)和 软根(faiiT root)的生成。根癌农杆菌和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的细胞 包含分别具有T-DNA区段的Ti质粒和化质粒。在通过感染植物伤口进入植物细胞之后，农杆 菌可W将T-DNA插入植物基因组。因此，农杆菌代表天然植物遗传转化体系。可W将祀基因 插入修饰的T-DNA区，并经由农杆菌感染实现外源基因转移和引入植物细胞，然后通过细胞 和组织培养技术再生为转基因植物。最初，农杆菌介导的转化仅用于双子叶植物中。近年 来，它也广泛地用于一些单子叶植物(特别是水稻）中。基因枪介导的转化方法使用火药爆 炸或高压气体来加速(该加速装置被称为基因枪)微射弹，由此将用祀基因包被的高速微射 弹递送入完整植物组织和细胞，然后通过细胞和组织培养技术再生转基因植物。筛选出转 基因阳性植物，即转基因植物。与农杆菌介导的转化相比，基因枪转化的一个主要优点是， 其不受受体植物的范围的限制。并且其载体质粒的构建是相对简单的。因此，基因枪转化是 转基因研究中广泛使用的方法之一。在花粉管途径法中，将含有祀基因的DNA溶液注入子 房，W便经由在植物的开花和受精期间形成的花粉管途径将外源DNA引入生殖细胞，并且进 一步将外源DNA引入受体细胞的基因组，并且随着生殖细胞的发育生长出新的个体植物。该 方法的最大优点是其不依赖于组织培养和人工再生技术，因此该技术是简单的，不需要设 备齐全的实验室，并且容易由普通培育人员操作。本发明的W下实施例采用农杆菌介导的 转化方法。具体地，转化包括叶盘方法、真空渗入方法和原生质体方法等。
[0121]在引入前，有必要构建表达重组载体。对于根据本发明引入植物的重组载体没有 限制。根据引入和转化技术，例如，各种质粒，Ti质粒，人工染色体，植物病毒，包括RNA病毒， 单株DNA病毒等，可W用作本发明的载体。许多常见的载体构建技术是现在可用的，例如，通 过DNA质粒的酶促切割的常规载体构建技术。即，通过限制性酶切割DNA质粒，然后用连接酶 连接祀基因，W形成表达载体。该技术具有W下缺陷：其需要构建多种中间体，因此具有低 效率。此外，由Invitrogen Inc.开发的Gateway技术不需要限制酶和连接酶。其首先构建进 入载体，然后将祀基因重复引入不同的目的载体而用于表达。该方法具有简单、快速、高克 隆效率和高特异性(保持阅读框的位置和基因不改变)的特征。此外，由于抗生素选择标记 基因是在当前转基因植物中的隐患，本领域技术人员开发了一些不具有选择标记的重组载 体及其转化方法，例如，包含两个或S个T-DNA的二元或S元表达载体的共转化。本发明的 W下实施例采用Gateway技术。为了将ZmSPLl基因引入植物，本发明人使用Gateway技术构 建ZmSPLl基因的过表达载体。该载体根据W下程序构建:将gateway BP反应接头并至引物 的5'末端，通过PCR扩增获得具有接头序列的祀基因片段，经由琼脂糖凝胶回收产物，W特 定比率混合回收的产物与载体PD0NR221，并且在BP Clonase?酶的催化下，将祀基因取代入 PD0NR221载体。构建的载体是进入载体。本发明人W特定比率混合构建的含有祀基因的进 入载体与目的载体，并且在LR Clonase?酶的催化下，将进入载体中含有的祀基因取代入目 标载体，从而获得含有祀基因的表达载体。为了将祀基因 ZmSPLl引入植物诸如拟南芥，本发 明人使用构建的过表达载体转化农杆菌。所使用的农杆菌可W是根癌农杆菌GV3101 (Ectopic overexpression of wheat TaSrg6 gene confers water stress tolerance in Arabidopsis.Tong SM，Ni ZF,Peng 皿，Dong GQ,Sun QX.2007,172(6):1079-1086,可 公开地得自中国农业大学）。然后本发明人用能态根癌农杆菌转化Columbia野生型拟南芥 (col-0,Yao Y,Ni Z,Du J,Han Z,Chen Y,Zhang Q,Sun Q.Ectopic overexpression of wheat adenosine diphosphate-ribosylation factor,TaARF,increases growth rate in Arabidopsis.J Integr Plant Biol.2009,51(1):35-44,可公开地得自中国农业大 学)。
[0122] 本发明还进行具有引入的ZmSPLl基因的拟南芥的表型研究(包括根系、叶和种子 的发育和重量）。结果显示，ZmSPLl-过表达的拟南芥具有增加的植物器官(特别是种子）。具 体地，本发明人进行ZmSPLl转基因拟南芥植物的表型研究，其中，首先，本发明人用显微镜 观察授粉后拟南芥种子的形态，并且用野生型拟南芥(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物作 为对照进行统计分析。从结果可见，与野生型拟南芥种子相比，ZmS化1转基因拟南芥 (ZmSPLl-OX)更大。运主要体现为巧粒长度。同时，野生型拟南芥(WT)和空载体转化的拟南 芥植物之间没有显著差异。此外，本发明人研究了种子的发育和重量。在研究中发现，成熟 的拟南芥种子主要由胚组成，并且随着种子发育，胚乳逐渐降解至消失。因此，在从ZmSPLl 转基因拟南芥植物(ZmS化1-0X)、空载体转化的拟南芥植物和野生型拟南芥植物(WT)授粉 之后5-9天，本发明人进一步通过TB0染色（用上述中相同的程序)动态观察种子的胚。授粉 后胚的显微镜观察显示，在授粉后第5天，当野生型种子在早屯、阶段时，转基因种子仍在球 状阶段;并且在授粉后第9天，野生型种子可几乎完全填充于种皮内，但转基因种子中的胚 具有很大的发育空间。运些结果表明，随着ZmSPLl基因的过表达，拟南芥种子的发育显示延 迟，由此导致更大的储存容量。同时，野生型拟南芥(WT)和空载体转化的拟南芥植物之间没 有显著差异。可W看到，ZmSPLl的过表达可改善重量。其次，本发明人研究了拟南芥的根系 的发育，其中对来自ZmSPLl转基因拟南芥植物(ZmSPLl-OX)的两个植物株系、空载体转化的 拟南芥植物和野生型拟南芥植物(WT)的种子进行发芽测试(在20°C溫度和16小时光照/8小 时黑暗的光周期）。表型结果显示，来自ZmSPLl转基因拟南芥植物的两个植物株系的种子比 野生型拟南芥种子发芽更快，并且比野生型拟南芥具有全根系的更高生长速率。第=，本发 明人研究了拟南芥的叶片大小，其中播种ZmSPLl转基因拟南芥(ZmSPLl-〇X)的种子、空载体 转化的拟南芥的种子和野生型拟南芥种子(WT)(在20°C的溫度和16小时光照/8小时黑暗的 光周期），并且在第25天用显微镜观察叶细胞。在第25天，观察地上植物部分的表型。结果显 示，ZmSPLl过表达的植物的地上部分比野生型植物的地上部分更大。同时，野生型拟南芥植 物(WT)和空载体转化的拟南芥植物之间没有显著差异。通过进一步研究，发现地上部分的 扩大主要呈现为莲座叶面积的增加。从叶表皮细胞的显微镜观察，表明该叶主要由于细胞 数增加、而不是细胞体积增加而扩大。
[0123] 因此，本发明人认为本发明的ZmSPLl基因在控制拟南芥的器官包括种子、根系和 叶中发挥作用。ZmSPLl基因的过表达可引起上述器官重量增加。在本发明中，植物器官的大 小可 W 增加约 1%-120%、约10%-110%、约 20%-100%、约 30%-90%、约40%-80%或约 50%-70%，例女曰，植物器官的大小增加约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、 110%、120%或上述范围内的任何值，诸如115%、88%、30%、24%或13%等。
[0124] 为了进一步研究ZmSPLl基因的功能和用途，本发明人将ZmSPLl基因引入单子叶植 物水稻和玉米并研究它们的表型。类似地，结果显示，ZmSPLl基因的过表达增加水稻和玉米 种子的种子大小。
[0125] 对于ZmSPLl基因用相同的技术和程序，本发明人从玉米发现用于控制玉米植物 (诸如拟南芥、玉米和水稻）的另一种ZmSPL2基因，并通过将该基因引入拟南芥、玉米和水稻 表明该基因的过表达也在控制植物器官(尤其是种子大小）中发挥作用。
[0126] 本发明中的宿主细胞包括，但不限于，用于介导植物的基因转化的细菌细胞，诸如 根癌农杆菌细胞，和用基因转化的植物细胞。
[0127] 根据本发明的植物包括，但不限于，单子叶植物和双子叶植物，包括作物植物(诸 如玉米（Zea mays)、芸苔属（Brassica)物种（例如，卷屯、菜型油菜（B.napus)、宪菁 (B.rapa)、芥菜(B. juncea))，特别是可用作巧油的来源的那些芸苔属物种，首猜(Medicago sativa)、水稻（0;ryza sativa)、黑麦（Secale cereale)、高梁（Sor曲um bicoloriSor曲um vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennisetum glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子 (Setaria italica)、龙爪稷（Eleusine coracana))、向日葵（Helianthus annuus)、红花 (Carthamus t inctor ius)、小麦（Tr i t i cum aestivum)、大豆（Glycine max)、烟草 (Nicotiana tabacum)、马铃馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花（海 岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、 木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、渡萝（Ananas comosus)、相橘属果树（Citrus spp.)、可可仙eobroma cacao)、茶（Came Ilia sinensis)、 香蕉（Musa spp.)