专利名称：利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶的方法
技术领域：
本发明涉及利用魔芋粉发酵生产β -甘露聚糖酶的方法。
背景技术：
利用微生物发酵生产甘露聚糖酶多以甘露聚糖作为碳源诱导酶的表达。因魔芋粉中富含甘露聚糖，而且价格低廉，所以目前常以魔芋粉作为生产甘露聚糖酶的碳源使用；但是由于魔芋粉本身的特性，以魔芋粉作为碳源导致微生物发酵培养基黏稠，存在灭菌后散热缓慢，搅拌阻力大等问题，而影响发酵产酶。
发明内容
本发明要解决目前以魔芋粉作为生产甘露聚糖酶的碳源导致微生物发酵培养基黏稠，存在灭菌后散热缓慢，搅拌阻力大等问题，而提供的利用魔芋粉微生物发酵生产 β-甘露聚糖酶的方法。第一种利用魔芋粉微生物发酵生产β -甘露聚糖酶按以下步骤实现一、称取发酵基料、水、发酵氮源和微量元素，然后混勻，得到发酵初培养基；二、向发酵初培养基中第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液，其中第一次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的 2%w/v ；三、在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下发酵至微生物菌体密度至OD6tltl值为4. 5，再第二次加入魔芋粉，然后在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、 通气量为4L/min的条件下再发酵8 40h，即完成利用魔芋粉微生物发酵生产β -甘露聚糖酶；其中，步骤三中第二次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的1 % w/v ；步骤一中发酵基料为麸皮和豆饼粉，麸皮与豆饼粉的质量比为(7 8) 0 3)。第二种利用魔芋粉微生物发酵生产β -甘露聚糖酶按以下步骤实现一、称取发酵基料、水、发酵氮源和微量元素，然后混勻，得到发酵初培养基；二、向发酵初培养基中第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液，其中第一次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的 l%w/v ；三、在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下发酵至微生物菌体密度至OD6tltl值为4. 5，再第二次加入魔芋粉，然后在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、 通气量为4L/min的条件下再发酵8 40h，即完成利用魔芋粉微生物发酵生产β -甘露聚糖酶；其中，步骤三中第二次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的2% 3%w/V;步骤一中发酵基料为麸皮和豆饼粉，麸皮与豆饼粉的质量比为(7 幻0 3)。本发明的两种方法都是分批加入魔芋粉，分批加入魔芋粉能降低微生物发酵培养基黏稠度，第二次加入魔芋粉后的微生物发酵培养基黏稠度分别为0. 2Pa · s和0. 4Pa · s, 因此微生物发酵培养基的流动性增强，具有灭菌后散热快，搅拌阻力小等优点。因魔芋粉的分批加入，本发明的发酵两种方法能够解除底物抑制作用和产物阻遏作用，维持有利的发酵条件；又可以防止菌种老化及变异，有利于菌体的高密度培养，并能明显提高甘露聚糖酶的酶活性。本发明所用的微生物为地衣芽孢杆菌HDGLJT-01(Bacillus IicheniformisHDGLJT-01)，地衣芽孢杆菌HDGLJT-01属于芽孢杆菌属(Bacillus)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2009年11月四日，保藏号为CCTCC NO :M20^88。
图1是具体实施方式
六中发酵过程中各项指标检测数据图。图2是具体实施方式
十二中发酵过程中各项指标检测数据图。图3是具体实施方式
十三中发酵过程中各项指标检测数据图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶按以下步骤实现一、称取发酵基料、水、发酵氮源和微量元素，然后混勻，得到发酵初培养基；二、 向发酵初培养基中第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液，其中第一次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的2% w/v ；三、在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下发酵至微生物菌体密度至OD6tltl值为4. 5，再第二次加入魔芋粉，然后在37°C 士2°C、 搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下再发酵8 40h，即完成利用魔芋粉微生物发酵生产β -甘露聚糖酶；其中，步骤三中第二次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的 w/v;步骤一中发酵基料为麸皮和豆饼粉，麸皮与豆饼粉的质量比为(7 8) 0 3)。本实施方式微生物发酵培养基由发酵基料、水、发酵氮源、微量元素、魔芋粉和微生物种子液组成。本实施方式中不用额外添加酸或碱调节微生物发酵培养基PH值。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中发酵氮源为蛋白胨。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二的不同点是步骤一中微量元素为MgSO4和KH2PO4，发酵初培养基中MgSO4的质量浓度为0. 02%, KH2PO4的质量浓度为 0.5%。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一的不同点是步骤一中发酵基料、水、发酵氮源与微量元素的质量比为(60 90) 3000 90 (15 17)。其
