含铁或包含可变量的铁。因此，融合蛋白可以通 过将它们与外来铁源诸如Fe(NH 4)2(SO4)混合而完全负载铁。除了铁以外，它们还可以负载 有其他金属离子，诸如锌、银、镍、铜和钴。可以想象铁或其他金属离子的结合可以为融合蛋 白提供稳定作用。它们还可以充当诊断测试的信号发射体。融合蛋白还可以用通常用来处 理疫苗抗原的剂处理，诸如甲醛，、戊二醛、乙烯亚胺和β -丙内酯，它们可以进一步稳定融 合蛋白。
[0116] 具有Dps融合蛋白的疫苗可以在盐水、缓冲盐水、干粉、控释制剂或其他药学上可 接受的载体或赋形剂中制备，用于通过肌内、皮内、皮下、透皮、经鼻、经肺、局部或口服途径 施用于人或动物的。疫苗还可以与佐剂诸如铝盐、磷酸钙、水包油乳液、CpG、MPL(单磷酰脂 质A)、toll-样受体配体、细胞因子、趋化因子和/或能够增加免疫应答的生长因子一起配 制。
[0117] 实施例
[0118] 下列是用来举例说明各种实施方案的实施例，但它们不限制本发明的范围。
[0119] 实施例1
[0120] Dps融合蛋白的构建、表达、纯化和表征
[0121] 蛋白或肽可以使用标准的重组DNA技术以不同的方式与Dps融合（图1)。Dps和 Dps融合蛋白的示意图在图2中给出。在此实施例中，蛋白或肽与Dps的N-和C-末端之 一或两者融合。与Dps融合的蛋白或肽的实施例和产生的所得到的融合蛋白列举在表1和 2中。在这些实施例中使用两种不同的Dps:大肠杆菌的EcDps(Genebank ID X69337. 1; Swiss-Prot 登记号 P0ABT2)和硫横矿硫化叶菌的 SsDps (Genebank ID AE006642. 1 ; Swiss-Prot ID P95855)〇
[0122] 1.融合蛋白基因的构建
[0123] 编码蛋白或肽的DNA序列与编码Dps的DNA序列融合，从而通过PCR(聚合酶链式 反应）扩增或DNA合成来产生融合蛋白基因。编码蛋白或肽的DNA序列通过逆翻译或从 GenBank数据库中的相应基因获得。因此，流感病毒M2e和融合肽的DNA编码序列可以分别 从Genebank ID CY033623. 1和CY033622. 1的已公开序列获得，并且编码HPV L2肽的那些 序列可以从Genebank ID AF536179. 1获得。
[0124] 表1.用于Dps融合蛋白的蛋白或肽
[0127] 表2. Dps融合蛋白的实施
[0128]
[0129] 对于Dps融合蛋白基因，在5'端处框内引入NdeI位点并且BamHl位点放置在3' 端处用于克隆入表达载体中（图3)。用于PCR的引物将与Dps末端的编码序列（~15个 核苷酸）框内连接的编码蛋白或肽的DNA序列整合在5'或3'端处。对于较长的肽诸如 M2e，覆盖~15个核苷酸的重叠引物用来整合肽的整个编码序列。含有SsDps或EcDps基 因（它们是合成的或从细菌DNA克隆的）的DNA质粒用作PCR中的模板。融合蛋白基因通 过PCR扩增并克隆进TA克隆载体（Invitrogen)中。在通过小型制备（mini-prep)分离载 体质粒后，使用用于表达且不含任何标记序列的NdeI和BamHl位点将融合蛋白基因克隆进 表达载体诸如pJexpress(DNA 2. 0)和pET 11或25(Novagen)中。可选地，使用DNA合成 服务提供商诸如DNA2.0(CA)合成整个融合蛋白基因。在DNA合成前，可以为在大肠杆菌中 的增强表达优化密码子。
[0130] 2. Dps融合蛋白的表达和纯化
[0131] 使用由表达载体和表达宿主细胞提供商概述的标准重组蛋白表达实验方案进行 表达。表达载体或质粒被转化至大肠杆菌表达宿主（BL21)中。细菌在37°C下在LB培养 基中生长过夜，并且以1:3的比率转移至新鲜的LB培养基中，最终OD 600nm为0.6- 1.2。 加入IPTG至0. 1 - 0. 5mM以诱导蛋白表达。IPTG添加后，细菌在37°C下培养4小时，然后 收获用于蛋白纯化。
[0132] 为了纯化融合蛋白，细菌通过以3, OOOg离心30min而沉淀，并悬浮在磷酸盐缓冲 盐水（PBS;20mM 磷酸盐、150mM NaCl，pH 7.4)或 TN 缓冲液（25mM Tris、150mM NaCl，pH 8.0)中。任选地加入溶菌酶至lmg/ml，然后在室温下温育30min。将悬浮液超声处理以裂 解细菌细胞。将溶胞产物以15, OOOg离心15min。收集上清液并通过0.2 μπι滤器过滤。通 过凝胶过滤使用Bio-gel Al. 5m或Sepharose CL-6B柱纯化上清液中的Dps融合蛋白。任 选地，在凝胶过滤前融合蛋白首先通过DEAE-Sepharose CL-6B柱纯化。融合蛋白用不连续 NaCl梯度（0. 2 - 0. 5M)从DEAE-S印harose柱被洗脱掉。利用Dps融合蛋白的热稳定性的 优势（参见实施例9和10)，纯化过程采用简单的热处理步骤（60°C持续10分钟）简化许 多，所述热处理步骤使大多数宿主蛋白变性，从而容易通过离心去除。