、鳄梨（Persea americana)、无花果（Ficus casica)、番石恼（Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄揽（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果 (Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树（Primus amygdalus)、糖用甜菜（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麦、草替、蓝替、大麦、 蔬菜（诸如番茄化 ycopersicon esculentum)、窝宦（例如 Lactuca sativa)、青豆 (Phaseolus vulgaris)、利马豆（Phaseolus limensis)、豆宛豆（Lathyrus spp.)和黄瓜属 (Qicumis)的成员诸如黄瓜(C. sativus)、香瓜（C. cantalupensis)和甜瓜（C.melo)，观赏植 物（诸如杜酷（Rhododen化on spp.)、八仙花（Macro地ylla hy化angea)、朱穫化ibiscus rosasanensis)、玫瑰（Rosa spp.)、郁金香（Tulipa spp.)、水仙（化rcissus spp.)、矮牵牛 (Petuni曰 hybrid曰）、康乃馨（Di曰nthus c曰ryophyllus)、一品红（Euphorbi曰 pulcherrim曰） 和菊花(chrysanthemum))。在一个具体实施方案中，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、 首猜、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高梁、小麦、粟、烟草等）。在一些实施方案中， 优选拟南芥、水稻或玉米。
[0128] 包括W下实施例W表明本发明的某些优选实施方案的实例。本领域技术人员应当 理解，实施例中公开的技术是本发明的最佳模式。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员 应当理解，可W对本发明中公开的具体实施方案进行许多改变，并且在不偏离本发明的精 神和范围的情况下仍然可W获得相像或类似的结果。
[0129] 除非另有说明，否则W下实施例中使用的实验方法是本领域中的常规方法。
[0130] 除非另有说明，否则W下实施例中使用的材料、试剂是商业可得的。 实施例
[0131] 实施例1.玉米ZmSPLl基因的获取
[0132] 1.玉米ZmSPLl基因的发现
[0133] (1)发现玉米ZmSPLl基因
[0134] 通过对玉米Zong31xP138杂交胚的S甜文库分析，本发明人发现杂交种和亲本植物 之间的玉米ZmSPLl的表达是不同的，运提示ZmSPLl在胚胎发育中发挥作用。ZmSPLl恰巧与 拟南芥序列中的最长类的AtSPL具有高相似性。本发明人针对拟南芥AtS化蛋白序列用 tI3LASTn捜索玉米基因组网站中的玉米DNA数据库化ttp : //www.maizesequence . org, http: //www.maizegdb. org)，并使用获得的基因组序列W用BLASTx捜索玉米EST数据库，并 推导玉米基因组序列的外显子区域。通过人工剪接运些序列而获得最长的cDNA序列（SEQ ID N0:l)〇
[0135] (2)基因的结构分析和染色体定位
[0136] 为了确定由推定基因编码的蛋白的大小W及起始密码子和终止密码子的位置，本 发明人如下操作：使用来自NCBI的ORE Finder软件化ttp://www.ncbi .nlm.nih. gov/gorf/ go;rf .html)对玉米ZmSPLl基因的推定cDNA序列进行开放阅读框(ORE)分析，并用BLASTx确 定正确的阅读框。基于获得的基因0RF序列和相应的基因组序列，使用基因结构分析软件 Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi .pku.edu.cn/)对获得的玉米ZmSPLl 基因进行结构分析。
[0137] 用玉米B73基因组图谱（Schnable，等人，2009)，本发明人将获得的序列定位于染 色体上，并在基因组中捜索上游序列。具体地，1)进行基因组BLAST捜索；2)经由"基因组视 图"观察基因组结构；和3)点击相应的染色体区域W便通过相应区域的上游和下游基因定 位基因的位置。
[0138] (3)多重序列比对和系统发生分析
[0139] 为了分析玉米ZmSPLl基因和拟南芥中的同源基因序列之间的差异，本发明人首先 使用具有软件的默认参数的ClusterW(Thompson，等人，1994)构建S化序列的多重序列比对 构型。然后，本发明人将多重序列比对结果引入GeneDoc化t1:p://www. cris. com-Ketchup/ genedoc. shtml)，并且基于蛋白的多重序列比对结果，使用MEGA4. UKumar,等人,2004)进 行系统发生树校正，W经由邻接法生成拟南芥和玉米的族成员的无根系统发生树。
[0140] 2.获得玉米ZmSPLl基因
[0141 ]从玉米自交系zong31 的根材料（Yang X,Yan J,Shah T.Warburton ML,Li Q,Li L,Gao Y,Chai Y,Fu Z,Zhou Y,Xu S,Bai G,Meng Y,Zheng Y,Li J.Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection.Theor Appl Genet. 2010; 121(3) :417-31,可公开 地得自中国农业大学），用化izol试剂总RNA提取试剂盒(DP405-01，TIANGEN)提取RNA:进行 W下步骤:在含有研磨样品的各管中添加 ImL提取溶液并均匀混合;在室溫下（25°C)5分钟 之后，添加2(K)化氯仿，均匀混合，并离屯、(4°C，12000rpm) 15分钟;将等体积的异丙醇加入上 清液并在室溫下放置沉淀30分钟；离屯、(4°C，12000巧m) 10分钟之后，弃去上清液，用75%乙 醇洗涂沉淀，然后溶解于100此DEPC处理的双蒸水中。用R化无 RNase的DNase(M6101， Promega)纯化粗RNA:将R化反应溶液（lOOmM Tris-肥l，25mM MgS〇4和2.5mM CaCl2，DNAase lOU)加入RNA;在37°C浴中放置30分钟之后，用等体积的苯酪/氯仿提取;将两倍体积的无水 乙醇加入上清液，用于沉淀；离屯、(4°C，12000巧m)10分钟之后，弃去上清液，用75%乙醇洗 涂沉淀，然后溶解于40iil DEPC处理的双蒸水，由此获得总RNA。
[0142] 用于cDNA合成的总反应体系为20化（含有化g总RNA，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，75mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，50皿ol/L dNTPs，50pmol错定引物 T15: TTTTTTTTTTTTTTT(TAKARA，D510)，20U RNase抑制剂（TAKARA，D2313A)，200U M-MLV逆 转录酶。'〇111日旨日，11701))。在37°(：下解育2小时之后获得。0魁。1化。0魁与^下？0?引物用 于PCR反应中：L: ATGGAGGCCGCCAGGTTC，R: TTACATGGGTCCACGCTC。
[0143] 参考图1中显示的PCR结果，通过扩增获得单一 PCR产物，其具有特定3000bp条带。 通过测序，用于编码所得PCR产物的基因具有SEQ ID N0:1中所示的核巧酸序列，其中从5' 末端至3'末端具有位置1-2919的核巧酸的编码区。该基因被指定为ZmSPLl，并且由该基因 编码的蛋白被指定为ZmSPLl，其具有如SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列。
[0144] 对特定条带测序(SEQ ID NO: 1)并确定其染色体定位，发现所述基因在染色体1上 的l.llBin区域内。接下来，对ZmSPLl-编码的蛋白的氨基酸序列进行分析，并且在该序列的 N-末端处存在SBP-盒结构域。此外，用MEGA4.1软件中的N-J方法对玉米和拟南芥S化蛋白进 行同源性评估分析。
[0145] 结果显示于图2中，其显示ZmSPLl与拟南芥中编码最长氨基酸序列的一类SPL (AtS化1，AtSPL12)高度相似。
[0146] 3.通过实时巧光定量PCR测量不同植物位点中的ZmSPLl基因表达
[0147] 在Bio-Rad CI 000循环仪实时PCR系统上进行实时巧光定量PCR测定，并且10化的 反应体系含有化L cDNA、0.化M实时定量引物和扣L SYBR Premix Ex hq^RROAlD)。实时 定量引物具有 W 下序列：S化 1 -L: CTGCTCTGGCCCTATTTCTG; SPLl-R: GCATCGCTCCTCAAGGTCT。 来自不同发育阶段的玉米自交系Zong31的11种组织或器官的cDNA用作模板，即，来自播种 阶段(8天）的植物的根和叶；来自60天生长的植物的茎、节间、巷叶、花丝、不成熟的玉米果 穗和雄穗，W及来自授粉后15天的植物的种皮、胚和胚乳。PCR方案如下:在94°C变性5分钟； 然后在94°C变性10秒，在60°C退火20秒，和在72°C延伸30秒，35个循环;在72°C最终延伸7分 钟。在65°C-98°C绘制烙解曲线。然后，使用具有手动设定巧光阔值的比较阔值方法对实时 定量PCR结果进行定量分析，确定在运种阔值下的特定循环数，Ct值，并且基于Ct值计算各 组织或器官的C值，其中C = 2-AGt且A Ct = Ct鹏H-Ct械瞭隹。用双尾等方差t检验(P<0.05)进行 显著性检验。本实验包括3个生物学重复。
[0148] W玉米 18S rRNA基因作为对照，引物序列是LACATGCGCCTAAGGAGAAATAG;R: ACCTCCATGCTCACTGGTACTT 〇
