肽的制备方法

专利名称：肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及通过使靶肽以重复连接的前体蛋白质形式稳定地在微生物中表达，然后断裂该前体蛋白的肽键，制备靶肽或其盐的方法。
背景技术：
在合成肽的方法中已知存在有机化学方法、使用酶的方法以及使用基因重组技术的方法等3种方法。
其中，就使用基因重组技术的方法来说，肽通过直接表达方法合成是非常困难的。其理由是即使可以使肽直接表达，但制备的肽会被菌体内的蛋白酶一个一个地迅速分解。
因此，在使用基因重组技术合成肽时，一般都采用以与保护蛋白形成的融合蛋白形式使其表达的融合蛋白法。作为保护蛋白为了使后面的纯化迅速、且有效地进行，使用能够使用亲和层析法的蛋白A、β半乳糖苷酶等有利。但必须从该融合蛋白特异切出靶肽，人们熟知的切出方法有溴化氰(断裂Met的C末端一侧)等化学方法和使用断裂紧接在所谓的肠激酶断裂位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)或因子Xa断裂位点(Ile-Glu-Gly-Arg)的序列之后的C末端一侧等的酶方法。
将作为融合蛋白的保护蛋白FGF突变蛋白(CS23)与作为特异的化学断裂法S-氰化反应组合的新的肽合成法已有报道(EP0887417)。该方法利用CS23对肝素的强亲和力，可以有效、容易地进行融合蛋白的纯化。另外借助于半胱氨酸，通过在该位置的S-氰化反应(对Cys的N末端一侧进行断裂)尝试进行特异断裂，是可以切出靶肽的有用方法，而且也是可能制备很多肽生理活性表达所必需的C末端酰胺体的方法。而该方法可适用于分子内不含有半胱氨酸残基的所有肽。
另一方面，一般来说，融合蛋白法的保护蛋白和靶肽之间的分子量差别大，有时不敢说无浪费地利用微生物(大肠杆菌)的蛋白质合成能力也是事实。在此，尝试将几个靶肽基因串联在一个分子中，在菌体内以稳定前体蛋白形式使其表达，然后切出靶肽的串联重复法，但该成功的例子少。其原因是由于以往切出靶肽的N末端一侧，使其露出的方法(可说是左手剪刀)已知有溴化氰处理、因子Xa法等，而适合用于特异切出C末端，使其露出的方法(可说是右手剪刀)还没有。

发明内容
本发明目的在于提供利用基因重组法能够有效地、而且大量制备靶肽的方法。
本发明人等就特异切该C末端，使其露出的方法进行锐意考察，结果意外地发现与先前叙述的S-氰化反应用于融合蛋白法同样，也可在通过串联重复法进行肽的合成中有效地利用，从而完成了本发明。
就是说，本发明人等成功地获得了在串联重复法中必需的左手用、右手用两个剪刀，特别是到目前为止用基因重组法合成困难的分子量小的肽的有效、且大量制备成为可能(图1)。
这样一来，通过使这两个断裂方法组合，使用串联重复法有效、且大量制备分子量小的肽成为可能(图2)。
即本发明提供(1)靶肽或其盐的制备方法(以下，称为制备法A)，其特征是通过酶或化学方式对在靶肽N末端和C末端附加酶或化学断裂位点并重复连接的前体蛋白进行断裂。
(2)上述1记载的制备方法，其特征是通过酶或化学方式对在靶肽的N末端附加酶或化学断裂位点、在C末端附加化学断裂位点并重复连接的前体蛋白进行断裂。
(3)靶肽或其盐的制备方法(以下，称为制备法B)，其特征是用溴化氰或蛋白水解酶对在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端一侧附加蛋氨酸残基时，肽部分没有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白中的各靶肽的N末端一侧进行断裂，在C末端一侧的半胱氨酸或半胱氨酰肽的N末端一侧进行断裂反应。
(4)上述(1)～(3)记载的制备方法，其中前体蛋白是重组型前体蛋白。
(5)上述(3)记载的制备方法，其中断裂反应是S-氰化反应、然后附加氨分解或水解的反应。
(6)上述5记载的制备方法，其中是在2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)、1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓盐(DMAP-CN)或CN-离子存在下进行S-氰化反应。
(7)上述(3)记载的制备方法，其中蛋白水解酶是肠激酶、因子Xa或凝血酶。
(8)上述(3)记载的制备方法，其中(イ)当使用溴化氰时，在各靶肽的N末端连接蛋氨酸残基，靶肽不含有蛋氨酸残基。
(ロ)当蛋白水解酶为肠激酶时，在各靶肽的N末端连接Asp-Asp-Asp-Asp-Lys等肠激酶断裂位点，靶肽不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys等氨基酸序列。
(ハ)当蛋白水解酶为因子Xa时，在各靶肽的N末端连接Ile-Glu-Gly-Arg等因子Xa断裂位点，靶肽不含有Ile-Glu-Gly-Arg等氨基酸序列。
(ニ)当蛋白水解酶为凝血酶时，各靶肽的N末端连接Gly-Pro-Arg等凝血酶断裂位点，靶肽不含有Gly-Pro-Arg等氨基酸序列。
(9)上述(1)～(3)记载的制备方法，其中靶肽是KiSS-1肽。
(10)上述(1)～(3)记载的制备方法，其中靶肽是GPR8配体。
(11)GPR8配体或其盐的制备方法，其特征是用肠激酶对在GPR8配体的N末端附加肠激酶断裂序列，在C末端附加半胱氨酸残基后，重复连接3次的前体蛋白中的GPR8配体的N末端一侧进行断裂，以及在C末端一侧的半胱氨酸残基的N末端一侧附加断裂反应。
(12)上述(10)或(11)记载的制备方法，其中GPR8配体是含有与序列44表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的多肽。
(13)上述(10)或(11)记载的制备方法，其中GPR8配体是含有序列44、序列45、序列46、序列47、序列48、序列49或序列50表示的氨基酸序列的多肽。
(14)上述(10)或(11)记载的制备方法，其中GPR8配体是含有序列44氨基酸序列的多肽。
(15)一种DNA，含有编码以下前体蛋白的DNA，即，在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端附加蛋氨酸残基时，肽部分不含有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白。
(16)一种重组载体，含有上述(15)记载的DNA。
(17)上述(16)记载的重组载体，保持在用FERM BP-8023标记的转化体大肠杆菌MM294(DE3)/pTCGPR3中。
(18)转化体，用上述(16)记载的重组载体转化。
(19)上述(18)记载的转化体，是用FERM BP-8023标记的转化体大肠杆菌MM294(DE3)/pTCGPR3。
(20)前体蛋白或其盐，是在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端一侧附加蛋氨酸残基时，肽部分不含有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白或其盐。
(21)上述(4)记载的制备方法，其中前体蛋白是对上述(18)记载的转化体进行培养之后制备的重组型前体蛋白。


图1表示本发明的肽制备法的概略图。
图中，向下的箭头为左手用剪刀(N末端切出以及露出方法)-A，向上箭头为右手用剪刀(C末端切出以及露出方法)-B。作为左手用剪刀如通过溴化氰处理、因子Xa法、肠激酶法等在C末端一侧断裂肽，能够使新的N末端露出的酶。这些方法可以断裂Met或Ile-Glu-Gly-Arg、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的C末端一侧，使靶肽的N末端露出。右手用剪刀通过进行S-氰化，断裂Cys的N末端一侧，使靶肽C末端露出。
图2表示本发明的肽制备法的概略图。
图3表示使用本发明肽制备法的KiSS-1肽制备法概略图。
XxxMet(溴化氰)或Ile-Glu-Gly-Arg(因子Xa)，Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(肠激酶)等。
但是，(Xxx)一般来说当靶肽含有Met时除了使用因子Xa或肠激酶进行断裂之外，而对于(本KiSS-1肽的场合可以不考虑)。①当靶肽不含有Pro时，使用脯氨酸特异的内肽酶，②当靶肽不含有Lys时使用赖氨酰内肽酶，③当靶肽不含有Arg时，使用精氨酰内肽酶，④当靶肽不含有Glu和Asp时，使用V8蛋白水解酶，⑤当靶肽不含有碱性氨基酸时，使用胰蛋白酶，⑥当靶肽不含有芳香族氨基酸时，使用胰凝乳蛋白酶。
图4表示对实施例1～3中制备的hGPR8L(序列44)对GPR8表达CHO细胞的GTPγS结合活性进行测定的结果。横轴表示hGPR8L的浓度，纵轴表示GTPγS结合活性。-●-表示使用合成的hGPR8L(序列44)时的结果，-○-表示用本发明的肽制备方法(串联重复法)制备的hGPR8L(序列44)时的结果。
具体实施例方式
在本发明方法中，作为靶肽(有时简单称为“靶肽”)只要是分子内不含有切出中使用的方法涉及到的断裂部位的肽，无论什么样的肽都可以，其氨基酸序列只要是通过基因重组技术可以生产的无论什么样的序列都可以。
靶肽的氨基酸残基的数目没有特别限定，但通常约为10～100个左右，约10～50个左右比较好，约20～40个左右更好。
靶肽的分子量也没有特别限定，通常约1000～10000道尔顿，约1000～5000道尔顿比较好，约2000～4000道尔顿更好。
作为靶肽的具体例子如KiSS-1肽(WO00/24890)、RFRP-1(WO00/29441)、Apelin(WO99/33976)、PrRP(WO97/24436)、GALP(WO99/48920)、GPR8配体(W01/98494)、血管紧张素、缓激肽、降钙素、蜗牛毒素、促皮质素释放因子、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、促生长激素神经肽、促胃液素、胰高血糖素、生长激素释放因子、FMRF-酰胺、神经激肽、神经介素、神经肽、nociceptin、nocistatin、阿立新-B、胰泌素、底物P、urocortin、VIP、PACAP、ACTH、各种类鸦片肽类和上述的肽段等，其中KiSS-1肽、RFRP-1、GPR8配体、Apelin、PrRP、GALP等最好。
靶肽按照肽标记的惯例，左端为N末端(氨基端)，右端为C末端(羧基端)。
作为KiSS-1肽可以使用例如WO00/24890记载的人KiSS-1肽，具体来说，在序列1给出的由54个氨基酸残基构成的氨基酸序列中，如含有从N末端开始的第47～54的氨基酸序列，由8至54个氨基酸残基构成的肽等。
作为“在序列1给出的氨基酸序列中，含有从N末端第47～54的氨基酸序列，由8至54个氨基酸残基构成的肽”，只要是含有从序列1氨基酸序列中的N末端开始的第47～54的氨基酸序列，而且由8至54个氨基酸残基构成的肽，无论什么样的肽都可以，这意味着肽具有的活性(例如，肽与受体的结合活性、由肽引起的受体表达细胞的细胞刺激活性等)等实质上是同样的。具体来说，可以使用①序列1氨基酸序列表示的肽，②在C末端含有从本申请序列1氨基酸序列的N末端开始的第47～54位的氨基酸序列，由8至54个氨基酸残基构成的肽等。
