一种gpr120激动剂的快速筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种GPR120激动剂的快速筛选方法，运用计算机辅助药物设计，对已经进行构象搜索的化合物，使用Discovery Studio 2.5的hypogen进行3D-QSAR的药效团模型构型，同时使用Fischer 90％验证，得到实际活性与计算活性的线性回归。根据GPR120激动剂的构效关系和内源性配体脂肪酸的结构关系得出：羧基为GPR120激动剂必须基团，手动筛选出含有羧基的候选化合物。再以细胞平台的高通量筛选验证，从而获得GPR120激动剂的候选分子。通过药物的虚拟筛选，在短时间内获得活性化合物的线索，将研究目标从几百万个化合物集中到几十个化合物。然后再从筛选后的化合物中，利用细胞平台筛选出先导化合物，提高了筛选化合物的速度和效率，缩短新药研究的周期。
【专利说明】-种GPR120激动剂的快速筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物筛选方法，具体涉及一种GPR120激动剂的快速筛选方法。
【背景技术】
[0002] GPR120是最近被发现的G蛋白偶联受体，属于GPCRs超家族中的视紫红质样受体 家族。GPR120在多种组织中均有表达，结肠中有更高的表达水平。而且，GPR120在不同种 属动物的味蕾细胞、肠内分泌L细胞、脂肪细胞、巨噬细胞等细胞中均有表达（Hirasawa et al. 2005)，GPR120可能与肥胖、II型糖尿病有关。
[0003] 糖尿病作为以高血糖为特征的代谢性疾病已经成为了影响全球人健康的难题。 GLP-I是一种肠道分泌的荷尔蒙，它可促进血糖依赖胰岛素的分泌，同时脂肪酸作为能量来 源为分泌肠多肽提供重要的条件。已有报道称在小肠中表达很高的GPR120是长链不饱和 脂肪酸受体，而且有实验结果证明长链不饱和脂肪酸刺激GPR120会增加 GLP-I的分泌，促 进胰岛素的循环（Hirasawa et al. 2005)。因此GPR120对于治疗糖尿病和其他饮食失调疾 病（例如贪食症）来说是一个非常有前景的受体。
[0004] GPR120又被称为ω-3(比如DHA和EPA)脂肪酸受体（Oh et al.2010)。已有报 道ω-3脂肪酸和小分子激动剂刺激GPR120会产生广泛的抗炎作用，抗炎作用的原理见图 1，而且巨噬细胞调节的组织抗炎作用可以改善因糖尿病产生的胰岛素抗性。这个实验结果 说明了 GPR120是将抗炎和胰岛素敏化反应联系起来的纽带。因此对于治疗胰岛素抗性， GPR120作为一个新靶点是非常有前景的。
[0005] GPR120信号传导在人类结肠癌中也起到了重要作用（Wu et al. 2013)。在结肠癌 的组织和细胞株中，GPR120的表达显著升高。激活GPR120的PI3K/Akt -NF-kB信号通路会 促进结肠癌细胞中促血管生成因子的分泌和表达，加快结肠癌细胞中的血管生成，为癌细 胞繁殖提供营养支持。而且，激动GPR120促进肿瘤细胞迁移和肿瘤细胞间质传导。因此， GPR120可以作为治疗结肠癌的全新靶点。
[0006] 直到2005年，Hirasawa等人找到了 GPRl20的内源性配体（Hirasawa et al. 2005)，GPR120 -直被认为是孤儿受体。他们从1000多种化合物中，用定量流式细胞 技术在稳定表达GPR120-EGFP的HEK293细胞中检测内吞的荧光标记受体数量，筛选出 GPR120的配体是C14-C18链长的饱和脂肪酸和C16-C22链长的不饱和脂肪酸。此后，非 内源性的小分子激动剂也被发现，GW9508、NCG21、TUG-891 (Sun et al. 2010, Hudson et al. 2013, Shimpukade et al. 2012)在活化GPR120的效力与内源性长链脂肪酸类似，都可以 有效地活化细胞内ERK、细胞内Ca2+释放反应和GLP-I的分泌。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于建立一种GPRl 20激动剂的快速筛选方法，该方法从已知的 GPR120激动剂出发，建立一套高效可靠的筛选方法，将有助于寻找新型的小分子激动剂，有 效提高筛选的速度，降低筛选成本。