它步骤及参数与实施方式一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一的不同点是步骤一微生物种子液中菌体浓度为IO7个/mL，微生物种子液的接种量为发酵初培养基体积的 6. 7%,微生物种子液中的微生物为地衣芽孢杆菌HDGLJT-01 (Bacillus Iicheniformis HDGLJT-01)，地衣芽孢杆菌HDGLJT-01保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为 CCTCC N0:M209288。其它步骤及参数与实施方式一至四之一相同。将地衣芽孢杆菌HDGLJT-01斜面活化1 2代，然后接种于LB培养基中在37°C温度条件下、160r/min摇瓶培养12h ；再以(ν/ν)接种量转接入种子培养基(种子培养基按质量百分比由1 %的魔芋粉、3 %的蛋白胨、0. 02 %的MgS04、0. 5 %的K2HPO4和余量的水组成)中，在37°C温度条件下、180r/min至菌体浓度为IO7个/mL(约培养12h)；即得到微生物种子液。
具体实施方式
六本实施方式利用魔芋粉微生物发酵生产β -甘露聚糖酶按以下步骤实现一、称取发酵基料、水、发酵氮源和微量元素，然后混勻，得到发酵初培养基；二、 向发酵初培养基中第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液，其中第一次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的2% w/v ；三、在37°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下发酵至微生物菌体密度至0D_值为4. 5 (约9h)，再第二次加入魔芋粉，然后在37°C、 搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下再发酵40h，即完成利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶；其中，步骤三中第二次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的 w/v;步骤一中发酵基料为麸皮和豆饼粉，麸皮与豆饼粉的质量比为7 3;步骤一中发酵氮源为蛋白胨；步骤一中微量元素为MgSO4和KH2PO4,发酵初培养基中MgSO4的质量浓度为0. 02%, KH2PO4的质量浓度为0. 5% ；步骤一中发酵基料、水、发酵氮源与微量元素的质量比为70 3000 90 16 ；步骤一微生物种子液中菌体浓度为IO7个/mL，微生物种子液的接种量为发酵初培养基体积的6.7%，微生物种子液中的微生物为地衣芽孢杆菌 HDGLJT-01 (Bacillus IicheniformisHDGLJT-01)。本实施方式微生物发酵培养基由发酵基料、水、发酵氮源、微量元素、魔芋粉和微生物种子液组成。本实施方式中不用额外添加酸或碱调节微生物发酵培养基PH值。微生物菌体生长量的测定取混勻的微生物发酵培养基，以质量分数0. 9%的NaCl水溶液进行稀释，然后以质量分0. 9%的NaCl水溶液作为空白参照，在波长为600nm处测定吸光值0D_，以吸光值与稀释倍数乘积作为微生物菌体生长量。β -甘露聚糖酶的酶活性的测定(1)甘露糖标准曲线的绘制a.分别取 0. 0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9 和 1. OmL 甘露糖标准溶液，加入25mL具塞比色管中，并编号1至11，再加双蒸水补足至1. OmL ；b.加入3. OmL DNS试剂，沸水中显色5min，冷却至室温后，加水定容至25mL，充分混勻；c.于波长550nm处用752型分光光度计测定吸光值OD55tl,以1号比色管为空白参比，以甘露糖质量(mg)为横坐标X，以吸光值(OD55tl)为纵坐标Y，绘制标准曲线。(2)甘露聚糖酶活力测定a.在25mL具塞比色管中加入0. ImL稀释的微生物发酵培养基和0. 9mL、0. 5% (w/ ν)去除了还原糖的魔芋粉溶液(用PH值4. (KNa2HPO4-柠檬酸缓冲液配制)；b.放入55 °C条件下保温30min ；c.加入3mL DNS试剂，在沸水中煮沸5min，冷却后加水定容至25mL，混勻后在波长波长550nm下测出还原糖含量(mg/mL，以甘露糖计)；每次作有底物无酶的空白试验；d.按照下式计算甘露聚糖酶活力
β-甘露聚糖酶活力=-彌_|(= ^(U/mL)
30ιηιηχ0.18(η^/μιηο1)χ 所用的酶量(ml^在上述条件下一个酶活力单位定义为每分钟产生相当于1 μ moLD-甘露糖的酶量(U)。还原糖量的测定DNS法测定还原糖含量，在25mL具塞比色管中，加入0. ImL经适当稀释的粗酶液， 加入3mLDNS试剂，在沸水中煮沸5min，冷却后加水定容至25mL，混勻后在波长550nm下测出还原糖含量(g/L，以甘露糖计)。本实施方式发酵过程中各项指标检测数据如图1所示，图1中“■”曲线为微生物发酵培养基PH值曲线，图1中“·”曲线为微生物发酵培养基中还原糖量曲线，图1中“★” 曲线为微生物发酵培养基中酶活力曲线，“ ▲”曲线为微生物发酵培养基中菌体密度曲线。发酵时间从初始计。发酵过程中微生物发酵培养基pH值基本没有变化，β -甘露聚糖酶的酶活性不断升高，发酵至第40h，酶活力达3000U/mL以上。一次性投加魔芋粉(其他条件均相同情况下)β -甘露聚糖酶的酶活性仅为2070U/mL。本实施方式与一次性投加魔芋粉的方法相比其酶活力至少提高了 45%。本实施方式中魔芋粉投加后均迅速液化，微生物发酵培养基黏稠度始终小于 2. OPa · s,因此微生物发酵培养基的流动性增强，具有灭菌后散热快，搅拌阻力小的优点。由于魔芋粉的分批加入，本实施方式方法能够解除底物抑制作用和产物阻遏作用，维持有利的发酵条件；又可以防止菌种老化及变异，有利于菌体的高密度培养，提高 β-甘露聚糖酶的酶活性。
具体实施方式