[0133] 使用蛋白浓缩仪以IOkDa的截止值将纯化的融合蛋白浓缩至~10mg/ml。通过二 金鸡宁酸（BCA)分析方法来确定蛋白浓度。
[0134] 3.融合蛋白的表征
[0135] 在变性条件下进行的SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）用来检查Dps融合蛋 白的单体的大小或分子量。
[0136] 利用Bio-Gel-AL 5m柱（I. 8X85cm)的凝胶过滤用来检查Dps融合蛋白相对于天 然Dps的大小或颗粒形成。检查的所有融合蛋白的峰的洗脱始终比天然Dps早1 - 5个级 分（每个2. 5ml)。这些结果显示，Dps融合蛋白展示的尺寸大于天然Dps，这与肽的加入有 关，因此其类似天然Dps是复合物或纳米颗粒。
[0137] 进行透射电子显微术以通过负染色可视化颗粒形成。在检查前采用磷钨酸钠染色 蛋白。
[0138] 实施例2
[0139] 具有SsDps和流感病毒肽的Dps融合蛋白的生成
[0140] 采用两种高度保守的流感病毒肽，M2e和融合肽，生成几种Dps融合蛋白（表 1和2)。它们包括M2e-SsDps(SEQ ID No:l)，其具有与SsDps的N-末端融合的M2e; SsDps-FP (SEQ ID No: 2)，其具有与SsDps的C-末端融合的融合肽；以及通过将M2e和Fp 分别融合至N-和C-末端制成的双肽融合蛋白M2e-SsDps-FP(SEQ ID No:3)。
[0141] 所有这三种融合蛋白以高水平表达，是可溶的，并容易纯化。SDS-PAGE显示与天然 Dps相比，Dps融合蛋白的单体表现出稍稍增加的分子量，其与肽的添加相一致。M2e-SsDps 和M2e-SsDps-FP的结果显示在图4中。
[0142] 在Bio-gel Al. 5柱上，所有融合蛋白始终在与天然Dps相同的位置处或比天然 Dps早1-5个级分被洗脱出来（图5)。这些结果显示Dps融合蛋白表现出与天然Dps相似 的尺寸或比天然Dps大的尺寸，这与肽抗原的加入有关，因此类似天然Dps是复合物或纳米 颗粒。颗粒形成进一步通过EM确认。双-肽融合蛋白M2e-SsDps-FP的图像显示在图6中。
[0143] 实施例3
[0144] 具有EcDps和流感病毒肽的Dps融合蛋白的生成
[0145] 为了证明融合蛋白可以用不同的Dps产生，以相同的方式用EcDps生成三个融合 蛋白，M2e-EcDps(SEQ ID No:4)、M2e-AN22EcDps(SEQ ID No:5)和 M2e-EcDps-FP(SEQ ID No:6)。基于SDS-PAGE和利用Bio-gel Al. 5柱的凝胶过滤，它们的表现与上述具有SsDps 的融合蛋白类似。它们所有三种均在与天然EcDps相同的位置处或比天然EcDps早1-5个 级分从Bio-Gel AL 5柱被洗脱出来。在M2e-AN22EcDps中，EcDps的前22个N-末端氨 基酸被剔除，并被M2e替代。
[0146] 实施例4
[0147] 具有附加的流感病毒肽的Dps融合蛋白的生成
[0148] 除了 M2e和融合肽以外，来自流感病毒的其他保守的蛋白或肽也可以与Dps融合 作为疫苗候选物或疫苗候选物的一部分，它们均提供通用的或广谱的保护作用。另外，相同 的肽可以融合至N-和C-末端两端，诸如M2e-SsDps-M2e。在此实施例中，使用来自流感病 毒的HA2的其他肽，包括依照以前所述的命名法命名的螺旋A、B、C和D (Bullough等人，自 然（Nature), 371:37-43, 1994)或它们的任意组合。螺旋A紧邻融合肽定位。由于在中性 和/或酸性pH下这些螺旋是HA2三聚体结构的一部分，它们可以适于利用Dps的C-末端3 次折叠界面（其中三个Dps亚基的C-末端紧靠在一起）在Dps融合蛋白的表面上形成三 聚体。一个实施例是在Dps的C-末端处整合了螺旋A的SsDps-螺旋A。可以加入融合肽 以产生融合蛋白SsDps-FP-螺旋A或螺旋A-SsDps-FP。螺旋B、C和D可以以相同的方式与 Dps融合。这些HA2螺旋和邻近序列或Dps的C-末端的长度可以延长或缩短以促进三聚体 形成。SsDps用作上述融合蛋白的实施例，并且也可以使用来自其他细菌或古细菌的Dps。