更具体地讲，作为KiSS-1肽如①序列1氨基酸序列表示的肽，②由从序列1氨基酸序列的N末端开始的第40～54位构成的氨基酸序列表示的肽，③由从序列1氨基酸序列的N末端开始的第45～54位构成的氨基酸序列(序列2表示的氨基酸序列)表示的肽，④由从序列1氨基酸序列的N末端开始的第46～54位构成的氨基酸序列表示的肽，⑤由从序列1氨基酸序列的N末端开始的第47～54位构成的氨基酸序列表示的肽，⑥由从序列1氨基酸序列的N末端开始的第35～54位构成的氨基酸序列表示的肽等。
上述KiSS-1肽对WO00/24890记载的受体蛋白OT7T175具有配体活性。
作为上述RFRP-1，如Hinuma et al.，Nature Cell Biology，Vol 2，p703-708(2000)记载的RF amide-related peptides或WO00/29441记载的多肽等，具体的如只要含有序列1或序列9表示的氨基酸序列，对Hinuma etal.，Nature Cell Biology，Vol 2，p703-708(2000)或WO00/29441记载的受体OT7T022具有配体活性的肽无论什么样肽都可以。
更具体来说，可以使用含有序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11的氨基酸序列的多肽等。
作为Apelin，如Biochem Biophys.Res.Commun.，251，471-476，(1998)记载的Apelin-36(含有序列18氨基酸序列的多肽)，Apelin-13(含有序列18中第24～36位的氨基酸序列的多肽)，Apelin-13的N末端的氨基酸(Gln)进行了焦谷氨酸化的肽等，只要是对其受体APJ(O’Dowd，B.F.，et al.，Gene，436，355-359，1993)具有配体活性的肽，无论什么样肽都可以。具体的如WO99/33976记载的“含有与序列3表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列、对受体蛋白具有结合能力的多肽”等。
作为PrRP(19P2配体)，如可以使用WO97/24436记载的多肽，具体的如与牛19P2L(b19P2L或牛PrRP)(序列20)、大鼠19P2L9(r19P2L或大鼠PrRP)(序列21)、人19P2L(h19P2L或人PrRP)(序列22)相同或实质上相同的肽或它们的酰胺、酯或它们的盐等。
所谓「实质上同质」表示受体结合活性等性质上相同。因此受体结合活性的强度等强弱、肽的分子量等量的要素即使不同也可以。
例如，除了含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列的肽等之外，如含有与序列20、序列21或序列22表示的氨基酸序列的同源性分别为约50～99.9％(70～99.9％比较好，80～99.9％更好，90～99.9％最好)的氨基酸序列，具有与含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列的肽实质上同质的活性的肽等(但，该肽为氨基酸序列中不含有半胱氨酸的肽)。
作为与含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列的肽实质上相同的肽的更具体例子如含有序列23(序列23中，第10位的Xaa代表Ala或Thr、第11位的Xaa代表Gly或Ser、第21位的Xaa代表OH、Gly或Gly-Arg)记载的部分肽的肽等。
更具体的例子如含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列中的1个以上15个以下、比较好的是1个以上10个以下、更好的是1个以上5个以下氨基酸缺失的氨基酸序列；在序列20、在序列21或序列22氨基酸序列中附加1个以上80个以下、比较好的是1个以上50个以下、更好的是1个以上10个以下氨基酸的氨基酸序列；在序列20、序列21或序列22氨基酸序列中1个以上15个以下、比较好的是1个以上10个以下、更好的是1个以上5个以下的氨基酸用其它氨基酸置换的氨基酸序列的肽等。
更具体的例子如含有序列23、序列24、序列25、序列26、序列27、序列28、序列29、序列30、序列31、序列32、序列33、序列34、序列35、序列36、序列37、序列38、序列39、序列40、序列41、序列42、序列43氨基酸序列的肽等。
另外在本发明的PrRP中也含有Gln的N端一侧在生物体内被断裂，该Gln进行焦谷氨酸化的产物等。
作为GALP可以使用WO99/48920记载的肽。
作为GPR8配体只要是具有对7次穿膜受体蛋白GPR8(O’Dowd，B.F.etal.、Genomics、28卷、84-91页、1995年)有配体活性、例如与GPR8的结合活性、对GPR8表达细胞的细胞刺激活性(例如，促进花生四烯酸游离、乙酰胆碱游离、细胞内Ca2+游离、细胞内cAMP生成、肌醇磷酸产生、细胞膜电位变动、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的活化、pH降低、GTPγS结合活性等的活性)的多肽，无论什么样的肽都可以，例如可以使用WO01-98494记载的肽等。
作为针对GPR8的配体多肽的更具体的例子如含有与序列44氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的多肽等。
作为实质上与序列44表示的氨基酸序列相同的氨基酸序列，如序列45氨基酸序列、序列46氨基酸序列、序列47氨基酸序列、序列48氨基酸序列、序列49氨基酸序列以及序列50氨基酸序列等。
作为含有与序列44表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的多肽的具体例子如①含有序列44氨基酸序列的GPR8配体、②含有序列45氨基酸序列的GPR8配体、③含有序列46氨基酸序列的GPR8配体、④含有序列47氨基酸序列的GPR8配体、⑤含有序列48氨基酸序列的GPR8配体、⑥含有序列49氨基酸序列的GPR8配体、⑦含有序列50氨基酸序列的GPR8配体等。
作为靶肽的盐，可以使用与生理学上可接受的碱(例如碱金属等)或酸(有机酸、无机酸)形成的盐，当然是生理学上可接受的加酸盐好。作为这样的盐可以使用例如与无机酸(例如盐酸、磷酸、溴氢酸、硫酸)形成的盐，或与有机酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
在本发明的制备方法A中，作为可附加在靶肽的N末端的酶的断裂位点，如(1)作为蛋白水解酶的肠激酶的断裂位点的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(序列58)(由含有碱基序列GATGACGACGACAAG(序列59)的DNA编码的)等。
(2)作为蛋白水解酶因子Xa的断裂位点的Ile-Glu-Gly-Arg(序列60)(由含有碱基序列ATTGAAGGCCGC(序列61)的DNA编码的)等。
(3)作为蛋白水解酶凝血酶的断裂位点的Gly-Pro-Arg(序列62)(由含有碱基序列GGCCCGCGC(序列63)的DNA编码的)等。
作为可附加在靶肽的N末端的化学断裂位点，如作为溴化氰断裂位点的蛋氨酸残基等。
作为可附加在靶肽的C末端的化学断裂位点，如半胱氨酸残基或半胱氨酰肽等。
半胱氨酰肽的肽部分由1个或2个以上(例如1～5个左右)的氨基酸残基构成。氨基酸的种类没有特别限定，Gly、Ala、Ser、Leu等最好。而半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同。另外当靶肽的N末端附加了蛋氨酸残基时(使用溴化氰时)，半胱氨酰肽的肽部分不含有蛋氨酸残基。
所谓在靶肽的N末端和C末端附加酶或化学断裂位点并重复连接的前体蛋白(含有前体肽)，是指在靶肽的N末端和C末端附加酶和化学断裂位点的肽被重复连接2个以上(例如2～100个，2～20个比较好，2～10个更好)的蛋白质。
在本发明的制备方法B中，所谓在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端附加蛋氨酸残基时(使用溴化氰时)，肽部分不含有蛋氨酸残基)之后重复连接的前体蛋白(也包括前体肽)，可以是2个以上(例如2～100个，2～20个比较好，2～10个更好)的上述靶肽的N末端含有蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂位点，而C末端含有半胱氨酸残基或半胱氨酰肽、进而末端还可以含有氨基酸残基的蛋白质重复连接的蛋白质。
蛋白水解酶断裂序列和半胱氨酰肽与上述同样。
本发明的制备法A或B使用的这些前体蛋白最好是利用基因工程手法制备的重组型前体蛋白质。
该重组型蛋白质例如可以通过对下面提到的含有编码前体蛋白质的DNA的载体的转化体进行培养，使该前体蛋白表达来制备。
编码前体蛋白的DNA只要是编码上述前体蛋白，无论什么样的都可以，通过化学方法合成整个碱基序列也可以。作为该场合的制备方法，例如可以使用众所周知的磷酰胺法、磷酸三酯法、二酯法、氢膦酸酯等，如果是短的序列可以一次合成，如果是长的序列，可以分开合成后，再用T4DNA连接酶连接制作。
作为用于制备编码前体蛋白的DNA所使用的编码各靶肽的DNA可以使用众所周知的DNA，也可以使用众所周知的方法进行克隆。DNA的碱基序列只要是编码各靶肽的DNA，可以是天然型的碱基序列，也可以是将天然型的碱基序列中的密码子换成编码同一氨基酸的其它密码子后的碱基序列。
编码靶肽N末端和C末端附加酶或化学断裂位点之后重复连接的前体蛋白的DNA，是使编码酶或化学断裂位点的碱基序列结合于编码各靶肽的DNA碱基序列的5′端以及3′端，以串联重复序列构建的。
编码靶肽N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质分解酶断裂序列、C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽后反复连接的前体蛋白质的DNA，是通过使编码用于肽键的N末端一侧断裂反应的溴化氰或蛋白水解酶的断裂位点的碱基序列结合在编码各靶肽的DNA的碱基序列的5′端一侧，再使编码利用1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓盐(DMAP-CN)进行S-氰化反应后通过氨分解或水解进行断裂的位点的碱基序列(例如，编码半胱氨酸的TGT或TGC，编码半胱氨酰肽的碱基序列)结合在编码各靶肽的DNA的碱基序列的3′端，以重复序列形式构建的。
另外前体蛋白的C末端可以是半胱氨酸残基或半胱氨酰肽中的任一种。
作为编码KiSS-1肽的DNA，只要是编码上述KiSS-1肽的DNA，无论什么样的都可以，例如①作为编码含有序列1氨基酸序列的人KiSS-1肽的DNA可以使用含有序列3碱基序列的DNA，②作为编码含有序列2氨基酸序列的KiSS-1(45-54)肽的碱基序列可以使用含有序列4碱基序列的DNA等。另外，即使将密码子适当地换成编码同一氨基酸的其它密码子也可以。
作为本发明方法中使用的含有编码KiSS-1肽的DNA的DNA的具体例子，如含有下述碱基序列(序列5)的DNA等。
GGTAGCGCGA TGTATAACTG GAACAGCTTT GGTCTGCGTT TTTGTGGCTCGGCGATGTAC AATTGGAATT CCTTCGGCCT GCGCTTCTGC GGCTCGGCGATGTATAACTG GAACTCCTTT GGCCTGCGCT TTTGCGGTTC TGCT该碱基序列是在编码KiSS-1(45-54)肽的序列4碱基序列的5′端结合编码溴化氰断裂位点的碱基序列(ATG)，以及其3′端结合编码1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓盐(DMAP-CN)的断裂位点的碱基序列(TGT)的产物。通过将该碱基序列重复连接，可以制备编码KiSS-1肽的前体蛋白的DNA。