[0149] 根据如图3中所示的结果，ZmSPLl显示在不同的组织或器官之间的表达水平的显 著变化。ZmS化1基因在未成熟的玉米果穗和雄穗中具有最高的表达水平，并且在正在发育 的胚、胚乳、种皮、根和花丝中具有非常低的表达水平。
[0150] 实施例2. ZmSPLl基因的使用
[0151 ] 通过Gateway技术，构建玉米ZmSPLl基因的过表达载体。大肠杆菌菌株是D册a且农 杆菌菌株是GV3101。
[0152] 1.过表达载体的构建
[0153]通过Gateway技术，根据W下程序构建载体:将gateway BP反应接头并至引物的5' 末端，通过PCR扩增获得具有接头序列的祀基因片段，经由琼脂糖凝胶回收产物，W特定比 率混合回收的产物与载体PD0NR221，并且在BP Clonase?酶的催化下，将祀基因取代入 PD0NR221载体。构建的载体是进入载体。然后，采取W下步骤：W特定比率混合构建的含有 祀基因的进入载体与目的载体，并且在LR Clonase?酶的催化下，将进入载体中含有的祀基 因取代入目标载体，从而获得含有祀基因的表达载体。
[0154] (1)BP 反应
[0155] BP反应体系：
[0156]
[0157] 将反应在25。(：浴中溫热16小时。
[0158] BP反应祀基因克隆的筛选和鉴定
[0159] a.用化1 BP反应产物转化大肠杆菌D册a的感受态细胞，并在37°C颠倒培养16小时 (在kan抗性培养基中）；
[0160] b.挑取单一克隆，并在37°C在振荡下W20化pm培养(添加50ug/m化an);
[0161] C.提取质粒，并用基因特异性引物（L:ATGGAGGCCGCCAGGTTC和R: TTACATGGGTCCACGCTC)扩增W获得扩增产物；
[0162] d.对扩增产物测序，并与原始序列进行比较。其扩增产物具有SEQ ID NO: 1的序列 的质粒是进入载体BP质粒。
[0163] (2)LR 反应
[0164] 使用获得的玉米ZmSPLl基因的进入载体进行LR反应，其中反应体系如下：
[01 化]
[0166]
[0167] 在25°C浴中溫热16小时。
[0168] LR反应祀基因克隆的筛选和鉴定
[0169] (1)用化1 LR反应产物转化大肠杆菌D册a的感受态细胞，并在37°C颠倒培养12-16 小时(在壮观霉素抗性培养基中）；
[0170] (2)挑取单一克隆，并在37°C在振荡下W180-20化pm培养（添加50ug/ml壮观霉 素)；
[0171] ( 3 )提取质粒，并用基因特异性引物（L : ATGGAGGCCGCCAGGTTC和R : TTACATGGGTCCACGCTC)扩增W获得扩增产物。
[0172] 对扩增产物测序。具有SEQ ID NO: 1的序列的质粒是通过用Gateway?技术将SEQ ID NO: 1的序列插入地2GW7质粒而获得的过表达载体。该质粒被指定为地2GW7-ZmSPLl。
[0173] 2. ZmSPLl转基因拟南芥的制备
[0174] (1)农杆菌感受态细胞的制备
[01巧]a .将根癌农杆菌GV3101 的单一菌落化ctopic overexpression of wheat TaSrg6gene confers water stress tolerance in Arabidopsis.Tong SM,Ni ZF,Peng HR, Dong GQ, Sun QX.2007,172(6): 1079-1086,可公开地得自中国农业大学）挑取至3ml Y邸液体培养基(含有相应的抗生素，lOOiig/ml Rif)中，并在28°C振荡培养过夜；
[0176] b.将50化1过夜培养的细菌液体接种于50ml Y邸液体培养基(含有相应的抗生素） 中，并在28 °C振荡培养，直至达到0.5的OD600 ;
[0177] C. W5000巧m离屯、5分钟；
[017引 d.添加10ml 0.15mmol/L NaClW悬浮农杆菌细胞，并W5000巧m离屯、5分钟；
[0179] e.将细胞悬浮于1ml预冷的20mmol/L化Cl2中，并储存于冰浴中，直至在24小时内 使用，或细分成20化1/管;在液氮中快速冷冻1分钟，并在-80°C下储存，直至使用。
[0180] (2)阳性农杆菌克隆的制备和鉴定。
[0181 ] a.将20化1感受态细胞在冰上缓慢解冻30分钟；
[0182] b.添加化g构建的质粒地2GW7-ZmSPLl，并置于冰上30分钟；
[01削 C.在液氮中快速冷冻2分钟，在37 °C水浴中放置5分钟，并在冰上放置2分钟；
[0184] d.然后加入1ml Y邸培养基，并在28°C缓慢振荡培养4小时；
[01化]e. W4000巧m离屯、5分钟，并弃去上清液90化1;
[01化]f.将剩余液体铺于含有50iig/ml壮观霉素和10化g/ml Rif的Y邸板，并在28°C培养 2天；
[0187] g.挑取在该板上生长的单一菌落，Wl:50的比率接种于Y邸液体培养基(含有50y g/ml壮观霉素和10化g/ml Rif)中，并在28°C振荡培养过夜。
[0188] 从重组细菌提取质粒，并用基因特异性引物化：ATGGAGGCCGCCAGGTTC和R: TTACATGGGTCCACGCTC)扩增W获得3000bp产物，其为阳性重组细菌，且其被指定为GV3101 / pB2GW7-ZmSPLl。
[0189] (3)拟南芥的转化
[0190] a.将Columbia野生型拟南芥（col-0,Yao Y，Ni Z,Du J,Han Z,化en Y,Zhang Q, Sun Q.Ectopic overexpression of wheat adenosine diphosphate-ribosylation factor,TaARF, increases growth rate in Arabidopsis.J Integr Plant Biol.2009,51 (1):35-44,可公开地得自中国农业大学）（W下称为野生型拟南芥)在4°C春化处理72小时， 播种于MS培养基中并在20°C在60%湿度的培养室中W16小时光照/8小时黑暗光周期进行 培养;生长至具有两个真叶之后，将幼苗移植于含有相等比率的营养±和赔石的混合物的 种植盆中。
[0191] b.开花之后，切割树枝的尖端W促进侧枝的发育。修剪之后6天内，准备植物用于 农杆菌转化；
[0192] C.将农杆菌GV3101/pB2GW7-ZmSPLl接种于含有5ml YEB+100μg/ml SP+100μg/ml 利福平的培养基中，振荡培养过夜，并在第二天转移至500ml Y邸液体培养基中，用于在28 °C培养，直至0〇6日日约为0.8;
[0193] d.通过离屯、收集菌体，并将农杆菌细菌悬浮于转化缓冲液中。修剪之后4天，将植 物颠倒浸溃于转化缓冲液中；
[0194] e.取种植板，并用填充空气的黑色塑料袋包裹，水平放置;在2(TC在黑暗中培养24 小时之后，移除塑料袋，并使种植盆直立。在正常光照和溫度条件下培养植物，直至播种。收 获ZmSPLl转基因拟南芥的成熟To种子。
[01M] (4)筛选转基因拟南芥的阳性幼苗
[0196] 制备MS板，无菌处理ZmSPLl转基因拟南芥的To种子，然后用无菌水洗涂6次；将种 子铺于选择性MS培养基（125iil/L Basta)上，在4°C春化处理3天之后，转移至20°C和16小时 光照/8小时黑暗光周期的溫室，并在7天培养之后选择阳性植物。阳性植物具有W下特征： 深绿色的健康真叶和伸展入培养基中的根。
[0197] 从通过上述初始筛选获得的阳性植物提取基因组DNA，用基因特异性引物化： ATGGAGGCCGCCAGGTTC和 R:TTACATGGGTCCACGCTC)扩增 W 获得 3000bp 产物，运意味着其为 ZmSPLl转基因拟南芥的阳性To植物。总共获得90个ZmSPLl转基因拟南芥的阳性To植物。
[0198] 将上述ZmSPLl转基因拟南芥的阳性To植物转移至正常培养基，10天之后移植入± 壤，并在50天生长之后收获Ti种子。W相同方法培养和筛选Ti种子，移植并W3:l的分离比从 各植物收获T2种子。每种植物株系培养10个植物并W相同的方式筛选W获得未分离的纯株 系，由此获得ZmSPLl转基因拟南芥T2植物。
[0199] 类似地，将空载体PB2GW7转化入野生型拟南芥，W获得空载体转化的拟南芥To植 物。提取RNA，通过逆转录制备cDNA，并用基因特异性引物化:ATGGAGGCCGCCAGGTTC和R: TTACATGGGTCCACGCTC)扩增。没有获得祀片段，运意味着其为阳性空载体转化的拟南芥。类 似地，收获和播种之后，最终获得空载体转化的拟南芥T2植物。
[0200] 3. ZmSPLl转基因拟南芥的表型研究
[0201] 1)种子研究
[0202] (1)对授粉后的拟南芥种子的形态学的显微观察。
[0203] a.将授粉后7天的ZmSPLl转基因拟南芥(ZmSPLl-OX)的T2种子置于50%FAA固定液 中，直至使用。
[0204] b.从FAA固定液移取种子，并连续置于70 %、85 %和95 %乙醇中，各自持续30分钟， 然后转移至100%乙醇中脱水3次，每次1小时，并且最后一次过夜。
[0205] C.第二天，将所述种子置于100%乙醇和冬青油的混合物（1:1)中1小时，然后转移 至冬青油用于澄清3次，每次1小时，并且最后一次超过1天。
[0206] d.甲苯胺蓝染色:在甲苯胺蓝工作液中染色3分钟，在95%乙醇中分离颜色1分钟， 两次，在100%乙醇中脱水并在冬青油中澄清。
[0207] e.用加拿大树脂固定，并且干燥之后，在Nikon Ti微分干设相差显微镜上观察浆 片的形状和轮廓W及中央细胞结构并拍照。
[0208] 野生型拟南芥(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物用作对照，每种植物株系评估30 个种子，该实验重复=次，并将结果平均化。
[0209] 结果显示于图4a中。可W看到，与野生型拟南芥种子相比，ZmS化1转基因拟南芥 (ZmSPLl-〇X)的T2种子更大。运主要体现于粒长(在显微镜的11.5的放大率下）。
[0210] 统计学定量粒长和粒宽。根据图4b中所示的结果，ZmS化1转基因拟南芥的T2种子 (ZmSPLl-〇X)和野生型拟南芥种子(WT)分别具有0.809和0.645mm的粒长，和0.4103和 0.352mm的粒宽。
