体蛋白可以促进肽抗原与测试表面的连接或针对它们的特异性抗体的 生成。如果来自同一病原体或疾病的两种不同的肽抗原与相同的载体蛋白连接，这是特别 有利的，因为这可以极大地增加检测灵敏度以及特异性。
[0017] 诊断测试可以是检测抗原或抗体的免疫测定，或检测配体-受体结合的测试。 ELISA(酶联免疫吸附测定）是免疫测定的实例。免疫测定还可以是浸渍片形式（Paek等 人，方法（Methods.) 1:53-60, 2000)。诊断剂经常与信号剂或发射体连接，如果测试结果为 阳性则所述信号剂或发射体给出可测量到的信号。信号剂可以是酶诸如碱性磷酸酶、金颗 粒、以及小分子诸如生物素和荧光染料。信号剂可以与诊断剂通过化学结合作用连接或通 过重组DNA技术融合。
[0018] 用于融合蛋白的载体蛋白
[0019] 与载体蛋白的共价连接是增强疫苗抗原的免疫原性的有效方式，尤其是用自身免 疫原性差的肽制成的那些疫苗抗原。因此，小蛋白或肽与钥孔戚血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin) (KLH)的化学结合已经是产生针对它们的免疫应答的常用方式。将肽与载体 蛋白的连接还可以通过使用重组DNA技术的融合或直接DNA合成以将编码抗原的DNA序列 与编码载体蛋白的DNA序列连接来实现。多种蛋白已经用作用于与蛋白或肽抗原的融合 或化学结合的载体蛋白，包括KLH、补体、霍乱毒素、破伤风类毒素、OMPC(脑膜炎奈瑟球菌 (Neisseria meningitides)的外膜蛋白复合物）、硫氧还蛋白、鞭毛蛋白（Huleatt等人， 疫苗（Vaccine) 26:201-14, 2007)、各种有包膜和无包膜的病毒的病毒样颗粒（VLP)以及纳 米颗粒蛋白诸如热休克蛋白（Kim等人，自然（Nature). 394:595-9, 1998)和铁蛋白（美国 专利号7608268)。这些载体蛋白中的一些还充当佐剂起作用，诸如补体和鞭毛蛋白，鞭毛蛋 白是Toll-样受体5的配体。
[0020] VLP已经被广泛地作为载体蛋白测试。它们可以来源于许多种不同的有包 膜和无包膜的病毒（Chackerian, Expert Rev Vaccines. 6:381-90. ,2007)，包括乳头 瘤病毒（HPV ;Ionescu 等人，药物科学（J. Phamr. Sci.) 95, 70-79, 2006)、乙型肝炎 核心抗原（Hbc ;Pumpens 和 Grens, 1998. FEBS letters 442, 1-6)、番木瓜花叶病毒 (Denis 等人，疫苗（Vaccine) ,26:3395-3403, 2008)和菌体（Caldeira 等人，疫苗 (Vaccine), 28:4384-4393)。它们主要由病毒衣壳蛋白制成，所述病毒衣壳蛋白组成病毒衣 壳结构。这些VLP中的大多数通过使用真核表达系统诸如杆状病毒和酵母制备（Grgacic 和Anderson,方法（Methods). 40:60-65, 2006)。这些VLP中的大多数也是纳米颗粒 (< IOOnm)。因此，本文使用的术语纳米颗粒载体蛋白指VLP和其他非病毒纳米颗粒载体 蛋白两者。
[0021] 纳米颗粒载体蛋白由多个亚基制成，并且这些亚基一旦在表达宿主中表达就自组 装成纳米颗粒。作为具有多个亚基的纳米颗粒，它们对于抗原递呈和免疫应答的诱导是高 度有效的。这是因为每个颗粒上存在的多个拷贝的蛋白或肽抗原增强了抗原递呈。另外，颗 粒形式的抗原的免疫原性大于游离抗原，因为其可以有效地被抗原递呈细胞吞噬或摄取。
[0022] Hbc已经被广泛地用作用于融合蛋白疫苗的载体蛋白。例如，来自流感病毒M2蛋 白的 M2e 肽（24aa)已经与 Hbc 融合（Fiers 等人，疫苗（Vaccine) 27:6280-6283, 2010)，并 且得到的融合蛋白能够诱导针对该肽的免疫应答。在大多数情况下，蛋白或肽抗原与HBc 的表面环连接，所述表面环充分地暴露在表面上，并且可以容纳插入的蛋白或肽而不会破 坏颗粒形成（Pumpens 和 Grens, 1998. FEBS letters 442, 1-6)。与 Dps -样，铁蛋白是结合 铁的纳米颗粒蛋白，但由24个不同同种型（H和L链）的亚基组成。美国专利号7608268 记述了蛋白或肽与铁蛋白在N-和/或C-末端处的融合，并且得到的融合蛋白保留了组装 成聚合的聚集体或衣壳组装体的能力。尽管铁蛋白的N-末端暴露在表面上，但其C-末端 位于内部核心中。因此，N-末端处的融合蛋白或肽暴露在表面上（衣壳外融合（exocapsid fusion))，而C-末端处的融合蛋白或肽则包埋在铁蛋白颗粒内（衣壳内融合（endocapsid fusion))。因此，铁蛋白的C-末端处的融合因此不适于融合抗原的表面递呈以诱导直接和 间接的免疫应答。
[0023] 使用完善的重组DNA技术和直接DNA或基因合成，任何蛋白或肽可以被融合至另 一蛋白的任何位点。然而，不知道的是得到的融合蛋白是否可以达到所需的融合效果。因 此，为采用纳米颗粒载体蛋白生成融合蛋白的重要要求是融合蛋白保留组装成纳米颗粒的 能力和载体蛋白可能具有的其他有益性质。另外，融合的蛋白或肽需要存在于融合蛋白的 外表面上。由于通常存在有来自于任何指定的病原体或疾病状态的多于一个的保守肽抗 原，因此强烈地诱发多于一个的肽抗原在不同的位点处同时融合至载体蛋白，所有融合的 肽抗原暴露在表面上以拓宽免疫应答并增加疫苗功效，或在诊断测试的情况下增加检测灵 敏度。另外，形成的融合蛋白需要是可溶的，并且足够稳定以承受纯化工艺和作为最终产品 的储存。融合蛋白还优选是热稳定的，其可以用来制备在室温或更高温度下稳定的疫苗。此 外，融合蛋白优选在细菌表达中制备，细菌表达高度有效且成本低。