作为编码RFRP-1的DNA，只要是编码RFRP-1的DNA，无论什么样的都可以，例如①作为编码含有序列6氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列12碱基序列的DNA，②作为编码含有序列7氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列13碱基序列的DNA，③作为编码含有序列8氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列14碱基序列的DNA，④作为编码含有序列9氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列15碱基序列的DNA，⑤作为编码含有序列10氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列16碱基序列的DNA，⑥作为编码含有序列11氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列17碱基序列的DNA。
作为编码Apelin的DNA，只要是编码上述的Apelin的DNA，无论什么样的都可以，例如①作为作为编码含有序列18氨基酸序列的Apelin的DNA可以使用含有序列19碱基序列的DNA等。
作为编码PrRP的DNA，只要是编码上述PrRP的DNA，无论什么样的都可以，具体来说可以使用WO97-24436号记载的DNA。
作为编码GALP的DNA，只要是编码上述GALP的DNA，无论什么样的都可以，具体来说可以使用WO99/48920号记载的DNA。
作为编码GPR8配体的DNA，只要是编码GPR8配体的DNA，无论什么样的都可以，例如①作为编码含有序列44氨基酸序列的GPR8配体的DNA可以使用含有序列51碱基序列的DNA，②作为编码含有序列45氨基酸序列的GPR8配体的DNA可以使用含有序列52碱基序列的DNA，③作为编码含有序列46氨基酸序列的GPR8配体的DNA可以使用含有序列53碱基序列的DNA，④作为编码含有序列47氨基酸序列的GPR8配体的DNA可以使用含有序列54碱基序列的DNA，⑤作为编码含有序列48氨基酸序列的GPR8配体的DNA可以使用含有序列55碱基序列的DNA，⑥作为编码含有序列49氨基酸序列的GPR8配体的DNA可以使用含有序列56碱基序列的DNA。⑦作为编码含有序列50氨基酸序列的GPR8配体的DNA可以使用含有序列57碱基序列的DNA。
作为本发明方法中使用的含有编码GPR8配体的DNA的DNA的具体例子如含有下述碱基序列(序列64)的DNA等。
GATGACGATG ACAAATGGTA TAAACATGTG GCGAGCCCGC GTTATCATAC
CGTGGGCCGC GCGGCCGGTC TGCTGATGGG CCTGTGTCAA TTGGGTGGTGATGACGATGA CAAATGGTAT AAACATGTGG CGAGCCCGCG TTATCATACCGTGGGCCGCG CGGCCGGTCT GCTGATGGGC CTGTGTGAGC TCGGCTCTGACGACGATGAT AAATGGTACA AACACGTTGC CTCCCCGCGC TACCACACGGTTGGTCGTGC CGCGGGCCTG CTGATGGGTC TGTGCGGT该碱基序列是在编码GPR8配体(23个残基)肽的序列44碱基序列的5′端结合了编码肠激酶断裂序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；序列58)的碱基序列(序列59)，其3′端结合了编码1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓盐(DMAP-CN)的断裂位点的碱基序列(TGT)的产物。通过将该碱基序列重复连接，可以制备编码GPR8配体(23个残基)的前体蛋白的DNA。
而利用以往的基因技术，例如位点特异性诱变技术可以将编码重复连接靶肽的前体蛋白的DNA变换为编码靶肽的突变蛋白的DNA。
位点特异性诱变技术众所周知，在Lather，R.F.以及Lecoc，J.P.，GeneticEngineering，Academic press社(1983年)第31-50页等有报道。寡核苷酸指导的诱变在Smith，M.和Gillam.S.Genetic Engineering，原理和方法，Plenum社(1981年)3卷1-32页等有报道。
用作含有编码前体蛋白的DNA的载体的质粒的例子，如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的pBR322[Gene，2，95(1977)]，pBR313[Gene，2，75(1977)]、pBR324、pBR325[Gene，4，124(1978)]、pBR327，pBR328[Gene，9，287(1980)]、pBR329[Gene，17，79(1982)]、pKY2289[Gene，3，1(1978)]、pKY2700[生化学，52，770(1980)]、pACYC177，pACYC184[Journal of Bacteriology，134，1141(1978)、pKR248，pKR 646，pDF[Methods in Enzymology，68，268(1979)]，pUC18、pUC19[Yanisch-perron等，Gene，33，103(1985)]等。
另外如使用噬菌体，例如λ噬菌体的λgt系的λgt？λC[Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.71，4579(1974)]，·t？λB[Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.72，3461(1975)]、λDam[Gene，1，255(1977)]和卡隆(charon)载体[Science，196，161(1977)，Journal of Virology，29，555(1979)]、使用纤维状噬菌体的mp系mp18、mp19[Yanisch-perron等，Gene，33，103(1985)]载体等。
上述DNA最好是在ATG上游含有启动子，该启动子只要是与转化体制备中使用的宿主相对应的适当的启动子，无论什么样的都可以。例如，宿主为大肠杆菌(Escherichiacoli)时，使用trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、Ipp启动子、T7启动子等。
使用T7启动子系列时，作为T7启动子可以是T7DNA中发现的17种启动子[J.L.Oakley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74，4266-4270(1977)，M.D.Rosa，Cell 16815-825(1979)，N.Panayotatos等，Nature，28035(1979)，J.J.Dunn等，J.Mol.Biol.，166477-535(1983)]中的任一种，但最好是φ10启动子[A.H.Rosenberg等，Gene，56125-135(1987)]。
作为转录终止子可以使用在大肠杆菌系中起作用的终止子，最好是Tφ10终止子[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.，189113-130(1986)]等。
作为T7RNA聚合酶DNA可以使用T7DNA[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.，189113-130(1986)]等。
载体最好是在上述载体中整合了T7启动子、T7终止子后构建的载体，作为这样的载体可以使用pET-1、pET-2、pET-3、pET-4、pET-5[A.H.Rosenberg等，Gene，56125-135(1987)]等，最好是使用pTB960-2[EP-A-499990]。
转化体可以通过众所周知的方法用上述方法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，2110(1972)]得到的表达用质粒转化宿主制备。
作为被转化的微生物宿主的例子如大肠杆菌(E.coli)，具体可以使用大肠杆菌(Escherichia coli)K12DH1[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.60，160(1968)]，JM-103[Nucleic Acids Research，9，309(1981)]，JA221[Journal of Molecular Biology，120，517(1978)]，HB101[Journal of MolecularBiology，41，459(1969)]，C600[Genetic，39，440(1954)]，N4830[Cell，25，713(1981)]，K-12MM294[Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.73，4174(1976)]BL-21等。
使用T7启动子系列时，作为其转化体的宿主，可以使用整合了T7RNA聚合酶DNA(T7DNA1)[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.，189113-130(1986)]的大肠杆菌菌株(例如，MM294，DH-1，C600，JM109，BL21)，将T7RNA聚合酶DNA(T7DNA1)与其它的质粒一起整合的大肠杆菌菌株等。最好使用整合了T7DNA1的λ噬菌体溶原化的MM294株和BL21株。此时作为T7DNA1的启动子可以使用用异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(有时省略为IPTG)诱导表达的lac启动子。
重组型前体蛋白可以在培养基中对上述转化体进行培养，通过收集产生的重组型前体蛋白进行制备。
培养基的pH希望为约6～8。作为对大肠杆菌属菌进行培养时的培养基，例如，理想的是含有葡萄糖、酪蛋白氨基酸的M9培养基[Miller，Journalof Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring HarborLaboratory，New York 1972]。此时根据需要，例如可以添加用于使启动子有效地发挥作用的象3β-吲哚丙稀酸或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷那样的药物。
宿主是大肠杆菌属时，培养通常是在约15～43℃下进行约3～24小时，根据需要也可以加上通气和搅拌。
当使用T7启动子系时，(1)当使连接在lac启动子下游的T7DNA(RNA聚合酶DNA)表达时，通过添加IPTG等，或(2)当使连接在λPL启动子下游连接的T7DNA(RNA聚合酶DNA)表达时，通过使培养的温度上升等，由生成的T7噬菌体RNA聚合酶1特异地使T7启动子发挥作用。
