专利名称：恢复造血功能的治疗剂和组合物及其用途的制作方法
背景技术：
许多疾病是由于整个机体造血功能的丧失，或血液中一种或多种血细胞系的不足引起的。机体造血系统中某些血细胞系功能的紊乱也会引起一些疾病，如白血病。更有甚者，一些用于象肿瘤这样的疾病的治疗措施有时也会附带导致机体的供血功能的降低和/或导致机体骨髓机能的下降。这些治疗措施对机体造血系统的毒副作用大大降低了其有效性，并会导致不得不终止这些治疗措施。
所以，急需开发能恢复机体造血功能的治疗方法以作为基础治疗[如放射性治疗和/或化学治疗]的辅助治疗方法。这些辅助治疗方法能够维持、刺激和/或调节患者的血液供给系统以弥补此类基础治疗方案引起的毒副作用。
发明内容
本发明提供治疗剂、药物组合物以及治疗方法，以促进患者(优选人类)的造血功能的恢复。本发明治疗剂的一个实施方式为白细胞介素-12(IL-12)或一种或多种与白细胞介素-12具有基本相同功能的等效物。本发明也提供治疗剂的其它实施方式。这些治疗剂含有至少两种蛋白因子，所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF[AA、AB、BB]、TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。
本发明的药物组合物含有有效治疗剂量的白细胞介素-12，或其它一种或多种与白细胞介素-12具有基本相同功能的等效物，所述白细胞介素-12或等效物包含于一种递送给哺乳动物的适宜药物制剂中。在哺乳动物被离子辐射之前或正在接受离子辐射时或被离子辐射之后，或在离子辐射之前和之后给予本发明的药物组合物，可以使哺乳动物因离子辐射的毒性所致的发病及死亡明显减少。本发明也提供了其它药物组合物，在哺乳动物被离子辐射之前或正在接受离子辐射时或被离子辐射之后，或在离子辐射之前和之后给予本发明的药物组合物，这些药物组合物也能明显减少哺乳动物因离子辐射的毒性所致的发病及死亡。这些药物组合物含有有效治疗剂量的至少两种蛋白因子，该至少两种蛋白因子包含于一种递送给哺乳动物的适宜药物制剂中。所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGF、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF[AA、AB、BB]、TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。优选的含有至少两种蛋白因子的药物组合物包含有效治疗剂量的CSF-1及TNF-α。另一优选的含有至少两种蛋白因子的药物组合物含有有效治疗剂量的TNF-α、CSF-1及FGF-1。
本发明也提供其它的药物组合物。这些药物组合物含有有效治疗剂量的白细胞介素-12或其它一种或多种与白细胞介素-12具有基本相同功能的等效物，所述白细胞介素-12或等效物包含于一种递送给哺乳动物的适宜药物制剂中。在哺乳动物接受一种或多种基础治疗而附带出现血液供给的下降时，所述制剂使药物组合物有效地施用给哺乳动物，因此，可促进造血功能的恢复。导致血液供给下降的基础治疗通常包括放射性治疗，化学治疗或放射-化学治疗的结合(放射/化学治疗)。本发明也提供其它的药物组合物用来恢复因基础治疗(例如，放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗)而附带导致功能下降的造血系统。这些药物组合物含有有效治疗剂量的至少两种蛋白因子，该至少两种蛋白因子包含于一种递送给哺乳动物的适宜药物制剂中。其中至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF[AA、AB、BB]、TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。优选的含有至少两种蛋白因子的药物组合物含有有效治疗剂量的CSF-1及TNF-α。另一优选的含有至少两种蛋白因子的药物组合物含有有效治疗剂量的TNF-α、CSF-1及FGF-1。
本发明还提供治疗方法以明显减少哺乳动物因离子辐射的毒性所致的发病及死亡。这些治疗方法通常包括给予有效治疗剂量的治疗剂，所述治疗剂包含于一种递送给哺乳动物的适宜药物制剂中。在哺乳动物被离子辐射之前或正在接受离子辐射时或被离子辐射之后，或在离子辐射之前和之后可以给予哺乳动物药物制剂。本发明的治疗方法中提供的制剂含有IL-12，或其它一种或多种与白细胞介素-12具有基本相同功能的蛋白等效物或至少两种蛋白因子。其中所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF[AA、AB、BB]、TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。优选的使用含有至少两种蛋白因子的方法包括给予有效治疗剂量的CSF-1及TNF-α。另一优选的实施方式包括，给予有效治疗剂量的TNF-α、CSF-1及FGF-1。