[0149] 实施例5
[0150] 具有来自HPV L2蛋白的保守肽的Dps融合蛋白的生成
[0151] 在此实施例中，来自HPV L2蛋白的两种高度保守的肽（aal7_36和aal08_120) (表1)与SsDps融合，所述两种保守的肽构成中和性表位以及HPV细胞结合位点。还使用 第一种肽的较长形式，aal2_36,其构成此区域处的完整细胞结合位点。因此，采用SsDps， L2 (17-36)-SsDps-L2 (108-120)和L2 (12-36)-SsDps-L2 (108-120) (SEQ ID No: 7)生成两种 双妝融合蛋白。
[0152] 这两种融合蛋白的表达和纯化显不在图7中。如具有流感病毒妝的Dps融合蛋白 那样，这两种HPV融合蛋白通过SDS-PAGE表现出增加的分子量，它们从Bio-Gel Al. 5柱比 天然SsDps较早地被洗脱掉，并且在EM下表现为纳米颗粒。
[0153] 实施例6
[0154] 具有其他蛋白或肽的Dps融合蛋白的生成
[0155] 除了前述实施例中所述的蛋白或肽以外，许多其他的蛋白或肽可以与Dps融合以 产生疫苗、免疫治疗剂以及诊断剂。这些包括来自人免疫缺陷病毒（HIV)和癌症的那些。
[0156] HIV gp41蛋白比gpl20更为保守，并且由独特的结构组分-融合肽（~16aa)、融 合肽近端区（FPPR ;~13aa)、N-末端七残基重复序列（HR1 ;~20aa)、C-末端七残基重 复序列（HR2 ;~32aa)和膜近端外部区（MPER，~20aa)组成。被广谱中和性单克隆抗体 2F5和4E10识别的保守肽序列位于MPER中。MPER以及其他组分诸如融合肽可以如图1中 所述与Dps融合，以产生可以提供广谱保护效应的疫苗。MPER可以融合至Dps的两个末端 (MPER-EcDps-MPER)。另外，融合肽、HRl和/或HR2还可以单独使用或与MPER组合使用以 产生融合蛋白，诸如 MPER-EcDps-FP、EcDps-FP 和 EcDps-HR2-MPER。由于 HRl 和 HR2 天然 地形成三聚体，它们可以以促进三聚体形成的方式与Dps融合，这可以允许递呈不仅线性 肽表位，而且递呈仅在三聚体结构中发现的构象表位。鉴于HIV高度可变的事实，可以通过 将两种以上的这些融合蛋白组合而制成疫苗以便包含尽可能多的这些保守肽，并且因此增 加了疫苗的功效。
[0157] 肾胚细胞瘤蛋白WTl见于各种癌症中，并且是癌症免疫治疗的主要靶标。在WTl 中已经鉴定了几种T细胞肽表位，并且它们显示在癌症患者的治疗中作为免疫治疗剂是有 效的，包括RMFPNAPYL(RL9)和CMTWNQMNL(CL9)。它们可以单独地或一起与Dps融合以产生 融合蛋白，诸如RL9-EcDps-RL9、CL9-EcDps-CL9和RL9-EcDps-CL9以增强它们的效应。
[0158] EcDps用作上述融合蛋白的实例，并且还可以使用来自其他细菌或古细菌的Dps。 对于在其中T细胞免疫至关重要的癌症免疫治疗中的应用，来自幽门螺杆菌或HP-NAP的 Dps可能是优选的，因为其已知具有免疫调节效应，该免疫调节效应将免疫应答转变为Thl 或细胞介导的免疫应答。因此，融合蛋白如RL9-HpDps-CL9可能是优选的。
[0159] 实施例7
[0160] Dps融合蛋白的可溶性
[0161] 在裂解细胞的高速离心后，细菌系统中表达的蛋白可以通过存在于上清液中而是 可溶的，或通过存在于沉淀物或包涵体中而是不溶的。优选Dps融合蛋白是完全可溶的或 至少部分可溶的，使得它们可以容易地被纯化。不溶的融合蛋白如果在变性条件下被增溶 后可以再复原为纳米颗粒，则仍然可以是有用的。上述实施例中描述的Dps融合蛋白所有 均是完全可溶的，并且容易地通过色谱法纯化，0. 2 μ m过滤并浓缩。然而，产生的所有Dps 融合体不都是完全可溶的。因此，FP-EcDps是不溶的，而FP-SsDps是部分可溶的。因此 Dps融合蛋白的溶解度依赖于蛋白或肽、Dps以及它们融合在一起的方式。融合肽本身是高 度疏水的和不溶的，这是来自所有有包膜的病毒的融合肽的共同特征。因此，值得注意的是 实际上可以产生完全和部分可溶的具有融合肽的Dps融合蛋白，如用SsDp S-FP、FP-SsDpS、 M2e-SsDps-FP 和 M2e-EcDps-FP (表 2)所显示的那样。