[0211] 野生型拟南芥(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物之间没有显著差异。
[0212] (2)种子发育和种子重量
[0213] 已经发现成熟的拟南芥种子主要由胚组成，并且随着种子发育，胚乳逐渐降解至 消失。因此，在从ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmSPLl-OX)、空载体转化的拟南芥T2植物和野 生型拟南芥植物(WT)授粉之后5-9天，本发明人进一步通过TB0染色（用上述步骤(1)中相同 的程序)动态观察种子的胚。
[0214] 授粉后胚的形态观察结果显示于图5a中。在授粉后第5天，当野生型种子在早屯、阶 段时，转基因种子仍在球状阶段;并且在授粉后第9天，野生型种子几乎完全填充于种皮内， 但转基因种子中的胚仍具有很大的发育空间。运些结果表明，随着ZmSPLl基因的过表达，拟 南芥种子的发育显示延迟，因此种子中存在更大的储存容量。
[0215] 图化显示产量的统计结果(每种植物株系3个植物），并将实验重复3次。将结果进 行平均化。
[0216] 结果显示：
[0217] 对于ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，每个植 物的总产量分别为0.1256g和0.0669g;
[0218] 对于ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，每芙的 种子数分别为68.67和55.5;
[0219] 对于ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，每个植 物的芙数分别为209.857和167.3;
[0220] 对于ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，每芙的 粒重分别为0. 〇〇1467g和0.001125邑。
[0221] 野生型拟南芥植物(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物之间没有显著差异。
[02剖所W，可W看到，ZmSPLl的过表达可增加重量。
[02剖 2)根系的发育
[0224] 对来自ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmSPLl-〇X)的两个植物株系ZmSPLl-OX-1和 ZmSPLl-OX-2、空载体转化的拟南芥T2植物和野生型拟南芥植物(WT)的种子进行发芽测试 (在20°C溫度和16小时光照/8小时黑暗的光周期）。
[0225] 表型结果显示于图6a，其中图中的S行代表在播种后第2天、第7天和第14天获得 的结果。可W看到，ZmSPLl-OX-巧日ZmSPLl-OX-2种子比野生型拟南芥种子发芽更快，比野生 型拟南芥具有全根系的更高生长速率。
[0226] 统计学定量主根长度、侧根数和根鲜重。每种植物株系3个植物，并重复实验3次。 将结果进行平均化。
[0227] 结果显示于图化中（第14天的主根长度未显示）。
[0228] 在第 1-9 天，ZmS 化 1-0X-1 具有分别 0.168125、0.675833、0.950833、1.258889、 1.53125、1.705、2.041667、2.329167 和 2.9cm 的主根长度；
[0229] 在第 1-9 天，ZmS 化 1-0X-2 具有分别0.145、0.68、1.01、1.16667、1.525、1.6667、 2.125、2.65和3.2畑1的主根长度；
[0230] 在第 1-9 天，WT 具有分别0、0.305、0.620833、0.866667、1.016667、1.155556、 1.544、1.7和1.85cm的主根长度；
[0231] 在第14天，ZmSPLl-OX-1和WT具有分别4.15和3.09cm的主根长度；
[0232] 在第14天，ZmSPLl-OX-1和WT具有分别0.0477和0.0415g的总根鲜重；
[0233] 在第14天，21115?1^-0乂-巧抓1'具有分别15.33和12.17的侧根数。
[0234] 野生型拟南芥植物(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物之间没有显著差异。
[02对所W，可W看到，ZmSPLl的过表达增加主根长度、侧根数和根鲜重。
[0236] 3)叶
[0237] 播种ZmSPLl转基因拟南芥(ZmSPLl-OX)的T2种子、空载体转化的拟南芥的T2种子和 野生型拟南芥种子(WT)(在20°C的溫度和16小时光照/8小时黑暗的光周期）。
[0238] 同时，根据W下具体程序在第25天显微镜观察叶细胞：
[0239] a)在水中煮沸拟南芥的鲜叶W杀死细胞，然后倒出具有溶解颜料的水；
[0240] b)将材料转入95%乙醇，并煮沸，直至组织完全稱色(约1小时）；
[0241] C)将仍然溫热、稱色的材料置于预热至96°C的85%乳酸中，并在8分钟之后获得透 明的组织材料；
[0242] d)在室溫将透明材料转入85%乳酸中，并储存，直至用于固定；
[0243] e)固定和观察：取透明处理的拟南芥叶并用吸水纸吸干过量的乳酸，然后用乙二 醇固定，并在显微镜下观察。
[0244] 在第25天，研究地上植物部分的表型。结果显示于图7a中，其中第一、第二和第S 行代表在第25天的野生型和ZmSPLl转基因拟南芥的地上部分、莲座叶和叶细胞。可W看到， ZmSPLl过表达的植物的地上部分比野生型植物的地上部分更大。
[0245] 统计学定量第25天的莲座叶的叶面积、叶数和叶细胞数。叶面积的测量可W通过 本领域中已知的任何常规方法(如网格点法、方格纸法和纸称重法)来进行，或者叶面积可 W用叶面积仪诸如来自LI-C0R的LAI-3100面积仪来测量。一些叶面积预测模型也可用于测 量叶面积（参见，例如Sezer I,Oner F,Mut Z.,Non-destructive leaf area measurement in maize(Zea mays L.),J Environ Biol.2009 Sep;30(5Suppl):785-90)。叶数目可通过 直接计数来确定，或者可W根据单面叶脉数来估计。叶细胞数可W通过本领域中众所周知 的流式细胞术来测量。每种植物株系测量3个植物，并重复实验3次。将结果进行平均化。
[0246] 结果显示于图7b中。
[0247] 对于ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，莲座叶 的叶面积分别为5.338和2.558cm2;
[0248] 对于ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，莲座叶 的细胞数/每面积单位分别为8.98和9.23;
[0249] 对于ZmSPLl转基因拟南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，莲座叶 的叶细胞数分别为47.94xl03和23.61xl03。
[0250] 野生型拟南芥植物(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物之间没有显著差异。
[0251] 通过进一步研究，发现地上部分的扩大主要由于莲座叶面积的增加引起。通过叶 表皮细胞的显微镜观察，发现该叶主要由于细胞数增加、而不是细胞体积增加而扩大。
[0252] 实施例3.玉米ZmSPL2基因的获取
[0253] 1.玉米ZmSPL2基因的发现
[0254] (1)发现玉米ZmSPL2基因
[0巧日]通过对玉米Zong31xP138杂交胚的S甜文库分析，本发明人发现杂交种和亲本植物 之间的玉米ZmSPL2的表达存在差异，运提示ZmSPL2在胚胎发育中发挥作用。ZmSPL2恰巧与 拟南芥序列中的最长类的AtSPL具有高相似性。采取W下步骤:针对拟南芥AtSPL蛋白序列 用tBLASTn捜索玉米基因组网站中的玉米DNA数据库化ttp : //ww.maizesequence . org, http://www.maizeg化.o巧），并使用获得的基因组序列W便用BLASTx捜索玉米EST数据库， 并推导玉米基因组序列的外显子区域。通过人工剪接运些序列而获得最长的cDNA序列（SEQ ID N0:3)〇
[0256] (2)基因的结构分析和染色体定位
[0257] 为了确定推定基因编码的蛋白的大小W及起始密码子和终止密码子的位置，使用 来自 NCBI 的0RF Finder软件化ttp: //ww. ncbi . nlm. n;Lh. gov/gorf/go;rf. html)对玉米 ZmSPL2基因的推定cDNA序列进行开放阅读框(ORF)分析，并用BLASTx确定正确的阅读框。基 于获得的基因0RF序列和相应的基因组序列，使用基因结构分析软件Gene Structure Display Se;rveHht1:p: //gsds . cbi .pku. edu. cn/)对获得的玉米ZmSPL2基因进行结构分 析。
[0258] 用玉米B73基因组图谱，将获得的序列定位于染色体上，并捜索基因组中的上游序 列。具体地，采取W下步骤：1)进行基因组化AST捜索；2)经由"基因组视图"观察基因组结 构;和3)点击相应的染色体区域W便通过相应区域的上游和下游基因定位基因的位置。
[0259] (3)多重序列比对和系统发生分析
[0260] 为了分析玉米ZmSPL2基因和拟南芥中的同源基因序列之间的差异，本发明人首先 使用具有软件的默认参数的ClusterW(Thompson，等人，1994)构建S化序列的多重序列比对 构型。然后，采取W下步骤：将多重序列比对结果引入6日11日0〇(3(111：19://冊￥.(31'13.(3〇111- Ketchup/genedoc. shtml)，并且基于蛋白的多重序列比对结果，使用MEGA4. UKumar,等人， 2004)进行系统发生树校正，W经由邻接法生成拟南芥和玉米的族成员的无根系统发 生树。
[0%1] 2.获得玉米ZmSPL2基因