培养后，通过众所周知的方法收集菌体，例如悬浮于缓冲液之后，进行诸如蛋白变性剂处理、超声处理或溶菌酶等酶处理、玻璃球处理、弗氏压碎机处理、冻融处理等，破碎菌体，虽然通过离心分离等众所周知的方法可获得包涵体或可溶成分(上清)，但包涵体形式是所希望的。
上述得到的包涵体使用变性剂进行溶解，可以进入到下面的工序。在从上清对重组型前体蛋白进行分离时，可以利用通常都知道的蛋白质纯化方法。例如可以将凝胶过滤法、离子交换层析、吸附层析、高效液相色谱层析、亲和层析、疏水层析、电泳等适当组合用于纯化工作。另外该前体蛋白不进行纯化，或以部分纯化的状态也可进入到下面的工序。
在对经上述操作得到的重组型前体蛋白中的各靶肽的N末端一侧进行断裂反应时，使用溴化氰或蛋白水解酶等。
作为蛋白水解酶只要是已知的蛋白水解酶无论哪一种都可以，例如肠激酶、因子Xa、凝血酶等比较好，特别是使用肠激酶、因子Xa更好。
相对于每1mg重组型多肽，蛋白水解酶使用量通常为0.01单位到约100单位，约0.1单位至约10单位更好。
在该断裂反应中使用溴化氰时，将作为溴化氰断裂位点的蛋氨酸残基连接在重组型前体蛋白质中靶肽的N末端。而此时最好是靶肽不含有蛋氨酸残基。
作为蛋白水解酶使用肠激酶时，将代表肠激酶断裂位点的序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；序列54)等连接在重组型前体蛋白质中靶肽的N末端。而此时靶肽最好是不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys等氨基酸序列的肽。
作为蛋白水解酶使用因子Xa时，将代表因子Xa断裂位点的序列(Ile-Glu-Gly-Arg，序列56)等连接在重组型前体蛋白质中的靶肽的N末端。而此时靶肽最好是不含有Ile-Glu-Gly-Arg氨基酸序列的肽。
作为蛋白水解酶使用凝血酶时，将凝血酶断裂位点的序列(Gly-Pro-Arg，序列58)等连接在重组型前体蛋白质中靶肽的N末端。而此时靶肽最好是不含有Gly-Pro-Arg氨基酸序列的肽。
用蛋白水解酶进行肽键的断裂反应的反应温度通常约0℃～60℃，最好是0℃～40℃。
使用的溶剂没有特别限定，例如Tris-HCl缓冲液、Tris-醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液等。
该反应中pH通常约1～12，最好是约4～8。
重组型前体蛋白质中靶肽的C末端一侧的断裂反应例如可以使用EP887417记载的方法进行。即在重组型前体蛋白质中靶肽的C末端一侧附加断裂反应。
作为该断裂反应例如S-氰化反应后进行水解反应。当作为最终产物要得到靶肽的酰胺或它的盐时，作为该断裂反应，例如可先进行S-氰化反应，然后进行氨分解反应。该S-氰化反应可以通过使S-氰化试剂作用于原料化合物来进行。
作为S-氰化试剂例如2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)、1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓盐(DMAP-CN)或CN-离子等。
该S-氰化试剂的量其摩尔数为总巯基的约2倍至50倍的量，最好是约5倍～10倍量。
反应温度只要是处于约0℃～80℃之间，哪一个温度都可以，处于约0℃～50℃之间更好。作为使用的溶剂只要是与S-氰化试剂不反应的溶剂，无论哪一种缓冲液都可以，例如Tris-HCl缓冲液、Tris-醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液等。另外有机溶剂只要是与S-氰化试剂不反应的溶剂，也可以存在。
该反应在pH1～12之间进行比较好。特别是在使用NTCB时，pH7～10比较好，使用DMAP-CN时为防止S-S交换反应，pH2～7之间比较好。另外在反应液中即使存在盐酸胍等变性剂也可以。
作为上述氨分解或水解反应，例如附加碱处理。
该碱处理是通过将含有原料的水溶液的pH调到7～14来进行的。
该pH的调整可以通过将适量的氨、氢氧化钠、氨基化合物、Trizma Base(三[羟甲基]-氨基甲烷)、磷酸氢二钠、氢氧化钾、氢氧化钡等溶液加入到含有原料化合物的水溶液中，氨特别好。
作为上述反应时的溶液的浓度，例如在使用氨或氨基化合物时约0.01～15N，0.1～3N最好，使用氢氧化钠时约0.01～2N，0.05～1N最好，使用Trizma Base时约1mM～1M，20mM～200mM最好，使用磷酸氢二钠时约1mM～1M，10mM～100mM最好，使用氢氧化钾时约0.01～4N，0.1～2N最好，反应温度只要是处于约-20℃～80℃之间，哪一个温度都可以，处于约-10℃～50℃之间更好。
反应时间，S-氰化反应约为1～60分钟，最好是约15～30分钟；水解反应约5分钟～100小时，最好是约10～15小时；氨分解反应约5分钟～24小时，最好是约10～180分钟。
作为该氨基化合物如以R1-(NR2)-H(式中R1和R2相同或不同，代表(i)氢原子，(ii)C1-20烷基，C3-8环烷基，C6-14芳(aryl)基或C6-14芳基-C1-3烷基(这些基团在碳原子上可以不含有取代基或含有1～3个氨基、羟基等)、(iii)可以被取代的氨基，(iv)羟基或C1-6烷氧基。)式表示的化合物等。
为了对通过该断裂反应切出的靶肽进行分离，可以依据通常都知道的肽的纯化方法。例如可以将凝胶过滤法、离子交换层析、高效液相色谱层析、亲和层析、疏水层析、薄层层析、电泳等适当组合用于纯化。
另外，该靶肽根据需要也可以通过冷冻干燥将它做成粉末。在进行冷冻干燥时，可以加山梨糖醇、甘露糖醇、右旋糖、麦芽糖、海藻糖、甘油醛等稳定剂。
用本发明制备方法得到的靶肽的C末端可以是酰胺(-CONH2)、羧基(-COOH)、羧酸盐(-COO-)、烷酰胺(-CONHR)或酯(-COOR)。作为酯或烷酰胺的R如甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基等C1-6烷基；环戊基、环己基等C3-8环烷基；苯基、α-萘基等的C6-12芳基；苄基、苯乙基、二苯甲基等苯-C1-2烷基；或α-萘甲基等的α-萘基-C1-2烷基等的C7-14芳烷基之外，作为口服用酯被广泛使用的三甲基乙酰氧甲基等。
用本发明制备方法得到的靶肽、或其酰胺、或其酯、或其盐可以与灭菌水、人血清清蛋白(HSA)、生理盐水以及众所周知的生理学上可接受的载体混合，作为安全的药物，可以对哺乳动物(例如，人、猴、牛、马、山羊、猪、大鼠、小鼠、土拨鼠等)通过非口服或局部给药。例如1天给药量每人约0.01mg～约50mg、最好是约0.1mg～10mg，通过静脉或肌肉注射非口服方式给药。
含有本发明靶肽的制剂也可以含有盐、稀释剂、佐剂、其它载体、缓冲液、结合剂、表面活性剂、保存剂那样生理上可接受的溶剂。非口服给药制剂可以使用与灭菌水溶液或生理学上可接受的溶剂形成的悬浮液针剂、或以用生理学上可接受的稀释液在用时稀释后可以使用的灭菌粉末(通常对肽溶液进行冷冻干燥后得到)安瓿[剂]提供。
在本说明书以及附图中，氨基酸、肽、保护基团、活性基团、以及其它分子用略号表示时，它们都来自IUPAC-IUB(Commission onBiochemical Nomenclature)的略号或该领域中惯用的略号，以下给出了一些例子。氨基酸等有时存在光学异构体，没有特别指出时，都表示L异构体。
DNA脱氧核糖核酸
A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶RNA核糖核酸EDTA乙二胺四乙酸Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val缬氨酸Leu亮氨酸Ile异亮氨酸Ser丝氨酸Thr苏氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Asp天冬氨酸Lys赖氨酸Arg精氨酸His组氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬酰胺Gln谷氨酰胺ATP腺苷三磷酸T7PT7启动子T7TT7终止子本说明书的序列号代表以下序列。
表示人KiSS-1肽的氨基酸序列。
表示人KiSS-1(45-54)肽的氨基酸序列。
表示编码序列1给出的人KiSS-1肽的DNA碱基序列。
表示编码序列2给出的人KiSS-1(45-54)肽的DNA碱基序列。
表示含有编码人KiSS-1(45-54)肽的前体蛋白DNA的DNA碱基序列。
表示由9个氨基酸残基构成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由12个氨基酸残基构成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由20个氨基酸残基构成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由37个氨基酸残基构成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由9个氨基酸残基构成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由17个氨基酸残基构成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示编码序列6氨基酸序列表示的肽的DNA的碱基序列。
表示编码序列7氨基酸序列表示的肽的DNA的碱基序列。
表示编码序列8氨基酸序列表示的肽的DNA的碱基序列。
表示编码序列9氨基酸序列表示的肽的DNA的碱基序列。
表示编码序列10氨基酸序列表示的肽的DNA的碱基序列。
表示编码序列11氨基酸序列表示的肽的DNA的碱基序列。
表示apelin-36的氨基酸序列。
表示编码apelin-36的DNA碱基序列。
表示马PrRP的氨基酸序列。
表示大鼠PrRP的氨基酸序列。
表示人PrRP的氨基酸序列。
表示与含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列的肽实质上相同的肽的具体例子。
表示WO97/24436记载的对来自牛丘脑下部配体多肽进行纯化，对P-3级分的N末端序列进行分析后得到的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的对来自牛丘脑下部配体多肽进行纯化，对P-2级分的N末端序列进行分析后得到的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的来自牛丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的来自牛丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的来自牛丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的来自牛丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的来自牛丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的来自牛丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的大鼠型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的大鼠型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的大鼠型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的大鼠型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的大鼠型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的大鼠型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的人型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的人型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的人型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的人型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的人型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436记载的人型丘脑下部配体多肽的氨基酸序列。