当所述患者因接受一种或多种基础治疗(例如放射性治疗，化学治疗或放射/化学治疗)而附带发生造血供给下降时，本发明提供的治疗方法能够促进患者(哺乳动物)造血系统的恢复。本发明提供的治疗方法包括在一种或多种基础治疗之前或之中或之后，给予患者包含于适宜制剂中的有效治疗剂量的治疗剂。本发明的制剂含有有效治疗剂量的白细胞介素-12，或其它一种或多种与白细胞介素-12具有基本相同功能的等效物，或至少两种蛋白因子。其中所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF[AA、AB、BB]、TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。优选的含有至少两种蛋白因子的方法的实施方式包括给予有效治疗剂量的CSF-1及TNF-α。另一优选实施方式包括给予有效治疗剂量的TNF-α、CSF-1及FGF-1。
进一步地，当接受基础治疗(放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗)时，本发明提供的治疗方法将减轻与之相关的一种或多种毒性反应，从而有利于哺乳动物，优选人类。特别是，本发明提供的治疗方法将减轻各种基础治疗(放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗)引起的一种或多种血液学参数的下降，如血小板下降、白细胞下降、红细胞下降、血细胞比容下降等。本发明提供的治疗方法的另一个益处是在基础治疗的效果上进一步减小一种或多种肿瘤的体积。
最后，本发明提供了有效的抗癌方法，其允许高密度剂量的抗癌方法得以实施。所以，本发明提供了治疗癌症患者的方法即，对接受放射性治疗、化学治疗、或放射/化学治疗的患者(尤其是人)给予有效治疗剂量的白细胞介素-12，或其它一种或多种与与白细胞介素-12具有基本相同功能等效物。本发明还提供了抗癌的治疗方法给予癌症患者(尤其是人)至少两种蛋白因子。其中所述至少两种有效治疗剂量的蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF[AA、AB、BB]、TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。优选的含有至少两种蛋白因子的治疗方法的实施方式包括给予有效治疗剂量的CSF-1及TNF-α。另一优选的实施方式包括给予有效治疗剂量的TNF-α、CSF-1及FGF-1。
本发明涉及包括促进造血功能恢复的蛋白因子的治疗剂和组合物及治疗方法。本发明的治疗剂和组合物及方法可直接用于治疗。特别的，对于急需对其造血功能刺激和调节来恢复一个或几个造血系统成分的患者，本发明的治疗剂和组合物能够恢复他们的造血功能。这些患者包括那些会附带降低血液供给的治疗，例如放射性治疗或化学治疗的患者。
本发明的治疗剂及组合物的有效性体现在本发明的制剂及组合物能够使实验动物的造血系统抵抗致死放射线辐射并使实验动物存活下来。能够使经过致死放射性辐射的实验动物的造血功能恢复强烈地表明本发明的制剂及组合物的治疗效果是非常明显的。然而，本发明的制剂及组合物也能促进恢复那些接受低于致死低剂量的放射性治疗或化学治疗的实验动物的造血功能。
用于治疗各种肿瘤或其它疾病的化学治疗和放射性治疗，不管是单独使用或一起使用都会对患者的造血系统造成损害。这样，那些接受放射性治疗或化学治疗，或者放射/化学治疗的患者，他们的血液系统就会受到严重损害而造成供血不足。而且，由于这些治疗措施导致患者的供血系统的不足也就限制了化学治疗和/或放射性治疗在治疗各种肿瘤和其它疾病中的应用。
本发明的治疗剂及组合物不但能够促进正常的造血系统，更特别的是他们能够促进那些曾接受过或正在接受或将要接受化学治疗和/或放射性治疗的患者的造血功能。所以，本发明的制剂及组合物不但可以用来作为基础治疗方案，也可以被用作其它一个或几个基础治疗方案的辅助治疗方法。本发明的辅助治疗方法可以用在其它基础治疗方案已经开始实施之后，也可以与基础治疗方案同时实施，和/或在基础治疗方案之前实施。这样，本发明不但可以增强一般的造血功能恢复，而且也可以增强接受附带降低患者血液供给的一种或几种治疗的造血功能的恢复，本文所述，术语“接受”包括在实施本发明的辅助治疗方案之前、之中和/或之后，实施基础治疗方案。作为辅助治疗方案也可以恢复那些已接受过或正在接受或将要接受其它一个或几个基础治疗方案的患者的已被损害的或正在被损害或将要被损害的造血功能。
本发明的治疗剂及组合物，用作放射性治疗和/或化学治疗的辅助性治疗，可以给患者带来的好处就是不但可以降低那些放射性治疗和/或化学治疗等基础治疗给患者带来的毒副作用，也可以增强患者的造血机能从那些毒副作用中恢复的能力。那些毒副作用包括患者造血系统的一个或几个成份受到损害。给予患者本发明的治疗剂或组合物带来的特别明显的好处就是可以使患者能够承受更高强度的放射性治疗和/或化学治疗等基础治疗。所以，结合本发明的制剂及组合物作为辅助性治疗手段，对患者就可以实施更高强度和密度的基础治疗方案。这样，给予本发明的治疗剂或组合物可以作为辅助治疗方案或与化学治疗和/或放射性治疗等传统治疗方案结合，这样，那些基础治疗成功率就会大大地提高。
本发明的制剂及组合物的另一个用途就是用来治疗因一些疾病或使用高强度的治疗方案，例如，放射性治疗和/或化学治疗，导致的患者骨髓机能的丧失。本发明的制剂和组合物也可以用于骨髓或外周血细胞的移植，以降低骨髓或外周血干细胞移植中的异体排斥现象，促进骨髓或外周血干细胞移植的成功率。
