用于疫苗和诊断学的Dps融合蛋白的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2010年12月22日，申请号为201080060432. 1，发明名称为"用 于疫苗和诊断学的Dps融合蛋白"的申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明总体上涉及医药领域，并且具体地涉及微生物学、免疫学、诊断学和疫苗， 并且更具体地涉及通过使用Dps融合蛋白诊断、治疗和预防疾病。
【背景技术】
[0003] Dds 蛋白
[0004] 来自饥饿细胞的DNA结合蛋白（Dps)是在细菌和古细菌中发现的一个充分保守 蛋白的家族，但其不存在于动物或人中。它们在应激条件下负责保护细胞DNA免受自由 基的损害。Dps是由以2:3对称排列的12个相同的亚基组成的十二聚体纳米颗粒。其 具有9nm的直径，内腔直径为4. 5nm(Grant等人，自然结构与分子生物学咖七31：1'11(31:· Bioh )5:294 - 303, 1998)。大肠杆菌（E. Coli)的Dps是Dps的原型，其于1992年首先被 Almiron等人发现（基因与发育（Genes Dev) 6:2646 - 2654, 1992)。当细胞处于应激或饥饿 条件下时，Dps的表达增加（Almiron等人，基因与发育（Genes Dev) 6:2646 - 2654, 1992)。
[0005] 每个Dps亚基的分子量为~20kDa并且折叠成在相对的端部处具 有游离的N-和C-末端的紧密的四螺旋束（Grant等人，自然结构与分子生 物学（Nat Struct. Biol. )5:294 - 303, 1998 ;Roy 等人，分子生物学（J Mol Biol. )370:752-67, 2007 ;Haikarainen 和 Papageorgiou.细胞分子生命科学（Cell Mol Life Sci. )67:341-51, 2010)。四个螺旋通过三个具有可变长度的环序列相互连 接在一起。在游离的N-末端中也可以形成短的螺旋。12个拷贝的Dps亚基依照2:3 的对称性组装成9nm纳米颗粒，游离的N-和C-末端序列都暴露在表面上（Grant等 人，自然结构与分子生物学（Nat Struct. Biol. )5:294 - 303, 1998 ;Stillman等人， 分子微生物学（Mol Microbiol. )57:1101-12, 2005 ;Roy 等人，分子生物学（J Mol Biol. )370:752-67, 2007 ;Haikarainen 和 Papageorgiou.细胞分子生命科学（Cell Mol Life Sci. )67:341-51, 2010)。来自几种细菌和古细菌的Dps的晶体结构已经被确定，包括 大肠杆菌（Grant等人，自然结构与分子生物学（Nat Struct. Biol. )5:294 - 303, 1998)、 硫横矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus) (Gauss 等人，生物化学（Biochemist ry), 45:10815-10827, 2006)、耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis) (Roy 等人，分 子生物学（J Mol Biol. )370:752-67, 2007)、耐福射球菌（Deinococcus radiodurans) (Kim 等人，分子生物学（J. Mol. Biol), 361:105-114, 2006)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis) (Stillman 等人，分子微生物学（Mol Microbiol. )57:1101-12, 2005)和无害 李斯特菌（Listeria innocua) (Ilari等人，自然结构与分子生物学（似〖31：1'11(31:· Biol.). 7:38-43, 2000)。从这些结构分析理解，Dps的游离N-和C-末端序列，尤其是这些 末端序列的远端处的氨基酸经常在电子密度图上观察不到或仅部分被观察到。因此，尽管 总的末端序列可能存在于表面上，但末端序列的远端可能延伸至Dps结构的内部中。这在 硫磺矿硫化叶菌Dps (SsDps)的情况中得到证明，其中在密度图中观察到的在远端处未被 观察到的氨基酸前的少数C-末端氨基酸被发现指向纳米颗粒结构的内部（Gauss等人，生 物化学（Biochemistry)，45:10815-10827, 2006)。