[0262]从玉米自交系zong31 的根材料（Yang X,Yan J,Shah T.Warburton ML,Li Q,Li L,Gao Y,Chai Y,Fu Z,Zhou Y,Xu S,Bai G,Meng Y,Zheng Y,Li J.Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection.Theor Appl Genet. 2010; 121(3) :417-31,可公开 得自中国农业大学），用化izol试剂总RNA提取试剂盒化P405-01，TIANGEN)提取RNA:并且采 取W下步骤:在含有研磨样品的各管中添加 ImL提取溶液并均匀混合;在室溫下（25°C)5分 钟之后，添加20化1氯仿，均匀混合，并离屯、(4°C，12000巧m) 15分钟;将等体积的异丙醇加入 上清液并在室溫下放置沉淀30分钟；离屯、(4°C，12000巧m) 10分钟之后，弃去上清液，用75% 乙醇洗涂沉淀，然后溶解于lOOyl DEPC处理的双蒸水中。用R化无 RNase的DNase(M6101， Promega)纯化粗RNA:将R化反应溶液（lOOmM Tris-肥l，25mM MgS〇4和2.5mM CaCl2，DNAase lOU)加入RNA;在37°C浴中放置30分钟之后，用等体积的苯酪/氯仿提取;将两倍体积的无水 乙醇加入上清液，用于沉淀；离屯、(4°C，12000巧m)10分钟之后，弃去上清液，用75%乙醇洗 涂沉淀，然后溶解于40iil DEPC处理的双蒸水，由此获得总RNA。 惦创用于cDNA合成的总反应体系为20化（含有化g总RNA，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，75mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，50皿日I/L dNTPs，50pmol错定引物 T15: TTTTTTTTTTTTTTT(TAKARA，D510)，20U RNase抑制剂（TAKARA，D2313A)，200U M-MLV逆 转录酶（Pr〇mega，M1701))。在37°C下解育2小时之后获得cDNAJ化cDNA与PCR引物化： ATGCAGAGGGAGGTGGGC; R: TTATATTGTACCGTAATCCAGC)用于 PCR 反应中。
[0264] 根据图8中显示的PCR结果，通过扩增获得单一 PCR产物，其具有特定3000bp条带。 通过测序，用于编码所得PCR产物的基因具有SEQ ID N0:3中所示的核巧酸序列，其中从5' 末端至3'末端具有位置1-3339的核巧酸的编码区。该基因被指定为ZmSPL2,并且由该基因 编码的蛋白被指定为ZmSPL2,其具有如SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列。
[0265] 对特定条带测序（SEQ ID N0:3)并确定其染色体定位，发现其在染色体4上的 4.08Bin区域内。接下来，对ZmSPL2-编码的蛋白的氨基酸序列进行分析，并且结果是在该序 列的N-末端处存在SBP-盒结构域。此外，用MEGA4.1软件中的N-J方法对玉米和拟南芥S化蛋 白进行同源性评估分析。
[0266] 结果显示于图9中，其显示ZmSPL2与拟南芥中编码最长氨基酸序列的一类SPL (AtSPLA，AtS化16)高度相似。
[0%7] 3.通过实时巧光定量PCR测量不同植物位点中的ZmSPL2基因表达
[0268] 在Bio-Rad CI 000循环仪实时PCR系统上进行实时巧光定量PCR测定，并且10化的 反应体系含有化L cDNA、0.化M实时定量引物和扣L SYBR Premix Ex hq^RROAlD)。实时 定量引物具有 W 下序列：S化2-L: CTGCTCTGGCCCTATTTCTG SPL2-R: GCATCGCTCCTCAAGGTCT。 来自不同发育阶段的玉米自交系Zong31的11种组织或器官的cDNA用作模板，即，来自播种 阶段(8天）的植物的根和叶；来自60天生长的植物的茎、节间、巷叶、花丝、不成熟的玉米果 穗和雄穗，W及来自授粉后15天的植物的种皮、胚和胚乳。PCR方案如下:在94°C变性5分钟； 然后在94°C变性10秒，在60°C退火20秒，和在72°C延伸30秒，35个循环;在72°C最终延伸7分 钟。在65°C-98°C绘制烙解曲线。然后，使用具有手动设定巧光阔值的比较阔值方法对实时 定量PCR结果进行定量分析，确定在运种阔值下的特定循环数，Ct值，并且基于Ct值计算各 组织或器官的C值，其中C = 2^a且Act = Ct鹏H-Ct械瞭隹，用用双尾等方差t检验(P<0.05)进 行显著性检验。本实验包括3个生物学重复。
[0269] 玉米 18S rRNA基因用作对照，引物序列是L:ACATGCGCCTAAGGAGAAATAG;R:ACCTCC ATGCTCACTGGTACTTo
[0270] 根据图10中所示的结果，ZmSPL2显示在不同的组织或器官之间的表达水平的显著 变化。ZmSPL2基因在未成熟的玉米果穗和雄穗中具有最高的表达水平，并且在正在发育的 胚、胚乳、种皮、根和花丝中具有非常低的表达水平。
[0271] 实施例4.ZmSPL2基因的使用
[0272] 通过Gateway技术，构建玉米ZmSPL2基因的过表达载体。大肠杆菌菌株是D册a且农 杆菌菌株是GV3101。
[0273] 1.过表达载体的构建
[0274] 通过Gateway技术，根据W下程序构建载体:将gateway BP反应接头并至引物的5' 末端，通过PCR扩增获得具有接头序列的祀基因片段，经由琼脂糖凝胶回收产物，W特定比 率混合回收的产物与载体PD0NR221，并且在BP Clonase?酶的催化下，将祀基因取代入 PD0NR221载体。构建的载体是进入载体。然后，本发明人如下操作特定比率混合构建的 含有祀基因的进入载体与目的载体，并且在LR Clonase?酶的催化下，将进入载体中含有的 祀基因取代入目标载体，从而获得含有祀基因的表达载体。
[0275] (1)BP 反应
[0276] BP反应体系：
[0277]
[027引将反应在25°C浴中溫热16小时。
[0279] BP反应祀基因克隆的筛选和鉴定
[0280] a.用化1 BP反应产物转化大肠杆菌D册a的感受态细胞，并在37°C颠倒培养16小时 (在kan抗性培养基中）；
[0281 ] b.挑取单一克隆，并在37°C在振荡下W200巧m培养(添加50ug/ml Kan);
[0282] c.提取质粒，并用基因特异性引物（L:ATGCAGAGGGAGGTGGGC和R: TTATATTGTACCGTAATCCAGC)扩增 W 获得扩增产物；
[0283] d.对扩增产物测序，并与原始序列进行比较。其扩增产物具有SEQ ID N0:3的序列 的质粒是进入载体BP质粒。
[0284] (2)LR 反应
[0285] 使用获得的玉米ZmSPL2基因的进入载体进行LR反应，其中反应体系如下：
[0286]
[0287] 在25°C浴中溫热16小时。
[0288] LR反应祀基因克隆的筛选和鉴定
[0289] (1)用化1 LR反应产物转化大肠杆菌D册a的感受态细胞，并在37°C颠倒培养12-16 小时(在壮观霉素抗性培养基中）；
[0290] (2)挑取单一克隆，并在37°C在振荡下W180-20化pm培养（添加50ug/ml壮观霉 素)；
[0291] (3)提取质粒，并用基因特异性引物化：416〔4646664661666(：和尺： TTATATTGTACCGTAATCCAGC)扩增 W 获得扩增产物。
[0292] 对扩增产物测序。具有SEQ ID NO: 3的序列的质粒是通过用Gateway?技术将SEQ ID ^:3的序列插入地26￥7质粒而获得的过表达载体。该质粒被指定为地26￥7-21115口1^2。
[0巧3] 2.ZmSPL2转基因拟南芥的制备
[0294] (1)农杆菌感受态细胞的制备
[02巧]a .将根癌农杆菌GV3101 的单一菌落化ctopic overexpression of wheat TaSrg6gene confers water stress tolerance in Arabidopsis.Tong SM,Ni ZF,Peng HR, Dong GQ, Sun QX.2007,172(6): 1079-1086,可公开地得自中国农业大学）挑取至3ml Y邸液体培养基(含有相应的抗生素，lOOiig/ml Rif)中，并在28°C振荡培养过夜；
[0296] b.将50化1过夜培养的细菌液体接种于50ml Y邸液体培养基(含有相应的抗生素） 中，并在28 °C振荡培养，直至达到0.5的OD600 ;
[0297] C. W5000巧m离屯、5分钟；
[0巧引 d.添加10ml 0.15mmol/L NaClW悬浮农杆菌细胞，并W5000巧m离屯、5分钟；
[0299] e.将细胞悬浮于1ml预冷的20mmol/L化Cl2中，并储存于冰浴中，直至在24小时内 使用，或细分成20化1/管;快速冷冻于液氮中，持续1分钟，并在-80°C下储存，直至使用。
[0300] (2)阳性农杆菌克隆的制备和鉴定。
[0301 ] a.将20化1感受态细胞在冰上缓慢解冻30分钟；
[0302] b.添加化g构建的质粒地2GW7-ZmSPL2，并置于冰上30分钟；
[0303] C.在液氮中快速冷冻2分钟，在37 °C水浴中放置5分钟，并在冰上放置2分钟；
[0304] d.然后加入1ml YEB培养基，并在28C缓慢振荡培养4小时；
[03化]e. W4000巧m离屯、5分钟，并弃去上清液90化1;
[0306] f.将剩余液体铺于含有50iig/ml壮观霉素和10化g/ml Rif的Y邸板，并在28°C培养 2天；
[0307] g.挑取在该板上生长的单一菌落，Wl:50的比率接种于Y邸液体培养基(含有50y g/ml壮观霉素和10化g/ml Rif)中，并在28°C振荡培养过夜。
[030引从重组细菌提取质粒，并用基因特异性引物化：ATGCAGAGGGAGGTGGGC和R: TTATATTGTACCGTAATCCAGC)扩增 W获得3000bp产物，其代表被指定为GV3101/pB2GW7- ZmSPL2的阳性重组细菌。
[0309] (3)拟南芥的转化