本发明的制剂及组合物也可以有其它的广泛用途，如可以治疗或预防因接触致死或接近致死剂量的离子放射线辐射而导致的严重的哺乳动物伤害和死亡，这些高剂量的离子放射线可以是来自肿瘤治疗当中的放射性治疗，也可以是来自意外的与放射性暴露或战争相关的事故。
表1列出了可以应用本发明治疗剂及组合物治疗的各种疾病和症状。
表1通过提高或调节造血细胞功能而治疗的疾病或病症1)因正常血细胞生产或成熟功能失常或障碍而导致的疾病干细胞高度分裂所致异常再生障碍性贫血中性粒细胞减少细胞减少贫血各类血细胞减少粒细胞缺乏血小板减少红细胞发育不良由于药物，放射性或感染引起的布-戴(Blackfan-Diamond)综合征2)造血系统的恶性肿瘤急性淋巴母细胞(淋巴细胞)白血病慢性淋巴细胞白血病急性骨髓性粒细胞白血病慢性骨髓性粒细胞白血病急性恶性骨髓硬化症多发性骨髓瘤真性红细胞增多症agnogenic myelometaplasia瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症何杰金淋巴瘤非何杰金淋巴瘤3)伴有免疫机能低下的恶性或实体肿瘤恶性黑素瘤胃癌卵巢癌乳腺癌肺小细胞癌视网膜膜母细胞瘤睾丸癌成胶质细胞瘤横纹肌肉瘤成神经细胞瘤尤因肉瘤淋巴瘤4)自身免疫性疾病类风湿性关节炎I型糖尿病慢性肝炎多发性硬化症系统性红斑狼疮5)遗传性(先天性)异常贫血家族性再生障碍性贫血范康尼综合征布卢姆综合征单纯性红细胞再生障碍性贫血(PRCA)先天性角化不良综合征(dyskeratosis congenita)布-戴(Blackfan-Diamond)综合征先天性红细胞再生缺陷综合征I-IVChwachmann-Diamond综合征二氢叶酸还原酶缺乏formamino转移酶缺乏累-奈(Lesch-Nyhan)综合征先天性球形红细胞症先天性椭圆形细胞增多症先天性裂口红细胞症先天性Rh null病阵发性夜间血红蛋白尿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶变体1，2，3丙酮酸激酶缺乏先天性促红细胞生成素反应低下镰刀细胞病和特征地中海贫血α，β，γ高铁血红蛋白血症(met-hemoglobinemia)先天性免疫缺陷重度联合免疫缺陷病(SCID)
淋巴细胞缺乏症(bare lymphocyte syndrome)离子载体反应性联合免疫缺陷(ionophore-responsive combined immunodeficiency)具有帽化异常的联合免疫缺陷(combined immunodeficiency with a capping abnormality)核苷磷酸化酶缺陷粒细胞肌动蛋白缺陷婴儿粒细胞缺乏高歇病腺苷脱氨酶缺陷科斯特曼综合征网状细胞发育不全先天性白细胞功能不良综合征6)其它疾病骨硬化病骨髓硬化症获得性溶血性贫血获得性免疫缺陷感染性疾病所致原发或继发性免疫缺陷细菌性感染(如普鲁氏菌病，李斯特菌病，结核病，麻疯病)寄生虫感染(如疟疾，利氏曼病)真菌感染由于老化嗜菌细胞功能不良所致淋巴细胞比例失调引起的免疫功能不良科斯特曼粒性白细胞缺乏(kostmann’s agranulocytosis)慢性肉芽肿性疾病切-东综合征
Willams-Beuren综合征中性粒细胞肌动蛋白缺陷中性粒细胞膜GP-180缺陷代解储存性疾病粘多糖贮积病粘脂贮积病混和性免疫缺陷(miscellaneous disorders involving immune mechanisms)威-奥综合征α1-抗胰蛋白酶缺乏症本发明提供药物/治疗剂和组合物。这些制剂和组合物中含有有效治疗剂量的促进造血系统的恢复的至少一种蛋白因子。本发明的一个实施方式包含白细胞介素-12(白细胞介素-12，IL-12)；或一种或一种以上具有基本相同的促进造血功能的蛋白制剂。本发明另一个实施方式包含至少两种选自以下因子的蛋白因子CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、[AA、AB、BB]TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。其中优选的蛋白因子组合物含有TNF-α和CSF-1。
本发明的其它实施方式还含有有效治疗剂量的白细胞介素-12或一种或一种以上具有基本相同造血功能的等效物，所述的适合药物制剂中含有载体、稳定剂、助溶剂和/或稀释剂。特别是，本发明的实施方式含有药物组合物，该组合物含有具有基本相同的造血功能的等效物，该等效物包含于适合递送给人的药物制剂中。本发明的其它实施方式还包括含有有效治疗剂量的至少两种蛋白因子的药物组合物，其中所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、[AA、AB、BB]TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。其中，优选的药物组合物含有有效剂量的TNF-α和CSF-1，其包含于适合递送给人的药物制剂中。