表示相对GPR8的配体多肽(人型·1-23)的氨基酸序列。
表示相对GPR8的配体多肽(猪型·1-23)的氨基酸序列。
表示相对GPR8的配体多肽(大鼠·小鼠型·1-23)的氨基酸序列[序列47]表示相对GPR8的配体多肽(人型·1-30)的氨基酸序列。
表示相对GPR8的配体多肽(猪型·1-30)的氨基酸序列。
表示相对GPR8的配体多肽(大鼠型·1-30)的氨基酸序列。
表示相对GPR8的配体多肽(小鼠型·1-30)的氨基酸序列。
表示编码对于GPR8的配体多肽(人型·1-23)的DNA的碱基序列。
表示编码对于GPR8的配体多肽(猪型·1-23)的cDNA的碱基序列。
表示编码对于GPR8的配体多肽(大鼠·小鼠型·1-23)的DNA的碱基序列。
表示编码对于GPR8的配体多肽(人型·1-30)的DNA的碱基序列。
表示编码对于GPR8的配体多肽(猪型·1-30)的DNA的碱基序列。
表示编码对于GPR8的配体多肽(大鼠型·1-30)的DNA的碱基序列。
表示编码对于GPR8的配体多肽(小鼠型·1-30)的DNA的碱基序列。
表示代表肠激酶断裂序列的氨基酸序列。
表示编码肠激酶断裂序列的DNA的碱基序列。
表示代表因子Xa酶断裂序列的氨基酸序列。
表示编码因子Xa酶断裂序列的DNA的碱基序列。
表示代表凝血酶断裂序列的氨基酸序列。
表示编码凝血酶断裂序列的DNA的碱基序列。
表示含有编码人GRPR8配体(序列44)的前体蛋白DNA的DNA碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
表示在实施例1的结构基因制备中使用的DNA寡聚物的碱基序列。
在以下实施例1中得到的转化体大肠杆菌(Escherichia coli)MM294(DE3)/pTCGPR3，从平成14(2002)年4月17日开始以寄存号FERMBP-8023寄存于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)的独力行政法人产业技术综合研究所特许生物寄存中心，从平成14(2002)年3月14日开始以寄托号IFO 16773寄存于大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17番85号(邮政编码532-8686)的财团法人·发酵研究所(IFO)。
以下给出实施例，对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1(a)编码人GPR8配体(hGPR8L；序列44)3次串联的基因的制备利用以下所示的10种DNA片段(序列表中序列65～74)制备编码人hGPR8L配体3次串联的结构基因。
#15’-TATGGATGACGATGACAAATGGTAAAAACATGTGGCGAGCCCGCGTTATCATACCG(序列65)#25’-GCGCGGCCCACGGTATGATAACGCGGGCTCGCCACATGTTTATACCATTTGTCATCGTCATCCA(序列66)#35’-TGGGCCGCGCGGCCGGTCTGCTGATGGGCCTGTGTCAATTGGGTTTGAACTTCTCTGTCTCCGCCGCCGGAG(序列67)#45’GATCCTCCGGCGGCGGAGACAGAGAAGTTCAAACCCAATTGACACAGGCCCATCAGCAGACCGGCC(序列68)#55’-
AATTGGGTGGTGATGACGATGACAAATGGTATAAACATGTGGCGAGCCCGCGTTATCATACCG(序列69)#65’-CGGCCCACGGTATGATAACGCGGGCTCGCCACATGTTTATACCATTTGTCATCGTCATCACCACCC(序列70)#75’-TGGGCCGCGCGGCCGGTCTGCTGATGGGCCTGTGTGAGCTCGGCTCTGACGACGATGATAAATGGTAC(序列71)#85’-CAACGTGTTTGTACCATTTATCATCGTCGTCAGAGCCGAGCTCACACAGGCCCATCAGCAGACCGGCC(序列72)#95’-AAACACGTTGCCTCCCCGCGCTACCACACGGTTGGTCGTGCCGCGGGCCTGCTGATGGGTCTGTGCGGTTGAG(序列73)#105’-GATCCTCAACCGCACAGACCCATCAGCAGGCCCGCGGCACGACCAACCGTGTGGTAGCGCGGGGAGG(序列74)使#2和#3的各个DNA寡聚物于25μl的磷酸化反应液[DNA寡聚物10μg、50mMTis-HCl，pH7.6，10mM MgCl2、1mM精脒、10mM二硫苏糖醇(以后略记为DTT)、0.1mg/ml牛血清清蛋白(以后略记为BSA)、1mMATP、10单位T4聚核苷酸激酶(宝酒造)]中在37℃下反应1小时，对各个寡聚物的5′末端进行磷酸化。进行酚处理后，加2倍量的乙醇，于-70℃下冷却后，经离心使DNA沉淀。
上述得到的DNA片段和#1以及#4合并，使总体积为120μl。将该混合液于90℃下保持10分钟，然后慢慢冷却到室温进行退火后，使用TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)进行连接反应。将II液30μl加到退火液30μl中，充分混合后，加入I液60μl于16℃下反应1小时，进行连接。进行酚处理后，回收水层，加入2倍量的乙醇，冷却到-70℃后，离心使DNA沉淀。这样得到的DNA片段利用T4聚核苷酸激酶(宝酒造)进行磷酸化，做成结构基因。
表达用的载体pTCII(WO00/20643)用NdeI和BamHI(宝酒造)于37℃下消化4小时后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后使用QIAquick GelExtraction Kit(QIAGEN公司)提取4.4kb的DNA片段，溶解于25μl的TE缓冲液中。使用TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)对上述pTCII的NdeI、BamHI片段和上述制备的结构基因进行连接反应。使用10μl该反应液转化大肠杆菌JM109感受态细胞(东洋纺)，接种到含有10μg/ml的四环素的LB琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，选择活的四环素抗性菌落。将该转化体于LB培养基中培养过夜，使用QIAprep8Miniprep Kit(QIAGEN公司)制备质粒pTCGPR 1。将该pTCGPR 1用MunI以及BamHI(宝酒造)于37℃下消化4小时后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)提取4.4kb的DNA片段，溶解于25μl的TE缓冲液中。
#6、#7、#8、#9的各个DNA寡聚物在25μl的磷酸化反应液[DNA寡聚物10μg、50mMTis-HCl，pH7.6，10mM MgCl2、1mM精脒、10mMDTT、0.1mg/ml BSA、1mM ATP、10单位T4聚核苷酸激酶(宝酒造)]中于37℃下反应1小时，对各个寡聚物的5′末端进行磷酸化。进行酚处理后，加2倍量的乙醇，于-70℃下冷却后，经离心使DNA沉淀。将该DNA片段和#5以及#10合并，总体积为120μl。将该混合液于90℃下保持10分钟，然后慢慢冷却到室温进行退火后，使用TaKaRa DNALigation Kit ver.2(宝酒造)进行连接反应。将II液30μl加到退火液30μl中，充分混合后，加入I液60μl于37℃下反应1小时，进行连接。酚处理后，回收水层，加入2倍量的乙醇，冷却到-70℃后，离心使DNA沉淀。这样得到的DNA片段利用T4核苷酸激酶(宝酒造)进行磷酸化。该结构基因部分和pCTGPR 1的MunI、BamHI片段使用TaKaRa DNALigation Kit ver.2(宝酒造)进行连接反应。使用10μl该反应液转化大肠杆菌JM109感受态细胞(东洋纺)，接种到含有10μg/ml的四环素的LB琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，选择活的四环素抗性的菌落。将该转化体于LB培养基中培养过夜，使用QIAprep8 Miniprep Kit(QIAGEN公司)制备质粒pTCGPR3。使用Applied Biosystem公司标本377DNA序列对该pTCGPR 3的前体蛋白质结构基因部分的碱基序列进行确认。用质粒pTCGPR 3转化大肠杆菌MM294(DE3)，得到前体蛋白表达株MM294(DE3)/pTCGPR 3。
(b)前体蛋白的制备将MM294(DE3)/pTCGPR 3用30ml含有10mg/L的四环素的LB琼脂培养基(1％胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)在200ml烧瓶中于37℃下振荡培养8小时。将得到的培养液15ml接种到加有300ml主发酵培养基(1.68％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.1％氯化铵、0.05％氯化钠、0.025％硫酸镁、0.00025％盐酸硫胺、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的1000ml容量烧瓶之后，于37℃下开始振荡培养。当培养液的浊度达到150Klett单位时添加最终浓度为10mg/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再培养3小时。培养结束后，对培养液(300ml)进行离心分离，获得约2g湿菌体。
实施例2向实施例1得到的2g菌体中加10ml 10mM EDTA(pH6.0)，经超声处理(BRANSON SONIFIER MODEL450)后，进行离心分离(15000rpm15分钟)。对沉淀物再进行同样操作。向沉淀物中加入5ml 7M胍溶液(pH5.0)后，搅拌2小时，然后进行离心分离(15000rpm 15分钟)。向上清液中添加17mg Tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride(TCEP-HCl)，于50℃下进行10分钟还原处理，然后使其通过用0.1％TFA平衡的C4P-50(1cm×25cm、昭和电工)，经吸附、清洗后，以2ml/分的流速进行20-60％B(B80％乙腈/0.1％三氟乙酸)的梯度洗脱，收集前体蛋白级分(洗脱时间约27分钟)，进行冷冻干燥，得到前体蛋白的冷冻干燥粉末。