[0310] a.将Columbia野生型拟南芥（col-0,Yao Y，Ni Z,Du J,Han Z,化en Y,Zhang Q, Sun Q.Ectopic overexpression of wheat adenosine diphosphate-ribosylation factor,TaARF, increases growth rate in Arabidopsis.J Integr Plant Biol.2009,51 (1):35-44,可公开地得自中国农业大学）（W下称为野生型拟南芥)在4°C春化处理72小时， 播种于MS培养基中并在20°C在60%湿度的培养室中W16小时光照/8小时黑暗光周期进行 培养;生长至具有两个真叶之后，将幼苗移植于含有相等比率的营养±和赔石的混合物的 种植盆中。
[0311] b.开花之后，切割树枝的尖端W促进侧枝的发育。修剪之后6天内，准备植物用于 农杆菌转化；
[0312] C.将农杆菌GV3101/pB2GW7-ZmSPL2接种于含有5ml YEB+100μg/ml SP+100μg/ml 利福平的培养基中，振荡培养过夜，并在第二天转移至500ml Y邸液体培养基中，用于在28 °C培养，直至0〇6日日为约0.8;
[0313] d.通过离屯、收集菌体，并将农杆菌细菌悬浮于转化缓冲液中。修剪之后4天，将植 物颠倒浸溃于转化缓冲液中；
[0314] e.取种植板，并用填充空气的黑色塑料袋包裹，水平放置;在2(TC在黑暗中培养24 小时之后，移除塑料袋，并使种植盆直立。在正常光线和溫度条件下培养植物，直至播种。收 获ZmSPL2转基因拟南芥的成熟To种子。
[0315] (4)筛选转基因拟南芥的阳性幼苗
[0316]制备MS板，无菌处理ZmSPL2转基因拟南芥的T刷子，然后用无菌水洗涂6次；将种 子铺于选择性MS培养基（125iil/L Basta)上，在4°C春化处理3天之后，转移至20°C和16小时 光线/8小时黑暗光周期的溫室，并在7天培养之后选择阳性植物。阳性植物具有W下特征： 深绿色的健康真叶和伸展入培养基中的根。
[0317] 从通过上述初始筛选获得的阳性植物提取基因组DNA，用基因特异性引物化： ATGCAGAGGGAGGTGGGC 和 R:TTATATTGTACCGTAATCCAGC)扩增 W 获得 3000bp 产物，运表明其为 ZmSPL2转基因拟南芥的阳性To植物。总共获得100个ZmSPL2转基因拟南芥的阳性To植物。
[0318] 将上述ZmSPL2转基因拟南芥的阳性To植物转移至正常培养基，10天之后移植入± 壤，并在50天生长之后收获Ti种子。W相同方法培养和筛选Ti种子，移植并W3:l的分离比从 各植物收获T2种子。每种植物株系培养10个植物并W相同的方式筛选W获得未分离的纯株 系，由此获得ZmSPL2转基因拟南芥T2植物。
[0319] 使用相同程序，将空载体PB2GW7转化入野生型拟南芥，W获得空载体转化的拟南 芥To植物。提取RNA，通过逆转录制备cDNA，并用基因特异性引物化:ATGCAGAGGGAGGTGGGC和 R: TTATATTGTACCGTAATCCAGC)扩增。没有获得祀片段，运表明其为阳性空载体转化的拟南 芥。类似地，收获和播种之后，最终获得空载体转化的拟南芥T2植物。
[0320] 3.ZmSPL2转基因拟南芥的表型研究
[0321] 1)种子研究
[0322] (1)对授粉后的拟南芥种子的形态学的显微观察。
[0323] a.将授粉后7天的ZmSPL2转基因拟南芥(ZmSPL2-0X)的T2种子置于50%FAA固定液 中，直至使用。
[0324] b.从FAA固定液移取种子，并连续置于70 %、85 %和95 %乙醇中，各自持续30分钟， 然后转移至100%乙醇中脱水3次，每次1小时，并且最后一次过夜。
[0325] C.第二天，将所述种子置于100%乙醇和冬青油的混合物（1:1)中1小时，然后转移 至冬青油用于澄清3次，每次1小时，并且最后一次超过1天。
[03%] d.甲苯胺蓝染色:在甲苯胺蓝工作液中染色3分钟，在95%乙醇中分离颜色1分钟， 两次，在100%乙醇中脱水并在冬青油中澄清。
[0327] e.最终，用加拿大树脂固定，并且干燥之后，在Nikon Ti微分干设相差显微镜上观 察浆片的形状和轮廓W及中央细胞结构并拍照。
[0328] 野生型拟南芥(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物用作对照，每种植物株系评估30 个种子，该实验重复=次，并将结果取平均值。
[0329] 结果显示于图11a中。可W看到，与野生型拟南芥种子相比，ZmSPL2转基因拟南芥 (ZmSPL2-0X)的T2种子更大。运主要体现于粒长(在显微镜的11.5的放大率下）。
[0330] 统计学定量粒长和粒宽。根据图11b中所示的结果，ZmSPL2转基因拟南芥的T2种子 (ZmSPL2-0X)和野生型拟南芥种子（WT)分别具有0.86和0.645mm的粒长，和0.4211和 0.352mm的粒宽。
[0331] 野生型拟南芥(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物之间没有显著差异。
[0332] (2)种子发育和种子重量
[0333] 已经发现成熟的拟南芥种子主要由胚组成，并且随着种子发育，胚乳逐渐降解至 消失。因此，在从ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmSPL2-0X)、空载体转化的拟南芥T2植物和野 生型拟南芥植物(WT)授粉之后5-9天，进一步通过TB0染色（用上述步骤（1)中相同的程序） 动态观察种子的胚。
[0334] 授粉后胚的形态观察结果显示于图12a中。在授粉后第5天，当野生型种子在早屯、 阶段时，转基因种子仍在球状阶段;并且在授粉后第9天，野生型种子几乎完全填充于种皮 内，但转基因种子中的胚具有很大的发育空间。运些结果表明，随着ZmSPL2基因的过表达， 拟南芥种子的发育显示延迟，因此种子中存在更大的储存容量。
[0335] 图12b显示产量的统计结果(每种植物株系3个植物），并将实验重复3次。将结果进 行平均化。
[0336] 从该结果可见：
[0337] 对于ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，每个植 物的总产量分别为0.144：3g和0.0669g;
[0338] 对于ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，每芙的 种子数分别为68和55.5;
[0339] 对于ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，每个植 物的芙数分别为225和167.3;
[0340] 对于ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，每芙的 粒重分别为0.0017g和0.001125g。
[0%1]野生型拟南芥植物(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物之间没有显著差异。
[0342] 所W，可W看到，ZmSPL2的过表达可增加重量。
[0343] 2)根系的发育
[0344] 对来自ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmSPL2-0X)的两个植物株系ZmSPL2-0X-l和 ZmSPL2-0X-2、空载体转化的拟南芥T2植物和野生型拟南芥植物(WT)的种子进行发芽测试 (在20°C溫度和16小时光照/8小时黑暗的光周期）。
[0345] 表型结果显示于图13曰，其中图中的=行代表在播种后第2天、第7天和第14天获得 的结果。可W看到，ZmSPL2-0X-巧日ZmSPL2-0X-2种子比野生型拟南芥种子发芽更快，比野生 型拟南芥具有全根系的更高生长速率。
[0346] 统计学定量主根长度、侧根数和根鲜重。每种植物株系3个植物，并重复实验3次。 将结果进行平均化。
[0347] 结果显示于图13b中（第14天的主根长度未显示）。
[cm 引 在第 1-9 天，ZmS 化 2-0X-1 具有分别0.176667、0.727917、1.005208、1.28125、 1.597917、1.77125、2.095833、2.2125 和 2.266667 的主根长度；
[0349]在第 1-9 天，ZmS 化 2-0X-2 具有分别0.19、0.716667、1.125、1.3125、1.625、1.85、 2.06667、2.23333和2.4cm的主根长度；
[0；350]在第 1-9 天，WT 具有分别0、0.305、0.620833、0.866667、1.016667、1.155556、 1.544、1.7和1.85cm的主根长度； 惦51 ] 在第14天，ZmSPL2-0X-l和WT具有分别4.88和3.09cm的主根长度；
[O%2] 在第14天，ZmSPL2-0X-l和WT具有分别0.051和0.0415g的总根鲜重；
[0巧3] 在第14天，ZmSPL2-0X-l和WT具有分别16.4和12.17的侧根数。
[0354] 野生型拟南芥植物(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物之间没有显著差异。
[0355] 所W，可W看到，ZmSPL2的过表达增加主根长度、侧根数和根鲜重。
[0；356] 3)叶
[0357] 播种ZmSPL2转基因拟南芥(ZmSPL2-0X)的T2种子、空载体转化的拟南芥的T2种子和 野生型拟南芥种子(WT)(在20°C的溫度和16小时光照/8小时黑暗的光周期）。
[0358] 同时，根据W下具体程序在第25天显微镜观察叶细胞：
[0359] a)在水中煮沸拟南芥的鲜叶W杀死细胞，然后倒出具有溶解颜料的水；
[0360] b)将材料转入95%乙醇，并煮沸，直至组织完全稱色(约1小时）；
[0361] C)将仍然溫热、稱色的材料置于预热至96°C的85%乳酸中，并在8分钟之后获得透 明的组织材料；
[0362] d)在室溫将透明材料转入85%乳酸中，并储存，直至用于固定；
[0363] e)固定和观察：取透明处理的拟南芥叶并用吸水纸吸干过量的乳酸，然后用乙二 醇固定，并在显微镜下观察。