本发明进一步公开了给予本发明所述促进造血功能的制剂的药学治疗方法。本发明的这些实施方式包括给予患者本发明的治疗剂或组合物的给药方法，所述患者优选人，以在有需求的患者中刺激血液再生，维持/调节造血功能。当需要造血功能调节的患者的造血系统出现一种或多种血细胞系缺陷时，这些治疗方法可恢复、促进或维持患者的造血功能。这些患者包括接受治疗的患者，其血液供给出现降低，其一项或多项血液指标附带出现降低，即其单项或多项造血系统功能缺陷，如接受放射性治疗或化学治疗的患者。对于造血功能的恢复、促进和/或维持的效能，可以评价在给予本发明制剂和组合物的前后监测一项或多项血液指标。本发明所公开的治疗剂或组合物优选静脉或皮下给药，但根据本发明的公开，本领域普通技术人员也会理解到可以根据所用制剂或组合物采取其它的给药方式。
本发明的治疗方法的优选实施方式适合于增加肿瘤的治疗效果，可作为放射性治疗、化学治疗、放射/化学治疗的辅助治疗，其包括白细胞介素-12的单独给药，也可以给予一种或多种具有基本相同的促进造血功能的等效物。作为放射性治疗、化学治疗、放射/化学治疗的辅助治疗，本发明的治疗方法的另一实施方式还包括给予至少两种蛋白因子，其中，所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、[AA、AB、BB]TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。化学治疗的药物含有小分子制剂和蛋白制剂，例如阿霉素、环磷酰胺、泰素、强的松、新长春碱等或类似物。这些化学治疗的药物可以两种或两种以上联合给药。优选化学治疗药物为泰素，可与本发明所述的蛋白制剂和蛋白组合物联合应用。
本发明所述优选的治疗剂是白细胞介素-12。如本文所述，本发明的实施方式提供了药物/治疗剂和组合物，含有有效治疗效果剂量的白细胞介素-12或一种或一种以上的基本具有与白细胞介素-12同样功能的促进造血功能的制剂。基本具有与白细胞介素-12同样功能的促进造血功能的制剂含有本发明所述的促进造血功能恢复的分子，这些分子的效能与白细胞介素-12相类似。这些基本促进造血功能的制剂含有以单体型应用的白细胞介素-12的一个亚单位或两个亚单位，以单体或双体型应用的白细胞介素-12的一个亚单位或两个亚单位的片段，以单体或双体型应用的一种或多种增加或替换的突变型白细胞介素-12，其中，白细胞介素-12的一个或几个亚单位的天然氨基酸发生突变。
白细胞介素-12是具有生物功能的天然分子。分离及生产白细胞介素-12的方法已经由美国专利号5,648,467和5,744,132描述。本发明在此公布白细胞介素-12的未知功能。白细胞介素-12的未知功能是在致死剂量放射线的辐射下，给药白细胞介素-12(辐射前或辐射后)可以帮助造血系统的恢复。特别的，此处定义的促进造血功能恢复的基本相同功能是至少约50％的平均造血活性从致死剂量放射线的辐射下恢复。在此公布的优选用于患者的治疗组合物含有包含于适合递送给人的制剂中的白细胞介素-12。本发明还公布了其它的具有类似白细胞介素-12效应的治疗组合物。这些治疗组合物包含至少两种选自以下的蛋白因子CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGFA、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、[AA、AB、BB]TGF-β1、TGF-β2、TGF-a、ANG-1、MCP-1、PF4和IL-8。其中，优选的组合物含有TNF-α和CSF-1。
在优选的实施方式中，治疗剂是白细胞介素-12，其用于人的剂量范围为大约1纳克/公斤体重(1ng/kg)至约1000纳克/公斤体重(1000ng/Kg)，优选剂量范围为约10纳克/公斤体重(10ng/Kg)至约500纳克/公斤体重(500ng/Kg)。在另一实施方式中，治疗组合物含有两种或两种以上的本发明公开的蛋白因子，其用于人的剂量范围为约1纳克/公斤体重(1ng/kg)至约1000纳克/公斤体重(1000ng/kg)(每一种蛋白因子)，优选剂量范围为约10纳克/公斤体重(10ng/kg)至约500纳克/公斤体重(500ng/Kg)(每一种因子)。参考本发明的公开，本领域技术人员会理解，适合人的本公开的任何制剂的剂量范围可参考以下公式人的剂量≈鼠剂量/12。
本发明的治疗方法可用于普遍意义上的促进造血功能，并且特别的，促进已经接受或正在接受或将要接受放射性治疗或化学治疗或放射/化学治疗的患者的造血功能。所以，本发明的治疗方法可用于基础治疗，或可用于基础治疗前、基础治疗中和/或基础治疗后的辅助治疗。图1显示致死剂量放射线的辐射下小鼠接受白细胞介素-12或PBS缓冲液后的典型存活曲线。
本发明中许多蛋白因子所用术语，如炎症性的，致炎症性的(proinflammatory)，细胞因子，趋化因子，生长因子，是科学界普遍应用的术语。因此，这些术语在本发明中作为普遍意义上的科学术语，并不以任何方式局限本发明的范围。
图1.致死剂量的放射性辐射后，实验小鼠的存活曲线图。对照组有30只小鼠，辐射后从尾静脉注射PBS缓冲液，在辐射后的30天内，全部死去。实验组有45只老鼠，辐射后或辐射前从尾静脉注射IL-12，每只小鼠注射两次，每次100ng，注射剂量的IL-12溶解在PBS缓冲液中，IL-12处理组小鼠的存活率在80％左右。
图2.在致死剂量的放射性辐射后，对照组与实验组动物的骨髓切片比较。离子放射线辐射后不同的时间，骨髓组织切片的H&E染色图。从上图可以看到IL-12对骨髓细胞有明显的抵抗放射辐射的保护作用。在第一次放射剂量之前24小时和12小时，实验动物接受IL-12(100ng)而对照组接受PBS。