[0006] Dps通过铁结合和DNA结合来保护DNA免受氧化应激（Zhao等人，生物化学 (J Biol Chem) 277:27689 - 27696, 2002 ;Haikarainen 和 Papageorgiou.细胞分子生命 科学（Cell Mol Life Sci. )67:341-51, 2010)。结合Fe2+离子防止通过芬顿反应生成毒 性羟基自由基，这些羟基自由基会损害DNA。铁结合由位于亚基之间的界面处的独特的 双-铁金属结合位点介导，所述亚基包含保守氨基酸：组氨酸（His)、天冬氨酸（Asp)和谷 氨酸（Glu)。DNA结合提供对DNA的物理保护。在Dps的许多成员中Dps的N-或C-末 端富含碱性氨基酸并通过离子相互作用参与到DNA结合中（Ceci等人，核酸研究（Acids Res. )32:5935-5944, 2004 ;Roy 等人分子生物学（J Mol Biol. )470:752-67, 2007)。
[0007] 尽管十二聚体纳米颗粒结构在所有Dps之间非常保守，但在细菌或古细菌的不 同家族之间Dps -级氨基酸序列变化非常大。例如，大肠杆菌的Dps (Swiss-Prot登记号 P0ABT2)与来自嗜超高温古细菌硫磺矿硫化叶菌（Swiss-Prot登记号P95855)、嗜极端细 菌耐福射奇球菌（Deinococcus radiodurans) (Swiss-Prot登记号Q9RS64)、无害李斯特菌 (Listeria innocua) (Swiss-Prot 登记号 P80725)、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori) (Swiss-Prot 登记号 P43313)或链球菌性肺炎（Streptococcus pneumonia) (Swiss-Prot 登 记号B1S132)的Dps仅共有〈30%氨基酸序列同一性。考虑到已经在检查的几乎所有细菌 中都发现了 Dps，显然存在这些遗传上多种多样来源的Dps。另一方面，Dps氨基酸序列在 细菌家族内非常保守。例如，在肠杆菌科的成员，诸如痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae) (Swiss-Prot 登记号 Q32I91)、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium) (Swiss-Prot 登记号Q7CQV9)、大肠杆菌（Swiss-Prot登记号P0ABT2)和肺炎克雷白杆菌（Klebsiella pneumonia) (Swiss-Prot登记号Q84FI02)之间，Dps的氨基酸同源性为90%以上。
[0008] 病原菌的Dps也可能参与到它们的致病性中。因此，幽门螺杆菌的Dps也已知为 中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP)，对中性粒细胞有趋化性，并且参与炎症反应（Teneberg等 人，生物化学（J Biol Chem. )272:19067 - 19071，1997)。空肠弯曲杆菌的 Dps 与 HP-NAP 共享很高的同源性，已经显示与硫苷脂结合，并且可能参与引起轴突损害（Piao等人，神经 科学（J Neurol Sci. )288:54-62, 2010)。
[0009] 疫遊
[0010] 疫苗是用于预防和治疗感染性疾病、癌症和其他疾病状态的生物产品。在大多 数情况下，疫苗针对可能由细菌、病毒或其他微生物导致的感染性疾病而开发。抗原是疫 苗的活性组分，并由微生物的整体或一部分制成。微生物的表面上的蛋白经常是能够针 对该微生物产生保护性免疫应答的最重要的抗原。来自微生物的内部蛋白也能够诱导保 护性效应，尤其是通过诱导细胞免疫。蛋白抗原可以从微生物直接分离，或在表达宿主中 作为重组蛋白产生。蛋白抗原诱导保护性免疫的关键部分经常表现为蛋白序列中的氨基 酸或肽的短链。它们可以通过其功能诸如细胞结合、细胞融合和中和，通过沿全部蛋白序 列系统性测试单个肽和比较序列分析来鉴定。这样的抗原肽，通常长度小于100个氨基 酸，与复合蛋白抗原相比较好地被确定，并且还可以被化学合成。在微生物的不同血清型 和菌株之间这些肽抗原中经常高度保守，因此能够产生交叉保护效应。因此，在鉴定这些 肽抗原和使用这些肽抗原来制备可能提供通用保护作用的疫苗方面做出了极大的努力。 这些努力特别地与已知经历频繁的遗传改变和/或由多种血清型组成的微生物相关，包 括流感病毒、人免疫缺陷病毒（HIV)和人乳头瘤病毒（HPV)。高度保守的肽的实例包括， 但不限于，流感病毒的M2e (Neirynck等人，自然医学（Nat. Med. )，5, 1157-1163, 1999)、 HPV的L2蛋白肽（aal7_36和aal08_120) (Karanam等人，免疫细胞生物学（Immunol. Cell Bio. )87:287-299, 2009)、人免疫缺陷病毒（HIV)的gp41肽（Shi等人，生物化 学（J Biol Chem.)285:24290-24298,2010)和来自有包膜病毒的表面糖蛋白的各种长 度的融合肽（14-30aa)(例如流感病毒、HIV和呼吸道合胞病毒）。