[0364] 在第25天，研究地上植物部分的表型。结果显示于图14a中，其中第一、第二和第= 行代表在第25天的野生型和ZmSPL2转基因拟南芥的地上部分、莲座叶和叶细胞。可W看到， ZmSPL2过表达的植物的地上部分比野生型植物的地上部分更大。
[0365] 统计学定量第25天的莲座叶的叶面积、叶数和叶细胞数。叶面积的测量可W通过 本领域中已知的任何常规方法(如网格点法、方格纸法和纸称重法)来进行，或者叶面积可 W用叶面积仪诸如来自LI-C0R的LAI-3100面积仪来测量。一些叶面积预测模型也可用于测 量叶面积（参见，例如Sezer I,Oner F,Mut Z.,Non-destructive leaf area measurement in maize(Zea mays L.),J Elnviron Biol.2009Sep;30(5Suppl):785-90)。叶数目可通过 直接计数来确定，或者可W根据单面叶脉数来估计。叶细胞数可W通过本领域中众所周知 的流式细胞术来测量。每种植物株系测量3个植物，并重复实验3次。将结果进行平均化。
[0366] 结果显示于图14b中。
[0367] 对于ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，莲座叶 的叶面积分别为5.427和2.558cm2;
[0368] 对于ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，莲座叶 的细胞数/每面积单位分别为9.48和9.23;
[0369] 对于ZmSPL2转基因拟南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型拟南芥植物(WT)，莲座叶 的叶细胞数分别为51.45xl03和23.61xl03。
[0370] 野生型拟南芥植物(WT)和空载体转化的拟南芥T2植物之间没有显著差异。
[0371] 通过进一步研究，发现地上部分的扩大主要呈现为莲座叶面积的增加。从叶表皮 细胞的显微镜观察，表明该叶主要由于细胞数增加、而不是细胞体积增加而扩大。
[0372] 实施例S.ZmSPLl和ZmSPL2过表达的水稻的生物学功能的鉴定
[0373] 为了研究ZmS化基因的生物学功能，构建ZmSPLl和ZmSPL2基因的过表达载体，并经 由农杆菌转化法转化水稻Kitaake，W获得14个ZmSPLl过表达的植物和10个ZmSPL2过表达 的植物。
[0374] 首先，分析转基因和对照水稻的粒径。结果显示，与对照相比，ZmS化1和ZmSPL2过 表达的植物具有更大的巧粒。根据粒长和粒宽的统计学结果，转基因水稻具有较大的粒长， 但粒宽没有显著变化。具体地，转基因植物株系ZmSPL 1-0X-1、ZmSPL 1-0X-5、ZmSPL 1-0X-18、 ZmSPL2-0X-8和ZmSPL2-0X-12与对照相比具有显著增加的粒径，具有分别7.71mm、7.36mm、 7.75mm、7.72mm和7.47mm的平均粒长，并且当与对照的7.21mm的平均粒长相比时，分别增加 6.93%、2.08%、7.49%、7.07%和3.61 % (参见图 15和 16)。
[0375] 还分析转基因和对照水稻的1000-粒重量。结果表明，大多数ZmSPLl和ZmSPL2过表 达的植物具有增加的1000-粒重量，其中显著增加的植物株系ZmSPLl-0X-6、ZmSPLl-0X-15、 ZmSPLl-0X-l、ZmSPL2-0X-6、ZmSPL2-0X-8 和 ZmSPL2-0X-7 分别具有 27.42±1.10g、26.16± 1.50邑、26.00±3.30邑、27.67±1.28邑、25.32±1.00邑和25.09±2.19邑的1000-粒重量，与对 照相比分别增加 21.49 %、15.91 %、15.20 %、22.60 %、12.18% 和11.17 % (具有 22.57 ± 1.02g的1000-粒重量）（参见图17)。
[0376] 实施例6. ZmSPLl过表达的玉米的生物学功能的鉴定
[0377] 为了研究ZmSPLl基因的生物学功能，构建ZmSPLl基因的过表达载体，并且通过用 农杆菌LBA4404感染玉米枝芽而转化玉米自交系Zhen58W获得转基因植物，并通过PCR鉴定 26个阳性植物株系。图18显示一些阳性植物的PCR鉴定。
[0378] 当与Zhen58相比时，发现大部分ZmSPLl过表达的植物具有增加100-粒重量。统计 学结果表明，显著增加的植物株系 ZmSPLl-0X-2、ZmSPLl-0X-21、ZmSPLl-0X-25、ZmSPLl-0X- l 和 ZmSPLl-OX-15 分别具有 24.6±1.67邑、24.0±1.86邑、24.0±2.09邑、23.8±1.25邑和23.5 ±0.14g的 100-粒重量，与对照Zhen58相比分别增加22.39%、19.40%、19.40%、18.41 %和 16.92% (具有20.1 ±1.87g的100-粒重量）（参见图19)。运表明，ZmSPLl可W增加玉米的粒 径和重量。
[0379] 实施例7. ZmSPLl-OX玉米的田间实验的结果
[0380] 为了进一步研究ZmSPLl基因的生物学功能，我们进行ZmSPLl过表达的玉米的田间 实验。10个具有明显表型的转基因 T3株系和对照Zhen58用于实验中，即ZmSPLl-OX-2-lO、 ZmSPL1-0X-10-1、ZmSPL1-0X-21-10、ZmSPL1-0X-26-6、ZmSPLl-0X-21-11、ZmSPL1-0X-25-3、 ZmSPLl-OX-1-6、ZmSPLl-OX-15-8、ZmSPLl-OX-16-7、ZmSPLl-OX-22-3和Zhen58。它们中所有 都在北京化angzhuang实验站生长，一块田每排5行，一行15株植物。使用自然授粉。并且研 究后代的穗部和巧粒性状。
[0381] 在穗部性状方面，本研究发现，与对照Zhen58相比，ZmSPLl过表达的玉米株系表现 出增加的穗长和穗宽（图20和21)，其中Zhen58具有16.35±0.95cm的穗长，而株系ZmSPLl- 0X-25-3显示18.04±0.50cm的更加不同的穗长，比对照增加10.34% (图22);并且Zhen58具 有4.03 ±0.14cm的穗宽，而株系ZmSPLl-OX-25-3显示4.62±0.27cm的更加不同的穗宽，比 对照增加14.64% (图23)。然而，转基因株系和对照之间的粒行数目和巧粒数目没有显著差 异（图24和25)。
[0382] 在对于转基因玉米株系的粒径的进一步研究中，我们发现，与对照Zhen58相比， ZmSPLl过表达的玉米株系具有较大巧粒和增加的100-粒重量（图26)。对照Zhen58具有 31.30±1.94邑的100-粒重，而株系21115口11-0乂-22-3、21115化1-0乂-15-8、21115口1^1-0乂-25-3、 ZmS 化 1-0X-1-6 和 ZmSPLl-OX-21-ll 分别具有：M.12±2.16g、34.32±1.91g、34.42±2.13g、 36.27 ± 2.30g和36.48 ± 2.48g的更高的100-粒重量，分别比对照增加9.01 %、9.65 %、 9.97%、15.88%和 16.49% (图27)。
[0383] 实施例8. ZmSPLl-OX水稻的田间实验的结果
[0384] 我们还进行ZmS化过表达水稻的田间实验。实验中使用具有明显表型的6种ZmSPLl T2株系和4种ZmSPL2 T2株系 W及对照Kitaake，即21115?1^-(^-1、21115?1^-(^-5、21115?1^-0乂- 6、ZmSPLl-0X-15、ZmSPL1-0X-17、ZmSPL1-0X-18、ZmSPL2-0X-6、ZmSPL2-0X-7、ZmSPL2-0X-8、 ZmSPL2-0X-l巧日对照。它们中所有都在北京化angzhuang实验站生长，一块田每排2行，一行 11株植物。研究后代的巧粒性状。
[0385] 与对照相比，所述转基因株系具有增加的粒长，但粒宽变化是不显著的（图28和 29)。对照具有0.67 ± 0.04cm的平均粒长，而ZmSPLl-0X和ZmSPL2-0X分别具有0.71 ± 0.04cm 和0.72 ±0.04cm的平均粒长，比对照增加5.97%和7.46% (图30和31)。
[0386] 与对照比较各转基因株系的粒径，结果显示，转基因株系ZmSPLl-0X-17、ZmS化1- 0X-18、ZmS化2-0X-7和ZmSPL2-0X-ll具有更大的粒径，并且它们的粒长分别为0.73± 0.06畑1、0.73±0.04畑1、0.73±0.04畑1和0. 73±0.03畑1，所有都比对照增力日13.43%(图 3巧口 33)。然而，它们的粒宽与对照没有显著不同（图32和34)。
[0387] 除去巧粒外壳之后，我们比较内部巧粒的大小，结果显示，ZmSPLl-〇X和ZmSPL2-0X 两者均具有比对照增加的粒长（图35)，但未显著不同的粒宽（图36和图38)。对照具有0.46 ± 0.03cm的平均粒长，而ZmS化1-0X和ZmS化2-0X分别具有0.52 ± 0.02cm和0.51 ± 0.03cm的 平均粒长，比对照分别增加13.04%和10.87% (图37)。
[0388] 我们还分析转基因水稻和对照的1000-粒重量，结果显示，ZmSPLl和ZmSPL2过表达 株系具有增加的 1000-粒重量，其中株系ZmSPLl-0X-6、ZmSPLl-0X-l、ZmSPLl-0X-18、 ZmSPL2-0X-8、ZmSPL2-0X-7和ZmSPL2-0X-6分别具有26. ：34 ± 1.12g、27.29 ± 0.68g、28.13 ± 0.88g、26.10 ±0.33g、26.50 ±0.41g 和 27.85 ±0.34g 的 1000-粒重量，比对照分别增加 10.62%、14.62%、18.14%、9.62% %、11.30%和 16.97% (具有 23.81 ±0.17g 的1000-粒重 量）（图39)。
【主权项】