实施例3将实施例2得到的前体冷冻干燥粉末用0.1M醋酸、6M尿素溶液1ml溶解后，添加3.5mg的DMAP-CN，于25℃下反应15分钟。反应结束后，然后使其通过用0.1％TFA平衡的C4P-50(1cm×25cm、昭和电工)，进行吸附、清洗后，以2ml/分的流速进行20-60％B(B80％乙腈/0.1％三氟乙酸)的梯度洗脱，收集S-氰化的前体蛋白级分(洗脱时间约27分钟)，进行冷冻干燥，得到S-氰化的前体蛋白的冷冻干燥粉末。将该冷冻干燥粉末用6M尿素溶液0.8ml溶解后，添加1N氢氧化钠溶液0.2ml，于0℃下反应15分钟。反应结束后用醋酸调到pH7.4。向该断裂反应液添加9ml的50mMNaCl、2mMCaCL2、20mMTris/HCl(pH7.4)溶液后，加入10单位肠激酶(Novagen公司)，于25℃下反应20小时。反应结束后，然后使其通过用0.1％TFA平衡的C4P-50(1cm×25cm、昭和电工)，进行吸附、清洗后，以2ml/分的流速进行20-60％B(B80％乙腈/0.1％三氟乙酸)的梯度洗脱，收集hGPR8L级分(洗脱时间约22分钟)，进行冷冻干燥，得到约70μg的hGPR8L冷冻干燥粉末。
实施例4(hGPR8L特征的确定)a)N末端氨基酸序列分析使用气相蛋白序列仪(PE Applied Biosystem型号491)确定N末端氨基酸序列。结果与从hGPR8L的DNA碱基序列预想的N末端氨基酸序列一致(表1)。
N末端氨基酸序列残基号 检测的PTH-氨基酸1)由hGPR8配体的碱基序列预测的氨基酸1 TrpTrp2 TyrTyr3 LysLys4 HisHis5 ValVal6 AlaAla7 SerSer8 ProPro9 ArgArg10 TyrTyr1)苯基硫乙内酰脲b)质量分析对得到的hGPR8L的质量进行分析，测定结果为2583.7Da(理论值2584.0)c)活性使用与WO01/98494号记载的实施例6同样的方法，进行利用GPR8表达CHO细胞的膜级分的GTPγS结合活性的测定，确认与化学合成品一样。
实施例5大肠杆菌中的KiSS-1肽前体蛋白表达质粒的构建象下述那样构建相当于序列1氨基酸的第35至54位的KiSS-1(35-54)肽前体蛋白表达质粒。
与实施例1记载的方法同样，使用10种DNA片段制备编码KiSS-1(35-54)肽串联3次的结构基因。使用TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)对该结构基因与pTCII载体的NdeI以及BamHI片段和上述结构基因进行连接反应。使用10μl该反应液转化大肠杆菌JM109感受态细胞(东洋纺)，接种到含有10μg/ml的四环素的LB琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，选择活的四环素抗性菌落。将该转化体于LB培养基中培养过夜，使用QIAprep8 Miniprep Kit(キアゲン公司)制备质粒pTCKiSS3554。使用Applied Biosystem公司型号377 DNA序列仪对该多肽DNA的碱基序列进行确认。用质粒pTCKiSS3554转化大肠杆菌(Escherichia coli)MM294(DE3)，得到前体蛋白表达株Escherichia coliMM294(DE3)/pTCKiSS3554。
实施例6前体蛋白的制备将实施例5的Escherichia coli MM294(DE3)/pTCKiSS3554用1L含有5.0mg/L的四环素的LB琼脂培养基(1％胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)在2L烧瓶中于37℃下振荡培养8小时。将得到的培养液接种到加有19L的主发酵培养基(1.68％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钠、0.1％氯化铵、0.05％氯化钠、0.05％硫酸镁、0.02％消泡剂、0.00025％硫酸亚铁、0.0005％盐酸硫胺、1.5％葡萄糖、1.5％Hy-Case Amino)的50L容量烧瓶之后，于30℃下开始通气搅拌。当培养液的浊度达到500 Klett单位时添加最终浓度为10mg/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再培养4小时。培养结束后，对培养液进行离心分离，获得湿菌体，保存在-80℃下。
实施例7KiSS-1(35-54)的获得向实施例6得到的100g菌体中加200ml 10mM EDTA(pH6.0)，超声处理(BRANSON SONIFIER MODEL450)后，进行离心分离(10000rpm60分钟)。对沉淀物再进行同样操作。向沉淀物中加入50ml 0.1M醋酸、8M尿素后，搅拌2小时，然后进行离心分离(10000rpm 60分钟)。向上清液中添加200mg 1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓盐(DMAP-CN)，于室温下反应15分钟。反应结束后，将反应液通过用10％醋酸平衡的Sephadex G-25柱(46mmID×600mmL、Pharmacia)，以6ml/min的流速使平衡用的10％醋酸展开，得到S-氰化的多肽。该溶液用Pellicon MiniCassette(Millipore公司)进行浓缩和脱盐，添加尿素使最终浓度为6M，再添加25％氨水使终浓度为3M，于15℃下反应15分钟。反应结束后，用醋酸调到pH6.0。使该反应液通过用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的ODS-120T(21.5mm×300mm、东洋曹达)，经吸附、清洗后，进行20-60％B(B80％乙腈/0.1％TFA)的梯度洗脱，收集C末端被酰胺化的肽级分，将该级分冷冻干燥，得到肽冷冻干燥粉末。将该肽用10ml的70％甲酸溶液溶解，添加溴化氰10mg，于室温下反应24小时。反应结束后，使反应液通过用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的ODS-120T(21.5mm×300mm、东洋曹达)、经吸附、清洗后，进行20-60％B(B80％乙腈/0.1％TFA)的梯度洗脱，收集KiSS-1(35-54)的肽级分，冷冻干燥，得到KiSS-1(35-54)冷冻干燥粉末。
实施例8KiSS-1(45-54)的制备根据实施例1记载的方法，构建相当于序列1氨基酸的第45至54位的KiSS-1(45-54)肽前体蛋白表达质粒pTCKiSS4554。该质粒含有编码KiSS-1(45-54)肽串联9次的结构基因。用质粒pTCKiSS4554转化大肠杆菌(Escherichia coli)MM294(DE3)，得到前体蛋白表达株Escherichia coli MM294(DE3)/pTCKiSS4554。对该表达株进行培养，象实施例6那样样操作可以从经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后的菌体中得到KiSS-1(45-54)。
对基于右手剪刀(S-氰化反应)和左手用剪刀(溴化氰处理、肠激酶、因子Xa处理等)切出靶肽和串联重复法进行组合的本发明方法，可用于大量合成基于基因重组技术的肽、特别是低分子量的肽。
序列表<110>武田药品工业株式会社<120>肽的制备方法<130>P02-0061PCT<150>JP 2001-147341<151>2001-05-17<160>75<210>1<211>54<212>PRT<213>人<220>
<223>多肽的C末端是酰胺(-CONH2)形式<400>1Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln15 10 15Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly20 25 30Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn35 40 45Ser Phe Gly Leu Arg Phe50<210>2<211>10<212>PRT<213>人<220>
<223>多肽的C末端是酰胺(-CONH2)形式<400>2Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe5 10<210>3<211>162<212>DNA<213>人<400>3
ggtacttctc tgtctccgcc gccggaatct tctggttctc gtcagcagcc gggtctgtct 60gctccgcact ctcgtcagat cccggctccg cagggtgctg ttctggttca gcgtgaaaaa120gacctgccga actacaactg gaactctttc ggtctgcgtt tc 162<210>4<211>30<212>DNA<213>人<400>4tataactgga acagctttgg tctgcgtttt30<210>5<211>144<212>DNA<213>人<400>5ggtagcgcga tgtataactg gaacagcttt ggtctgcgtt tttgtggctc ggcgatgtac 60aattggaatt ccttcggcct gcgcttctgc ggctcggcga tgtataactg gaactccttt120ggcctgcgct tttgcggttc tgct 144<210>6<211>9<212>PRT<213>人<400>6Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe1 5<210>7<211>12<212>PRT<213>人<400>7Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe1 5 10<210>8<211>20<212>PRT<213>人<400>8Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu
1 5 10 15Pro Leu Arg Phe20<210>9<211>37<212>PRT<213>人<400>9Ser Leu Asn Phe Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Pro Lys Asn Val Ile1 5 10 15Lys Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys Met Pro His Ser Phe Ala Asn20 25 30Leu Pro Leu Arg Phe35<210>10<211>8<212>PRT<213>人<400>10Val Pro Asn Leu Pro Gln Arg Phe1 5<210>11<211>17<212>PRT<213>人<400>11Asn Met Glu Val Ser Leu Val Arg Arg Val Pro Asn Leu Pro Gln Arg1 5 10 15Phe<210>12<211>27<212>DNA<213>人<400>12agctttgcga atctgccgct gcgtttt 27<210>13<211>36<212>DNA<213>人