七本实施方式利用魔芋粉微生物发酵生产β -甘露聚糖酶按以下步骤实现一、称取发酵基料、水、发酵氮源和微量元素，然后混勻，得到发酵初培养基；二、 向发酵初培养基中第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液，其中第一次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的l%w/v ；三、在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下发酵至微生物菌体密度至0D) _值为4. 5，再第二次加入魔芋粉，然后在37°C 士2°C、 搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下再发酵8 40h，即完成利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶；其中，步骤三中第二次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的2% 3% w/v ；步骤一中发酵基料为麸皮和豆饼粉，麸皮与豆饼粉的质量比为(7 8) O 3)。本实施方式微生物发酵培养基由发酵基料、水、发酵氮源、微量元素、魔芋粉和微生物种子液组成。本实施方式中不用额外添加酸或碱调节微生物发酵培养基PH值。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
七的不同点是步骤一中发酵氮源为蛋白胨。其它步骤及参数与实施方式七相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
七或八的不同点是步骤一中微量元素为MgSO4和KH2PO4，发酵初培养基中MgSO4的质量浓度为0. 02%, KH2PO4的质量浓度为 0.5%。其它步骤及参数与实施方式七或八相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
七至九之一的不同点是步骤一中发酵基料、水、发酵氮源与微量元素的质量比为(60 90) 3000 90 (15 17)。其它步骤及参数与实施方式七至九之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
七至十之一的不同点是步骤一微生物种子液中菌体浓度为IO7个/mL，微生物种子液的接种量为发酵初培养基体积的6. 7 %，微生物种子液中的微生物为地衣芽孢杆菌HDGLJT-01 (Bacillus Iicheniformis HDGLJT-01)，地衣芽孢杆菌HDGLJT-01保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为 CCTCC N0:M209288。其它步骤及参数与实施方式七至十之一相同。将地衣芽孢杆菌HDGLJT-01斜面活化1 2代，然后接种于LB培养基中在37°C温度条件下、160r/min摇瓶培养12h ；再以(ν/ν)接种量转接入种子培养基(种子培养基按质量百分比由1 %的魔芋粉、3 %的蛋白胨、0. 02 %的MgS04、0. 5 %的K2HPO4和余量的水组成)中，在37°C温度条件下、180r/min至菌体浓度为IO7个/mL(约培养12h)；即得到微生物种子液。
具体实施方式
十二 本实施方式利用魔芋粉微生物发酵生产β -甘露聚糖酶按以下步骤实现一、称取发酵基料、水、发酵氮源和微量元素，然后混勻，得到发酵初培养基；二、向发酵初培养基中第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液，其中第一次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的w/v ；三、在37°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/ min的条件下发酵至微生物菌体密度至0D_值为4. 5 (约9h)，再第二次加入魔芋粉，然后在37°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下再发酵40h，即完成利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶；其中，步骤三中第二次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的2% w/v;步骤一中发酵基料为麸皮和豆饼粉，麸皮与豆饼粉的质量比为8 2;步骤一中发酵氮源为蛋白胨；步骤一中微量元素为MgSO4和KH2PO4,发酵初培养基中MgSO4的质量浓度为0. 02%, KH2PO4的质量浓度为0. 5% ；步骤一中发酵基料、水、发酵氮源与微量元素的质量比为80 3000 90 15 ；步骤一微生物种子液中菌体浓度为IO7个/mL，微生物种子液的接种量为发酵初培养基体积的6. 7%，微生物种子液中的微生物为地衣芽孢杆菌 HDGLJT-01(Bacillus IicheniformisHDGLJT-01)。本实施方式微生物发酵培养基由发酵基料、水、发酵氮源、微量元素、魔芋粉和微生物种子液组成。本实施方式中不用额外添加酸或碱调节微生物发酵培养基PH值。微生物菌体生长量的测定取混勻的微生物发酵培养基，以质量分数0. 9%的NaCl水溶液进行稀释，然后以质量分0. 9%的NaCl水溶液作为空白参照，在波长为600nm处测定吸光值0D_，以吸光值与稀释倍数乘积作为微生物菌体生长量。β -甘露聚糖酶的酶活性的测定(1)甘露糖标准曲线的绘制a.分别取 0. 0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9 和 1. OmL 甘露糖标准溶液，加入25mL具塞比色管中，并编号1至11，再加双蒸水补足至1. OmL ；b.加入3. OmL DNS试剂，沸水中显色5min，冷却至室温后，加水定容至25mL，充分混勻；c.于波长550nm处用752型分光光度计测定吸光值OD55tl,以1号比色管为空白参比，以甘露糖质量(mg)为横坐标X，以吸光值(OD55tl)为纵坐标Y，绘制标准曲线。(2)甘露聚糖酶活力测定a.在25mL具塞比色管中加入0. ImL稀释的微生物发酵培养基和0. 9mL、0. 5% (w/ ν)去除了还原糖的魔芋粉溶液(用PH值4. (KNa2HPO4-柠檬酸缓冲液配制)；b.放入55 °C条件下保温30min ；