图3.在致死剂量放射性辐射后，对照组与实验组动物的小肠组切片比较。在第一次放射性剂量之后30分钟和12小时后，实验动物接受IL-12(100ng)而对照组接受PBS。在放射性辐射后的第15天，从实验组和对照组的小鼠中取出小肠，固定、染色和H&E染色。从图中可以看出，本实验用的辐射剂量对小肠几乎没有损害，IL-12更没有对小肠起负面作用。
图4.在放射性辐射后不同的时间，实验小鼠的细胞组成的变化。图中显示在接受致死剂量辐射的动物模型中，IL-12可以完全恢复血液系统。在第二次辐射剂量后30分钟和12小时，给予接受致死剂量辐射的小鼠IL-12(100ng/小鼠)；从对照组小鼠和实验组小鼠收集血液，并且测定血细胞计数。对照组小鼠在辐射后14天全部死去，IL-12处理组的小鼠血组成在辐射后约32天基本恢复到正常状况。
图5.IL-12对接受亚致死剂量辐射(700rad)的小鼠外周血常规指标的影响。对照组小鼠被注射PBS缓冲液，实验组小鼠在辐射前24和12小时(前)或在第二次辐射后30分钟和12小时(后)在尾静脉注射IL-12，IL-12剂量是100ng/小鼠。从对照组小鼠和实验组小鼠收集血液，并且测定血细胞计数。
具体实施例方式
提供以下实施例，向本领域普通技术人员完全公开如何制备、使用和评价本发明的治疗剂，组合物及方法，但不局限本发明的范围。努力使数据尽可能保持准确(例如，数量，浓度，等等)，但允许某些实验误差及变异。
实验材料和方法本发明采用6至8周C57BL/6雌性小鼠为动物模型。所有用于实验的小鼠饲养于特殊无菌环境，采用包含抗生素的酸性水和灭菌充足的食物。辐射小鼠采用已知致死剂量。辐射次数为2次。辐射用设备为双对立铯137放射源。
无论在辐射前或后，小鼠通过静脉注射给药。给药方案为1)白细胞介素-12(此后概用其英文命名简称IL-12)，2)一种或多种以下蛋白因子的联合CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGF、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-α、ANG-1、MCP-1、PF-4或IL-8。所有以上蛋白因子为商购来源，按照生产厂家所提供的使用说明在临注射前配制于PBS缓冲液中使用。
以上绝大部实验一般采用两次给药(制剂或组合物)。给药时间为最后一次辐射后30分钟和12小时。如上文所及，给药亦可在辐射前进行。通常情况下，辐射前给药的程序是在两个单独时间点给药，一次剂量在第一次辐射前24小时，另一次剂量在第一次辐射剂量之前12小时。每次辐射剂量为500Rad。此发明所使用的制剂及组合物通过小鼠尾静脉注射给药。下面表2例举了本实验所使用的部分蛋白因子以及生产/销售公司来源，并附有种属来源。
表2细胞因子&生长因子全名生产/销售公司种属来源ANG-1 血管生成素-1 R&D Systems，Inc.人EGF表皮生长因子 Chemicon Company 小鼠FGF-1 成纤维细胞生长因子-1 R&D Systems，Inc.人FGF-2 成纤维细胞生长因子-2 R&D Systems，Inc.人IGF-1 胰岛素样生长因子-1 R&D Systems，Inc.小鼠IL-12 白细胞介素-12R&D Systems，Inc.小鼠IL-1β白细胞介素-1βR&D Systems，Inc.小鼠IL-6 白细胞介素-6 R&D Systems，Inc.小鼠IL-8 白细胞介素-8 R&D Systems，Inc.人KGF(FGF-7) 角质化细胞生长因子 R&D Systems，Inc.人MCP-1 单核细胞趋化蛋白-1 R&D Systems，Inc.人M-CSF(CSF-1) 巨噬细胞集落刺激因子 R&D Systems，Inc.小鼠MIP-lalpha 巨噬细胞炎症蛋白1α R&D Systems，Inc.小鼠PDGF 血小板衍生生长因子 R&D Systems，Inc.人PDGF AA血小板衍生生长因子AA R&D Systems，Inc.人PDGF AB血小板衍生生长因子AB R&D Systems，Inc.人PDGF BB血小板衍生生长因子BB R&D Systems，Inc.人PF4血小板因子4 Chemicon Company 人TGF-alpha 转化生长因子αR&D Systems，Inc.人TG-Fβ1转化生长因子β1 R&D Systems，Inc.人TGF-β2转化生长因子β2 R&D Systems，Inc.人THF-alpha 肿瘤坏死因子αR&D Systems，Inc.小鼠VEGF A 血管内皮细胞生长因子AR&D Systems，Inc.小鼠实施例119种蛋白因子分为六组，给予实验动物。根据对这19种蛋白因子功能的理解，将他们分为A到F六组，如表3所列。每一组蛋白因子是具有相类似的或是同一蛋白家族的相关功能。在实验组#2到#7中，蛋白组合A到F被分别从19种蛋白因子中去除以观察相应蛋白组合对造血系统恢复功能。实验结果总结见表3。
表3该实验一次注射给药，每组5只小鼠。#8是对照组，注射磷酸盐缓冲液(PBS)蛋白组合 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8