[0008] 本发明首先运用计算机辅助药物设计技术，参考前期工作和相关文献，对已经进 行构象搜索的化合物，使用Discovery Studio 2. 5的hypogen进行3D-QSAR的药效团模 型构型，同时使用Fischer 90%验证，得到实际活性与计算活性的线性回归。根据报道的 GPR120激动剂的构效关系和内源性配体脂肪酸的结构关系得出：羧基为GPR120激动剂必 须基团，故手动筛选出含有羧基的候选化合物。再以细胞平台的高通量筛选进行进一步验 证，从而获得GPR120激动剂的候选分子。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 一种GPR120激动剂的快速筛选方法，包括以下步骤：
[0011] (1)挑选出PEC50值大于4的20-50个GPR120激动剂作为候选化合物；
[0012] (2)步骤（1)中的化合物使用Discovery Studio 2. 5的hypogen模块构建了药效 团模型：使用Caesar方法进行构象搜索（采用默认设置）；然后对不同构象产生药效团模 型进行叠合，共得到5-15个药效团模型；在report界面得到候选化合物的实际活性和计算 活性的线性回归，我们确定回归系数R 2值最高的模型作为最优药效团模型；
[0013] (3)采用步骤⑵中药效团模型对SPECS数据库（荷兰SPECS公司成立于1987 年是一个中等规模的化合物库）进行虚拟筛选，得到打分值从高到低的前500-1000个化合 物，并按打分值由高到低排列为表单；
[0014] (4)根据筛选打分值和成药性五倍律原则，手动按顺序选取步骤（3)带有羧基的 50-100个化合物；
[0015] (5)对步骤⑷筛选的化合物进行活性初筛，浓度为10 μ M刺激STC-I细胞后，筛 选出比阳性对照药GW9508引起更高或相近的ERK磷酸化程度的化合物进行下一步EC5tl的 测定；
[0016] (6)pEC50值大于阳性对照药GW9508的化合物作为GPR120激动剂。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 本发明通过药物的虚拟筛选，可以在短时间内获得活性化合物的线索，将研究目 标从几百万个化合物集中到几十个化合物。然后再从虚拟筛选后的化合物中，利用细胞平 台筛选出先导化合物，因此大大提高了筛选化合物的速度和效率，缩短新药研究的周期。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1 ω-3脂肪酸与GPR120作用产生抗炎作用的原理；
[0020] 图2构建好的GPR120药效团模型示意图，其中1为氢键受体、2是芳香中心，3是 疏水中心；
[0021] 图3用作构建药效团的化合物结构式示意图；
[0022] 图4已挑选的化合物（表1)实际活性与计算活性的线性回归。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0024] -种GPR120激动剂的快速筛选方法，步骤如下：
[0025] (1)参考前期工作和相关文献，从已经报道的GPR120激动剂中挑选pEC50值大于 4的27个（Shimpukade et al.，2012)化合物作为3D-QSAR的药效团模型构型候选化合物 (表I)，用作构建药效团的化合物结构式示意图如图3。
[0026] (2)使用 Discovery Studio 2. 5 的 Caesar 方法（J. Chem. Inf. Model. 47， 1923-32 (2007))对27个候选化合物按照默认设置进行构象搜索，之后使用hypogen对不同 构象产生药效团模型进行叠合，共得到10个药效团模型，并且在report界面得到候选化合 物的实际活性和计算活性的线性回归，确定回归系数R 2值最高的模型作为最优药效团模型 (图 2)，R2 为 0· 888 (图 4)。
[0027] (3)采用步骤（2)中药效团模型对SPECS数据库（荷兰SPECS公司成立于1987 年是一个中等规模的化合物库）进行基于药效团模型的虚拟筛选（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 5130-2)，得到打分值从高到低的500个化合物，并按打分值由高到低排列 为表单；
[0028] (4)根据筛选打分值和成药性五倍律原则，手动按顺序选取带有羧基的50个化合 物（表2);
[0029] (5)对步骤⑷筛选的化合物进行活性初筛，浓度为10 μ M刺激STC-I细胞后，筛 选出比阳性对照药GW9508引起更高或相近的ERK磷酸化程度的化合物进行下一步EC5tl的 测定，活性初筛的结果见表2;