c.加入3mL DNS试剂，在沸水中煮沸5min，冷却后加水定容至25mL，混勻后在波长波长550nm下测出还原糖含量(mg/mL，以甘露糖计)；每次作有底物无酶的空白试验；d.按照下式计算甘露聚糖酶活力
权利要求
1.利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶按以下步骤实现一、称取发酵基料、水、发酵氮源和微量元素，然后混勻，得到发酵初培养基；二、向发酵初培养基中第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液，其中第一次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的2% w/v ；三、在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下发酵至微生物菌体密度至0D_值为4. 5，再第二次加入魔芋粉，然后在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下再发酵 8 40h，即完成利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶；其中，步骤三中第二次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的w/v ；步骤一中发酵基料为麸皮和豆饼粉，麸皮与豆饼粉的质量比为(7 8) (2 3)。
2.根据权利要求1所述的利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一中发酵氮源为蛋白胨。
3.根据权利要求2所述的利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一中微量元素为MgSO4和KH2PO4，发酵初培养基中MgSO4的质量浓度为0. 02%、 KH2PO4的质量浓度为0. 5%。
4.根据权利要求1、2或3所述的利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一中发酵基料、水、发酵氮源与微量元素的质量比为(60 90) 3000 90 (15 17)。
5.根据权利要求4所述的利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一微生物种子液中菌体浓度为IO7个/mL，微生物种子液的接种量为发酵初培养基体积的6. 7%，微生物种子液中的微生物为地衣芽孢杆菌HDGLJT-01 (Bacillus licheniformisHDGLJT-01)，地衣芽孢杆菌HDGLJT-01保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏号为 CCTCC NO :M 209288o
6.利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶按以下步骤实现一、称取发酵基料、水、发酵氮源和微量元素，然后混勻，得到发酵初培养基；二、向发酵初培养基中第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液，其中第一次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的w/v;三、在37°C 士 2°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下发酵至微生物菌体密度至0D_值为4. 5，再第二次加入魔芋粉，然后在37°C 士2°C、搅拌速率为300r/min、通气量为4L/min的条件下再发酵 8 40h，即完成利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶；其中，步骤三中第二次魔芋粉的加入量为发酵初培养基的2% 3% w/v ；步骤一中发酵基料为麸皮和豆饼粉，麸皮与豆饼粉的质量比为(7 8) 0 3)。
7.根据权利要求6所述的利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一中发酵氮源为蛋白胨。
8.根据权利要求7所述的利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一中微量元素为MgSO4和KH2PO4，发酵初培养基中MgSO4的质量浓度为0. 02%、 KH2PO4的质量浓度为0. 5%。
9.根据权利要求6、7或8所述的利用魔芋粉微生物发酵生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一中发酵基料、水、发酵氮源与微量元素的质量比为(60 90) 3000 90 (15 17)。
10.根据权利要求9所述的利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一微生物种子液中菌体浓度为IO7个/mL，微生物种子液的接种量为发酵初培养基体积的6. 7%，微生物种子液中的微生物为地衣芽孢杆菌HDGLJT-01 (Bacillus licheniformisHDGLJT-01)，地衣芽孢杆菌HDGLJT-01保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏号为 CCTCC NO :M 209288o
全文摘要
利用魔芋粉微生物发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。它涉及利用魔芋粉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。它解决了目前以魔芋粉作为生产β-甘露聚糖酶的碳源导致微生物发酵培养基黏稠，存在灭菌后散热缓慢，搅拌阻力大等问题。发酵方法一、制备发酵初培养基；二、第一次加入魔芋粉，然后接入微生物种子液；三、发酵，第二次加入魔芋粉，再发酵。本发明方法用于生产β-甘露聚糖酶。
文档编号C12R1/10GK102191235SQ201110096830
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者葛菁萍 申请人:黑龙江大学