存活率(％) 80 20 0 40 0 60 60 40
实施例2此次实验中，辐射小鼠两次，中间相隔3个小时，每次500Rad。单一蛋白因子/制剂或含有单一蛋白因子或单一蛋白因子加有血清的组合物一次尾静脉注射给小鼠。除特别说明外，两次给药时间点一般为第二次辐射后30至60分钟和12小时或第一次辐射前24小时和12小时。实验结果总结于图1。
在下表4，“给药后”指在第二次辐射后30分钟和12小时给予所述组合物；“在30分钟和12小时后”，“6小时和18小时后”，“12小时和24小时后”，“24小时和36小时后”指在第二次辐射后的给定时间点给予所述组合物；“辐射前24小时和12小时”是指在第一次辐射前24小时和12小时给予所述药物组合物。
表4辐射剂量137Cs辐射源，500Rad，两次辐射，3小时间隔。IL-12两次给药，每次100ng或200ng。
实施例3进行组织学研究显示对照组和实验组动物的不同。此实验中，在实验小鼠接受第二次离子放射线辐射前24小时和12小时，分别在小鼠的尾静脉注射IL-12，每次每只小鼠注射100ng的剂量，对照组小鼠注射磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)。注射后，对照组和实验组小鼠同时接受两次的放射线辐射，中间相隔3个小时，每次辐射剂量是500RAD。在辐射后的第1天和第7天，分别从对照组合实验组的小鼠中取出后大腿骨，在10％的福尔马林中固定24小时用于组织切片和苏木精和伊红(H&E)染色。从图2中可以看出，与对照组相比，明显地看到IL-12对骨髓的保护作用，减轻了由于放射性辐射导致的骨髓损伤。辐射后7天，从IL-12处理过的小鼠的骨髓中分离的骨髓细胞总数是从对照组骨髓中分离的细胞总数的4.2倍(IL-12∶PBS缓冲液＝3.6×105∶8.6×104)。
实施例4为了研究IL-12对接受致死剂量放射线辐射的实验小鼠的胃肠系统是否有负面作用，实验组和对照组小鼠的小肠经过固定、包埋、组织切片和H&E染色。从图3可以看出，IL-12对接受辐射的实验小鼠的小肠没有负面的作用。
实施例5为了研究IL-12是否能完全恢复被放射性辐射破坏掉的血液系统，实验小鼠接受第二次致死剂量的放射性辐射后30分钟和12小时，从小鼠的尾静脉注射IL-12(100ng/小鼠)(实验组)或PBS缓冲液(对照组)。在辐射后的不同时间，从小鼠的尾末端取血做血常规分析，结果见图4。IL-12能够完全恢复被辐射小鼠的血液系统。血细胞采用MASCOT MultispeciesHematology Systems(DREW CDC Technologies，Inc.)计数。
实施例6在放射性辐射后4，7，12，15，18，21，33天收集外周血WAS，并采用MASCOT Multispeices Hematoloty Systems(DREW CDC Technologies，Inc.)计数。如图5所示，观察到血小板，红细胞和单核细胞的早期恢复的提高。在这种高剂量亚致死剂量放射性辐射下，淋巴细胞和中性粒细胞的恢复没有显示差异。
实施例7此发明亦可被期望能够促进临床接受亚致死剂量放射和/或化学治疗作为主要治疗方案的患者造血功能的恢复。以下是此发明所使用的评估治疗剂及药物组合物效果的实验程序。实验程序一为亚致死剂量放射性治疗的小鼠模型，实验程序二为化学治疗的小鼠模型。
一)亚致死放射性治疗模型(放射性治疗模型)每只小鼠接受单一辐射剂量700Rad。治疗剂和药物组合物在辐射前和/或辐射后给药。例如，静脉或皮下注射IL-2或至少两种其它蛋白因子组合。在动物被辐射后抽取外周血以观察红细胞、白细胞及血小板的动态变化。实验组与对照组比较，实验组动物的一种或数种血细胞数量会较早恢复，而且，早期健康状况也会更好。该实验的取血时间点为辐射后4，7，12，15，15，21，33天。
二)化学治疗模型如表5所列，小鼠接受不同的单一或组合化学治疗药物。给予本发明所公开的治疗剂或治疗组合物，给药时间在接受化学治疗之前或之后。例如，静脉或皮下注射IL-12或IL-12加GM-CSF。在动物接受化学治疗后，抽取外周血以观察红细胞、白细胞及血小板的动态变化。与对照组比较，给药组(实验组)动物的一种或数种血细胞数量会较早恢复，而且，早期健康状况也会更好。该实验的取血时间点为注射化学治疗药物后7，10，14，21，28，和35天。
表5
虽然参考优选实施方式，较详尽地讨论了本发明，但不排除其它实施方式。因此，所附权利要求的范围不仅仅限于本文所包含的优选实施方式。本文引用的所有参考文献和专利将作为参考整体引入本文。
权利要求
1.一种药物组合物，该药物组合物含有白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物；和一种用于递送给哺乳动物的适当的药物制剂，其中在哺乳动物被离子辐射之前或正在接受离子辐射时或被离子辐射之后，或在离子辐射之前和之后，对哺乳动物给予本发明的药物组合物，以大大降低由于所述辐射的毒副作用引起的严重疾病和死亡率。
2.一种药物组合物，该药物组合物主要由白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物；和一种用于递送给哺乳动物的适当的药物制剂构成，其中在哺乳动物被离子辐射之前或正在接受离子辐射时或被离子辐射之后，或在离子辐射之前和之后，对哺乳动物给予本发明的药物组合物，以大大降低由于所述辐射的毒副作用引起的严重疾病和死亡率。