[0030] (6)采用生物发光共振能量转移（BRET)对筛出13个化合物测定EC5Q，pEC 5Q值大 于阳性对照药GW9508的化合物作为GPR120激动剂，活性结果见表3。
[0031] 生物活性测定：
[0032] 首先采用高表达GPR120的STC-I细胞，选择浓度IOuM为初筛浓度，以GW9508为 阳性对照药，以GAPDH或actin作为内标,运用蛋白质印迹法（Hirasawa et al.，2005)，测 定表2中50个化合物刺激细胞IOmin后胞内ERK磷酸化程度变化（表2)。有13个化合物 (表3)可以引起相对较高（ERK磷酸化程度高于GW9508或与之相近）的STC-I细胞株ERK 磷酸化，进一步测定表3中化合物的EC5Q。
[0033] 采用生物发光共振能量转移（BRET)进一步确定表3中的化合物EC5tl方法为：采用 瞬时转染的方法（Shimpukade et al.，2012)，将 GPR120-YFP 和 RLuc-β _arrestin2 两种质 粒同时转染（Shimpukade et al·，2012)进人胚肾细胞（HEK293)中，转染24h-48h，加入浓 度海洋海肾荧光素酶（终浓度为3 μ M)孵育5-15min，用不同浓度（InM-IOuM)表3中的化 合物刺激5-10min后用酶标仪（POLARstar Omega)检测荧光强度比（460nm/520nm)变化测 定化合物EC5tl。
[0034] 双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega，E1910)检测胞内钙离子浓度进一步 确定化合物EC5tl的方法为：采用瞬时转染的方法（Shimpukade et al.，2012)，NFAT-FLuc、 TK-RLuc和GPR120-Gq这三种质粒同时转染进HEK293细胞中，转染24h-48h后，用表3中的 化合物刺激，利用双荧光素酶检测试剂盒检测（具体方法按照试剂盒说明书操作）细胞内 钙离子浓度的变化从而得到化合物的EC 5tl (表3)。
[0035] 表1用于药效团构建的化合物
[0036]
【权利要求】
1. 一种GPR120激动剂的快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 挑选出PEC50值大于4的20-50个GPR120激动剂作为候选化合物； (2) 步骤（1)中的化合物使用Discovery Studio2.5的hypogen模块构建药效团模型， 使用Caesar方法进行构象搜索，然后对不同构象产生药效团模型进行叠合，得到5-15个药 效团模型，在report界面得到候选化合物的实际活性和计算活性的线性回归，确定回归系 数R 2值最高的模型作为最优药效团模型； (3) 采用步骤（2)中最优药效团模型对SPECS数据库进行虚拟筛选，得到打分值从高到 低排列的前500-1000个化合物，并按打分值由高到低排列为表单； (4) 根据筛选打分值和成药性五倍律原则，手动按顺序选取带有羧基的50-100个化合 物； (5) 对步骤（4)筛选的化合物进行活性初筛，浓度为10 μ Μ刺激STC-1细胞后，筛选出 比阳性对照药GW9508引起更高或相近的ERK磷酸化程度的化合物进行下一步pEC5Q的测 定； (6) pEC5(l值大于阳性对照药GW9508的化合物作为GPR120激动剂。
2. 如权利要求1所述的GPR120激动剂的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中挑 选出PEC50值大于4的27个化合物作为候选化合物。
3. 如权利要求1所述的GPR120激动剂的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中共 得到10个药效团模型。
4. 如权利要求1所述的GPR120激动剂的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤3)得到 打分值较高的500个化合物。
5. 如权利要求1所述的GPR120激动剂的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤3)手动 按顺序选取带有羧基的50个化合物。
【文档编号】C12Q1/02GK104293877SQ201410508486
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】杜吕佩, 李敏勇, 孙金鹏, 李昂 申请人:山东大学