[0024] 因此，对于可以获得用于制备更有效的疫苗和诊断产品的这些有益属性的新型和 改良的蛋白载体系统存在极大的需求。之前还没有人致力于生成具有Dps的融合蛋白，也 没有任何人建立两种蛋白或肽同时融合于Dps的不同位点的Dps融合蛋白。
【发明内容】
[0025] 因此，本发明提供了一种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的至少一种蛋白或肽， 其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒，并且所述蛋白或肽存在于所述Dps融合蛋 白的外表面上。
[0026] 在一些实施方案中，所述Dps可来源于细菌或古细菌。
[0027] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可与Dps的N-末端、C-末端或内部位点融合。
[0028] 在一些实施方案中，所述Dps可通过一个或多个氨基酸的缺失、置换或插入而修 饰。
[0029] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可来源于包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、癌症和 细胞的组。
[0030] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可以是病毒融合肽（权6)。优选地，所述Dps融 合蛋白可以是可溶的。
[0031 ] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可以是三聚体形成蛋白或肽。
[0032] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是热稳定的。优选地，所述Dps可来源 于嗜温生物。
[0033] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可与aGal表位或其类似物共价结合。
[0034] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是疫苗。
[0035] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是诊断剂。
[0036] 本发明进一步提供了一种Dps融合蛋白，其包含同时与Dps的N-末端和C-末端 分别融合的两种蛋白或肽，其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒，并且所述蛋白 或肽存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。
[0037] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白还可包含与Dps的内部位点融合的一种蛋 白或肽。
[0038] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可来源于包括流感病毒的M2e和HA2、乳头瘤病 毒的L2、人免疫缺陷病毒的gp41、和癌症的WTl蛋白的蛋白或肽的组。
[0039] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可包括病毒融合肽。优选地，所述Dps融合蛋白 可以是可溶的。
[0040] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可包括三聚体形成蛋白或肽。
[0041] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可以是流感病毒的M2e和融合肽。
[0042] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可包括SEQ ID No :3、6或7的氨基酸序列， 其中所述Dps任选地被来自不同细菌或古细菌的Dps置换。
[0043] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是热稳定的。优选地，所述Dps可来源 于嗜温生物。
[0044] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可与a Gal表位或其类似物共价结合。
[0045] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是疫苗。
[0046] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是诊断剂。
[0047] 本发明进一步提供了一种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的一种蛋白或肽，其中 所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒并与寡糖或多糖共价结合。