融合肽的C-末端 经常没有统一的截止点。这样，在已发表的文献里所描述或用的融合肽的长短差异很 大。以流感病毒为例，其融合肽可由主要包膜蛋白HA的HA2部分的前l-13aa(H 〇rvath 等人，免疫学快报（Immunol. Letters) 60:127-136, 1998)、l_14aa (Chun 等人，疫苗 (Vaccine) 26:6068-6076, 2008)、l-21aa(Sui 等人，自然结构与分子生物学（Nat. Struct. Mol. Biol.) 16:265 - 273, 2009)、l-23aa (Cross 等人，蛋白质和肽快报（Protein and Peptides Letters) 16:766-778, 2009)、l_24aa (Tamm and Han,生物科学报告（Bioscience Reports)20:501_518, 2000)、或 l_38aa(Vareckova 等人，单克隆抗体研究趋势（Trends in Monoclonal Antibody Research) (Simmons MA, ed), pp 123-142,2005)组成。在其他 流感病毒蛋白中还已经鉴定了许多其他高度保守的肽序列作为潜在的疫苗靶标（Heiny等 人，PLoS One. 2: el 190, 2007 ;Ekiert 等人科学（Science) .324:246-251, 2009)。
[0011] 还存在具有有限数目的血清型但拥有免疫显性表位的病原体，诸如结核分枝杆 菌（TB) (Mycobacterium tuberculosis)的 ESAT-6 蛋白（95aa)和 Ag85A(Brandt 等人， 免疫学（J. Immunol. ) 157:3527 - 3533, 1996 ;Santosuosso，M.等人传染与免疫（Infect. Immun). 74:4634, 2006)。肽抗原的其他实例包括来自口蹄疫病毒（Beignon等人，Vet Tmmunol Immunopathol. 104: :273_80, 2005)、症疾（Mahajan 等人，传染与免疫（Infect. Immun) .S印，2010)、肠道病毒 71 (Foo 等人，病毒研究（Virus Res. ) 125:61 - 68, 2007)、炭 疽的保护性抗原（Oscherwitz等人，免疫学（J. Immunol. ) 185:3661-3668, 2010)和细菌粘 附蛋白（Yakubovics，N.等人分子生物学（Mol. Biol. )55:1591, 2005)的那些。
[0012] 除了感染性疾病以外，还正在对癌症和其他疾病状态开发基于肽的疫苗。来源 于肿瘤相关抗原（TAA)的小肽已经被鉴定为针对肿瘤或癌症的疫苗候选物（Kanodia和 Kast,疫苗专家述评（Expert Rev Vaccines) .7:1533-1545, 2008 ;Cheever 等人，临床癌 症研究（Clin Cancer Res.) 15:5323_37, 2009 ;0ka 等人，免疫学新见（Curr. Opinion in Immunol.) 20:211-220)。它们包括来自各种癌症的WTl蛋白的肽，来自乳腺癌相关HER2/ neu蛋白的GP2肽，来自前列腺癌的NY-ES01和来自黑色素瘤的多种肽。另外，β -淀粉样肽 用作阿尔兹海默病的候选疫苗（Lemere,脑研究进展（Prog Brain Res. ) 175:83-93,2009; Verdoliva 等人，人类免疫（Human Vaccines) .6:1-2, 2010) 〇
[0013] 然而，肽抗原自身经常是诱导免疫应答的弱免疫原。为了克服这一缺陷，肽抗原可 以与载体蛋白化学连接或使用重组DNA技术作为融合蛋白来增强针对它们的免疫应答。
[0014] 诊断学
[0015] 诊断剂是在用于诊断感染性或非感染性疾病的诊断测试中使用的试剂。其可以是 用于检测特异性抗体的抗原，或结合或检测受体的配体，或反之亦然。诊断剂还包括用于检 测特异性抗原或与特异性抗原相关的组织或病原体的特异性抗体。该特异性抗体为单克隆 或多克隆的，其可以用抗原在哺乳动物中产生。通过将来自被免疫动物的脾细胞和骨髓瘤 细胞诸如SP2/0融合来获得单克隆抗体。
[0016] 来自病原体或疾病状态的保守蛋白或肽抗原作为诊断剂可以非常有用。如果它们 与载体蛋白连接或融合，则它们在诊断测试中的应用可以被极大地改善。这对于肽抗原来 说更是如此，因为载