<400>13atgccgcata gctttgcgaa tctgccgctg cgtttt36<210>14<211>60<212>DNA<213>人<400>14atgagcaccc cggcggtgaa taaaatgccg catagctttg cgaatctgcc gctgcgtttt 60<210>15<211>111<212>DNA<213>人<400>15agcctgaact ttgaagaact gaaagattgg ggtccgaaaa atgtgattaa aatgagcacc 60ccggcggtga ataaaatgcc gcatagcttt gcgaatctgc cgctgcgttt t 111<210>16<211>24<212>DNA<213>人<400>16gttcctaacc tgccccaaag gttt24<210>17<211>51<212>DNA<213>人<400>17aatatggagg tgagcctcgt gagacgtgtt cctaacctgc cccaaaggtt t 51<210>18<211>36<212>PRT<213>人<400>18Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly1 5 10 15Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly20 25 30Pro Met Pro Phe35
<210>19<211>108<212>DNA<213>人<400>19ctggtgcagc ccagagggtc aaggaatggg ccagggccct ggcagggagg tcggaggaaa 60ttccgccgcc agcggccccg cctctcccat aagggaccca tgcctttc 108<210>20<211>31<212>PRT<213>牛<400>20Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn15 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>21<211>31<212>PRT<213>大鼠<400>21Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn15 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>22<211>31<212>PRT<213>人<400>22Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn15 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>23<211>21<212>PRT<213>牛<220>
<221>
<222>
<223>第10位的Xaa代表Ala或Thr、第11位的Xaa代表Gly或Ser、第21位的Xaa代表OH、Gly或GlyArg<400>23Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Xaa Xaa Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Xaa20<210>24<211>29<212>PRT<213>牛<400>24Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly20 25<210>25<211>19<212>PRT<213>牛<400>25Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg19<210>26<211>31<212>PRT<213>牛<400>26Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>27<211>32<212>PRT<213>牛<400>27
Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30<210>28<211>33<212>PRT<213>牛<400>28Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30Arg<210>29<211>20<212>PRT<213>牛<400>29Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe20<210>30<211>21<212>PRT<213>牛<400>30Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly20<210>31<211>22<212>PRT<213>大鼠<400>31Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly Arg
20<210>32<211>31<212>PRT<213>大鼠<400>32Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>33<211>32<212>PRT<213>大鼠<400>33Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30<210>34<211>33<212>PRT<213>大鼠<400>34Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30Arg<210>35<211>20<212>PRT<213>大鼠<400>35Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe20<210>36<211>21
<212>PRT<213>大鼠<400>36Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly20<210>37<211>22<212>PRT<213>人<400>37Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly Arg20<210>38<211>31<212>PRT<213>人<400>38Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>39<211>32<212>PRT<213>人<400>39Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30<210>40<211>33<212>PRT<213>人<400>40Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn
1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30Arg<210>41<211>20<212>PRT<213>人<400>41Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe20<210>42<211>21<212>PRT<213>人<400>42Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly20<210>43<211>22<212>PRT<213>人<400>43Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly Arg20<210>44<211>23<212>PRT<213>人<400>44Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu20
<210>45<211>23<212>PRT<213>猪<400>45Trp Tyr Lys His Thr Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu20<210>46<211>23<212>PRT<213>大鼠/小鼠<400>46Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ser Gly Leu Leu Met Gly Leu20<210>47<211>30<212>PRT<213>人<400>47Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Leu Trp20 25 30<210>48<211>30<212>PRT<213>猪<400>48Trp Tyr Lys His Thr Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Met Trp20 25 30<210>49<211>30<212>PRT<213>大鼠
<400>49Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ser Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Leu Trp20 25 30<210>50<211>30<212>PRT<213>小鼠<400>50Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ser Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Gln Trp20 25 30<210>51<211>69<212>DNA<213>人<400>51tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc60atggggctg69<210>52<211>69<212>DNA<213>猪<400>52tggtacaagc acacggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc gggcctgctc60atggggctg69<210>53<211>69<212>DNA<213>大鼠/小鼠<400>53tggtacaagc acgtggcgag ccctcgctat cacacagtgg gtcgtgcctc cgggctgctc60atggggctg69<210>54<211>90<212>DNA<213>人