1. 一种分离的核酸分子，其包含定位以提供多核苷酸的表达的在植物细胞中有功能的 启动子，所述多核苷酸具有以下核苷酸序列： (1) SEQ ID N0:1或3中所示的序列，或其互补序列； (2) 在严格杂交条件下与SEQ ID NO: 1或3中所示的序列杂交的序列； (3) 与SEQ ID N0:1 或3中所示的序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%序列同一性的序列，其编码具有控制植物器 官大小的功能的蛋白；或 (4) 由通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸而衍生化SEQ ID NO: 1或3中所示 的序列获得的序列。2. -种分离的核酸分子，其包含定位以提供多核苷酸的表达的在植物细胞中有功能的 启动子，所述多核苷酸具有以下核苷酸序列： (1) 序列，其编码SEQ ID NO:2或4中所示的多肽； (2) 序列，其编码与SEQ ID N0:2或4中所示的序列具有至少85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%序列同一性的多肽;或 (3) 序列，其编码由通过缺失、取代、插入或增加一个或多个氨基酸而衍生化SEQ ID N0:2或4中所示的序列获得的多肽。3. -种重组DNA构建体，其包含权利要求1或权利要求2的核酸分子。4. 一种分离的多肽，其选自： (1) 具有SEQ ID N0:2或4中所示的氨基酸序列的多肽;和 (2) 衍生自（1)的多肽，其包含SEQ ID N0:2或4中所示的氨基酸序列中取代、缺失或添 加一个或多个氨基酸残基，并且表现出控制植物器官大小的功能。5. -种植物细胞，其包含权利要求1或权利要求2的核酸分子。6. -种转化植物，其包含权利要求1或权利要求2的核酸分子。7. 根据权利要求6的转化植物，其中所述植物与未转化植物或野生型植物相比具有改 变的性状，其中所述改变的性状选自增加的种子大小、增加的种子数目、增加的种子重量、 增加的籽粒大小、增加的籽粒数目、增加的籽粒重量、增加的叶片大小、增加的叶片面积、增 加的叶片数目、增加的叶片细胞数目、增加的主根长、增加的侧根数、增加的根鲜重和增加 的产量。8. 根据权利要求7所述的转化植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选作 物植物。9. 根据权利要求7所述的转化植物，其中所述植物选自玉米（Zea mays)、芸苔属 (Brassica)物种（例如，卷心菜型油菜(B.napus)、宪菁(B.rapa)、芥菜(Β· juncea))、苜蓿 (Medicago sativa)、水稻（Oryza sativa)、黑麦（Secale cereale)、高粱（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennisetum glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龙爪稷（Eleusine coracana))、向日葵（Helianthus annuus)、红花（Carthamus tinctorius)、小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 烟草（Nicotiana tabacum)、马铃薯（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘薯（Ipomoea batatus)、木薯（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp·)、挪子（Cocos nucifera)、菠萝 (Ananas comosus)、柑橘属果树（Citrus spp ·)、可可（Theobroma cacao)、荼（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp·)、鳄梨（Persea americana)、无花果（Ficus casica)、番石植 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、撤榄（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树 (Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘庶（Saccharum spp·)、燕麦、草莓、蓝 莓和大麦。10. 根据权利要求7所述的转化植物，其中所述植物是拟南芥、水稻或玉米。11. 一种产生具有改变的性状的转化植物的方法，其中所述方法包括用权利要求3的重 组DNA构建体转化植物且获得转化植物，与未转化植物或野生型植物相比，所述转化植物显 示选自以下的改变的性状:增加的种子大小、增加的种子数目、增加的种子重量、增加的籽 粒大小、增加的籽粒数目、增加的籽粒重量、增加的叶片大小、增加的叶片面积、增加的叶片 数目、增加的叶片细胞数目、增加的主根长、增加的侧根数、增加的根鲜重和增加的产量。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选作物 植物。13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述植物选自玉米（Zea mays)、芸苔属 (Brassica)物种（例如，卷心菜型油菜(B.napus)、完菁(B.rapa)、芥菜(B. juncea))、苜蓿 (Medicago sativa)、水稻（Oryza sativa)、黑麦（Secale cereale)、高粱（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennise turn glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龙爪稷（Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花（Carthamus tinctorius)、小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘薯（Ipomoea batatus)、木薯（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp·)、挪子（Cocos nucifera)、菠萝 (Ananas comosus)、柑橘属果树（Citrus spp ·)、可可（Theobroma cacao)、荼（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp·)、鳄梨（Persea americana)、无花果（Ficus casica)、番石植 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、撤榄（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树 (Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘庶（Saccharum spp·)、燕麦、草莓、蓝 莓和大麦。14. 根据权利要求11所述的方法，其中所述植物是拟南芥、水稻或玉米。15. -种用于增加植物的产量的方法，其中所述方法包括用权利要求3的重组DNA构建 体转化植物且获得与未转化植物或野生型植物相比显示增加产量的转化植物。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选作物 植物。17. 根据权利要求15所述的方法，其中所述植物选自玉米（Zea mays)、芸苔属 (Brassica)物种（例如，卷心菜型油菜(B.napus)、完菁(B.rapa)、芥菜(B. juncea))、苜蓿 (Medicago sativa)、水稻（Oryza sativa)、黑麦（Secale cereale)、高粱（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黄米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龙爪稷（Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花（Carthamus tinctorius)、小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum))、甘薯（Ipomoea batatus)、木薯（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp·)、挪子（Cocos nucifera)、菠萝 (Ananas comosus)、柑橘属果树（Citrus spp ·)、可可（Theobroma cacao)、荼（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp·)、鳄梨（Persea americana)、无花果（Ficus casica)、番石植 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、撤榄（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲坚果（Macadamia integrifolia)、扁桃树 (Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘庶（Saccharum spp·)、燕麦、草莓、蓝 莓和大麦。18.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物是拟南芥、水稻或玉米。
【文档编号】A01H5/00GK106062195SQ201380082005
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2013年11月29日
【发明人】倪中福, 孙其信, 王成, 王波, 姚颖垠, 彭惠茹, 张义荣, 胡兆荣
【申请人】中国农业大学