[0048] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可包含至少两种氨基酸，这些氨基酸选自包含 赖氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的一个组。
[0049] 在一些实施方案中，所述蛋白或肽可与Dps的N-末端和C-末端的任一端或两端 融合并且存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。
[0050] 在一些实施方案中，所述寡糖或多糖可来源于包括细菌、病毒、真菌、寄生虫和癌 症的组。优选地，所述寡糖或多糖和所述Dps可来源于相同的细菌。
[0051] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是疫苗。
[0052] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可以是诊断剂。
[0053] 本发明进一步提供了热稳定的Dps融合蛋白。
[0054] 本发明的一个实施方案提供了一种包含病毒融合肽的Dps融合蛋白，并且所述 Dps融合蛋白是可溶的，尽管病毒融合肽的溶解度差。
[0055] 本发明的另一个实施方案提供了包含三聚体形成蛋白或肽的Dps融合蛋白。
[0056] 本发明的另一个实施方案提供了一种包含两种蛋白或肽的Dps融合蛋白，所述蛋 白或肽来源于包括流感病毒的M2e和HA2、乳头瘤病毒的L2蛋白、HIV的gp41和癌症的WTl 蛋白的蛋白或肽的组。本发明进一步为这个实施方案提供了包括SEQ ID No :3、6或7的氨 基酸序列所代表的Dps融合蛋白的实例。
[0057] 本发明的另一个实施方案提供了一种Dps融合蛋白，其包含流感病毒的M2e和融 合肽。本发明的另一个实施方案提供了一种流感病毒疫苗，所述疫苗包含与Dps融合的M2e 肽和至少一个来源于HA2的肽。所述来源于HA2的肽包括融合肽和螺旋A、B、C和D。本发 明进一步为这个实施方案提供了包括SEQ ID N〇:3和6的氨基酸序列所代表的Dps融合蛋 白的实例。以前没有人将流感病毒的这两种肽作为融合蛋白加在一起，并将所得融合蛋白 用于疫苗。除了 Dps以外，这个实施方案也可将与其它载体蛋白融合的流感病毒的这两种 肽加在一起。
[0058] 本发明的另一个实施方案提供了一种Dps融合蛋白，其与a Gal表位或其类似物 共价结合。
[0059] 本发明进一步提供了一种包含蛋白或肽的Dps融合蛋白，所述蛋白或肽含有适合 于与碳水化合物结合的氨基酸，其中所述Dps融合蛋白与来源于细菌、真菌、寄生虫或癌症 的寡糖或多糖结合作为糖结合疫苗或诊断剂。使用Dps融合蛋白作为细菌糖结合疫苗的载 体的一个独特优势是Dps和寡糖或多糖抗原两者均可以来源于同一细菌。所述蛋白或肽含 有的适合于与碳水化合物结合的氨基酸可进一步促进与寡糖或多糖结合。
[0060] 本发明进一步提供了一种引起免疫应答的方法，所述方法包括向人或动物施用有 效量的Dps融合蛋白，所述Dps融合蛋白配制在药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或 控释制剂中。
[0061] 本发明进一步提供了免疫原性组合物，其包含多种Dps融合蛋白，所述Dps融合蛋 白任选地包含来源于不同的细菌或古细菌的Dps。
[0062] 在一些实施方案中，所述Dps融合蛋白可包含SEQ ID No: 1和SEQ ID No:2的氨 基酸序列，其中所述Dps可任选地被来自不同细菌或古细菌的Dps置换。
[0063] 本发明进一步提供了一种在动物或人中引起免疫应答的方法，所述方法包括向所 述动物或人施用有效量的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物配制在药学可接受的 媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
[0064] 本发明及其各个实施方案为开发新型和改良的疫苗、诊断测试和其他生物医学产 品提供了巨大的优势。两种或以上的蛋白或肽与Dps在不同的位点处的融合对于拓宽和增 强免疫应答并且因此疫苗的有效性是非常有用的。其还使Dps融合蛋白成为高度有效的诊 断剂以用于诊断感染性或非感染性疾病的诊断测试中。此外，Dps融合蛋白独特地是热稳 定的，能够承受高温下的处理。热稳定性对于疫苗和其他产品的制备和使用是高度优选的 特征，因为其允许疫苗产品在室温或更高温度下储存和装运，由此有利于疫苗在全世界的 分销和使用，尤其是在紧急情况下。本发明还提供了一种通过使用促进与碳水化合物结合 的Dps融合蛋白开发糖结合疫苗的新方法。
[0065] 本发明对于开发基于高度保守的肽抗原以提供广谱或通用保护作用的疫苗是非 常有用的。包含保守肽抗原诸如与Dps融合的融合肽和M2e的通用流感病毒疫苗是一种这 样的疫苗候选物，其是提供针对潜在的未来流感流行以及季节性流行病的有效对策所迫切 需要的。可以从本发明极大受益的此类疫苗的其他实例包括针对HIV、HPV、TB和癌症的那 些疫苗，所有这些疫苗均是公众卫生最关心的。
【附图说明】
[0066] 图1显示Dps融合蛋白的实例。P，肽。A，融合在D