<400>54tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc60atggggctgc gtcgctcacc ctatctgtgg 90<210>55<211>90<212>DNA<213>猪<400>55tggtacaagc acacggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc gggcctgctc60atggggctgc gccgctcgcc ctacatgtgg 90<210>56<211>90<212>DNA<213>大鼠<400>56tggtacaagc acgtggcgag ccctcgctat cacacagtgg gtcgtgcctc cgggctgctc60atggggctgc gccgctcgcc ctacctgtgg 90<210>57<211>90<212>DNA<213>小鼠<400>57tggtataagc acgtggcgag tccccgctat cacacagtgg gtcgtgcctc cgggctgctc60atggggctgc gccgctcgcc ctaccagtgg 90<210>58<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>58Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>59<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>59gatgacgacg acaag 15<210>60<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>60Ile Glu Gly Arg1<210>61<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>61attgaaggcc gc12<210>62<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>62Gly Pro Arg1<210>63<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>63
ggcccgcgc 9<210>64<211>288<212>DNA<213>人<400>64gatgacgatg acaaatggta taaacatgtg gcgagcccgc gttatcatac cgtgggccgc 60gcggccggtc tgctgatggg cctgtgtcaa ttgggtggtg atgacgatga caaatggtat120aaacatgtgg cgagcccgcg ttatcatacc gtgggccgcg cggccggtct gctgatgggc180ctgtgtgagc tcggctctga cgacgatgat aaatggtaca aacacgttgc ctccccgcgc240taccacacgg ttggtcgtgc cgcgggcctg ctgatgggtc tgtgcggt 288<210>65<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>65tatggatgac gatgacaaat ggtataaaca tgtggcgagc ccgcgttatc ataccg 56<210>66<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>66gcgcggccca cggtatgata acgcgggctc gccacatgtt tataccattt gtcatcgtca 60tcca 64<210>67<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>68<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>68gatcctccgg cggcggagac agagaagttc aaacccaatt gacacaggcc catcagcaga60ccggcc 66<210>69<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>69aattgggtgg tgatgacgat gacaaatggt ataaacatgt ggcgagcccg cgttatcata60ccg 63<210>70<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>70cggcccacgg tatgataacg cgggctcgcc acatgtttat accatttgtc atcgtcatca60ccaccc 66<210>71<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>71tgggccgcgc ggccggtctg ctgatgggcc tgtgtgagct cggctctgac gacgatgata60aatggtac 68<210>72
<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>72caacgtgttt gtaccattta tcatcgtcgt cagagccgag ctcacacagg cccatcagca60gaccggcc 68<210>73<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>73aaacacgttg cctccccgcg ctaccacacg gttggtcgtg ccgcgggcct gctgatgggt60ctgtgcggtt gag 73<210>74<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>74gatcctcaac cgcacagacc catcagcagg cccgcggcac gaccaaccgt gtggtagcgc60ggggagg6权利要求
1.一种靶肽或其盐的制备方法，其特征是通过酶或化学方式对在靶肽的N末端和C末端附加酶或化学上的切断位点并重复连接的前体蛋白进行断裂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是通过酶或化学方式对在靶肽的N末端附加酶或化学上的切断位点、在C末端附加化学上的切断位点并重复连接的前体蛋白进行断裂。
3.一种靶肽或其盐的制备方法，其特征是用溴化氰或蛋白水解酶对在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端一侧附加蛋氨酸残基时，肽部分没有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白中的各靶肽的N末端一侧进行断裂，在C末端一侧的半胱氨酸或半胱氨酰肽的N末端一侧附加断裂反应。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中前体蛋白是重组型前体蛋白。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其中切断反应是S-氰化反应、然后附加氨分解或水解反应的反应。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中在2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)、1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓盐(DMAP-CN)或CN-离子存在下进行S-氰化反应。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其中蛋白水解酶是肠激酶、因子Xa或凝血酶。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其中(1)当使用溴化氰时，在各靶肽的N末端连接蛋氨酸残基，靶肽不含有蛋氨酸残基；(2)当蛋白水解酶为肠激酶时，各靶肽的N末端连接Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，靶肽不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys氨基酸序列；(3)当蛋白水解酶为因子Xa时，各靶肽的N末端连接Ile-Glu-Gly-Arg，靶肽不含有以Ile-Glu-Gly-Arg表示的氨基酸序列；(4)当蛋白水解酶为凝血酶时，各靶肽的N末端连接Gly-Pro-Arg，靶肽不含有Gly-Pro-Arg氨基酸序列。
9.根据权利要求1～3所述的制备方法，其中靶肽是KiSS-1肽。
10.根据权利要求1～3所述的制备方法，其中靶肽是GPR8配体。
11.一种GPR8配体或其盐的制备方法，其特征是用肠激酶对在GPR8配体的N末端附加肠激酶断裂序列、在C末端附加半胱氨酸残基后重复连接3次的前体蛋白中的GPR8配体的N末端一侧进行断裂，以及在C末端一侧的半胱氨酸残基的N末端一侧附加断裂反应。
12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中GPR8配体是含有与序列44表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的多肽。
13.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中GPR8配体是含有以序列44、序列45、序列46、序列47、序列48、序列49或序列50所示的氨基酸序列的多肽。
14.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中GPR8配体是含有以序列44所示的氨基酸序列的多肽。
15.一种DNA，含有编码以下前体蛋白的DNA，即，在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端附加蛋氨酸残基时，肽部分不含有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白。
16.一种重组载体，含有权利要求15所述的DNA。
17.根据权利要求15所述的重组载体，被保持在以FERM BP-8023标示的转化体大肠杆菌MM294(DE3)/pTCGPR3中。
18.一种转化体，用权利要求16所述的重组载体转化。
19.根据权利要求18所述的转化体，是以FERM BP-8023标示的转化体大肠杆菌MM294(DE3)/pTCGPR3。
20.一种前体蛋白或其盐，是在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端一侧附加蛋氨酸残基时，肽部分不含有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白或其盐。
21.根据权利要求4所述的制备方法，其中前体蛋白是对权利要求18所述的转化体进行培养之后制备的重组型前体蛋白。
全文摘要
本发明目的在于提供能够利用基因重组法，有效地、而且大量制备靶肽的方法。对基于右手剪刀(S－氰化反应)和左手用剪刀(溴化氰处理、肠激酶、因子Xa处理等)切出靶肽和串联重复法进行组合的本发明方法，可用于大量合成基于基因重组技术的肽、特别是低分子量的肽。
文档编号C07K5/00GK1509336SQ0280997
公开日2004年6月30日 申请日期2002年5月16日 优先权日2001年5月17日
发明者西村纪, 末永正人, 伊藤隆司, 北田千惠子, 人, 司, 惠子 申请人:株式会社岛津制作所