3.一种药物组合物，该组合物用于大大降低哺乳动物严重疾病和死亡率，其中在所述哺乳动物接受离子放射线辐射之前或正在接受离子辐射时或接受离子辐射之后，或在离子辐射之前和之后，对所述哺乳动物给予所述药物组合物，所述药物组合物含有包含于一种用于递送给哺乳动物的适当的药物制剂中的至少两种蛋白因子，该两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGF、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-α、ANG-1、MCP-1、PF-4或IL-8。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述的至少两种蛋白因子为TNF-α和CSF-1。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述的至少两种蛋白因子还包括FGF-1。
6.一种药物组合物，该组合物含有白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物；和一种用于递送给哺乳动物的适当的药物制剂，其中对那些因接受一种和多种治疗而附带导致血液供给下降的哺乳动物给予该组合物，以大大增强该哺乳动物造血功能的恢复。
7.一种药物组合物，该药物组合物基本上由白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物；和一种用于递送给哺乳动物的适当的药物制剂构成，其中，对那些因接受一种和多种治疗而附带导致血液供给下降的哺乳动物给予该组合物，以大大增强该哺乳动物造血功能的恢复。
8.一种药物组合物，该药物组合物用于增强那些因接受一种和多种治疗而附带导致血液供给下降的哺乳动物的造血功能的恢复，所述药物组合物含有包含于一种用于递送给哺乳动物的适当药物制剂中的至少两种蛋白因子，其中所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGF、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-α、ANG-1、MCP-1、PF-4或IL-8。
9.如权利要求8所述的药物组合物，该药物组合物的至少两种蛋白因子为TNF-α和CSF-1。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述的至少两种蛋白因子还包括FGF-1。
11.一种用于大大降低哺乳动物因离子辐射而导致的严重疾病和死亡率的方法，该方法包括给予有效治疗剂量的白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物，其中有效治疗剂量的白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物包含于一种用于递送给哺乳动物的适当药物制剂内，并且在哺乳动物接受离子辐射之前或正在接受离子辐射时或接受离子辐射之后，或接受离子辐射之前和之后给予所述哺乳动物。
12.一种用于大大降低哺乳动物因离子辐射而导致的严重疾病和死亡率的方法，该方法包括在哺乳动物接受离子辐射之前或正在接受离子辐射时或接受离子辐射之后，或接受离子辐射之前和之后，给予所述哺乳动物有效治疗剂量的至少两种蛋白因子，这些蛋白因子包含于一种用于递送给哺乳动物的适当药物制剂中，其中，所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGF、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-α、ANG-1、MCP-1、PF-4或IL-8。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述至少两种蛋白因子为TNF-α和CSF-1。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述至少两种蛋白因子还包括FGF-1。
15.一种用于增强因接受一种或多种治疗而附带导致血液供给下降的哺乳动物的造血功能恢复的方法，该方法包括在一种或多种治疗之前或正在接受治疗方法时或接受其它治疗方法之后，或接受治疗之前和之后，给予有效治疗剂量的白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物，其中有效治疗剂量的白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物包含于一种用于递送给哺乳动物的适当药物制剂中。
16.一种用于增强因接受一种或多种治疗而附带导致血液供给下降的哺乳动物的造血功能恢复的方法，该方法包括在一种或多种治疗之前或正在接受治疗方法时或接受治疗之后，或接受治疗之前和之后给予有效治疗剂量的至少两种蛋白因子，这些蛋白因子包含于一种用于递送给哺乳动物的适当的药物制剂中，其中所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGF、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-α、ANG-1、MCP-1、PF-4或IL-8。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述至少两种蛋白因子为TNF-α和CSF-1。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述至少两种蛋白因子还包括FGF-1。
19.一种用于减轻伴随放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗的一种或多种毒性作用的方法，该方法包括给予患者有效治疗剂量的白细胞介素-12或一种或多种具有基本相同造血功能的等效物，其中，在所述患者接受放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗之前、之后或之中，给予该患者有效治疗剂量的白细胞介素-12，或其它一种或多种具有基本相同造血功能的等效物，以减轻放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗所伴随的一种或多种毒性反应。
20.权利要求19所述的方法，其中一种或多种毒性反应是指一种或多种血液学参数的下降。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述患者患有一种或多种实体肿瘤。
22.如权利要求21所述的方法，其中给予肿瘤患者有效治疗剂量的白细胞介素-12，或其它一种或多种具有基本相同造血功能的等效物以减小一种或多种实体肿瘤的体积。
23.一种用于减轻伴随放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗的一种或多种毒性作用的方法，该方法包括给予患者有效治疗剂量的至少两种蛋白因子，所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGF、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-α、ANG-1、MCP-1、PF-4或IL-8，其中，在该患者接受放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗之前、之中或之后，给予所述患者有效治疗剂量的所述至少两种蛋白因子，以减轻放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗所伴随的一种或多种毒性作用。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述毒性反应是指一种或多种血液学参数的下降。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述患者患有一种或多种实体肿瘤。
26.如权利要求25所述的方法，其中给予肿瘤患者有效治疗剂量的IL-12或一种或多种具有基本相同的造血功能的等效物以减小一种或多种实体肿瘤的体积。
27.一种治疗癌症患者的方法，该方法包括给予患者有效治疗剂量的IL-12或一种或多种具有基本相同的造血功能的等效物；并给予患者放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗。
28.一种治疗癌症患者的方法，该方法包括给予患者有效治疗剂量的至少两种蛋白因子，所述至少两种蛋白因子选自CSF-1、EGF、IGF-1、TNF-α、VEGF、MIP-1、IL-1、IL-6、FGF-1、FGF-2、FGF-7、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-α、ANG-1、MCP-1、PF-4或IL-8；并给予患者放射性治疗、化学治疗或放射/化学治疗。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述至少两种蛋白因子为TNF-α和CSF-1。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述至少两种蛋白因子还包括FGF-1。
全文摘要
本发明涉及促进恢复造血功能的治疗剂、组合物和方法，特别涉及用于对抗治疗各种疾病的放射与化学治疗毒副作用，促进恢复造血功能的治疗剂、组合物和方法。本发明的优选实施方式包括含有IL－12为治疗剂的药物组合物或含有至少两种下述蛋白因子作为治疗剂的药物组合物CSF－1、EGF、IGF－1、TNF－α、VEGF、MIP－1、IL－1、IL－6、FGF－1、FGF－2、FGF－7、PDGF、TGF－β1、TGF－β2、TGF－α、ANG－1、MCP－1、PF－4或IL－8。本发明的药物组合物在患者接受基础治疗，例如放射性治疗和/或化学治疗之前、之中和/或之后给予。
文档编号A61P7/00GK1565622SQ03148180
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月4日 优先权日2003年7月4日
发明者威廉·法兰西·安德森, 陈廷超, 赵毅 申请人:威廉·法兰西·安德森, 陈廷超, 赵毅