>[0162] 实施例8
[0163] 与Dps融合的肽抗原的抗原性和表面暴露
[0164] 具有流感病毒的M2e和/或融合肽的Dps融合蛋白的抗原性在免疫印迹和斑点印 迹实验中使用抗M2e单克隆抗体（16C2, Abeam)或羊抗HA血清进行评价。16C2抗体已经 广泛地用来评价M2e结构域。羊抗-HA血清是对H1N1(A/New Caledonia/20/99(H1N1)的 有效试剂，其针对纯化的HA蛋白产生。对于免疫印迹，蛋白在变性条件下通过SDS-PAGE分 离，然后印迹在尼龙膜上。16C2抗体与带有M2e的融合蛋白（M2e-SsDps和M2e-SsDps-FP) 反应，但不与天然SsDps蛋白反应（图8A)，和类似地，抗-HA血清仅与M2e-SsDps-FP反应， 但不与M2e-SsDps或SsDps反应（图8A)，这指示M2e和融合肽两者均与Dps合适地融合并 具有抗原性。
[0165] 在斑点印迹中，Dps融合蛋白在非变性条件下直接点样在纤维素膜上，即，测试未 处理的Dps融合蛋白纳米颗粒。获得类似的结果，即，特异性抗体仅与带有相应肽的融合蛋 白反应（图8A)。这些结果指示融合在N-末端和C-末端两端处的肽存在于Dps融合蛋白 的表面上并且具有抗原性。如期望的那样，与抗-HA血清的反应较弱，因为其针对整个HA 分子产生，而非针对融合肽产生。
[0166] 还测试了在C-末端处具有融合肽的Dps融合蛋白（SsDps-FP)。在免疫印迹和斑 点印迹中，其均仅与抗-HA血清反应。另外，在免疫印迹和斑点印迹中具有EcDps的Dps融 合蛋白（M2e-EcDps和M2e-EcDps-FP)以与具有SsDps的融合蛋白相似的方式表现，不同之 处在于与抗-HA血清的反应似乎比M2e-EcDps_FP更强。
[0167] 这些结果一起清楚地指示，在N-和/或C-末端处与Dps融合的M2e和融合肽具 有抗原性并且存在于融合蛋白纳米颗粒的外表面上。
[0168] 类似地，在斑点印迹和免疫印迹中使用针对整个L2蛋白的兔抗血清评价具有HPV 肽抗原的融合蛋白的抗原性。结果显示，在免疫印迹和斑点印迹中抗体与Dps融合蛋白 (L2 (12-36) -SsDps-L2 (108-120)和 L2 (17-36) -SsDps-L2 (108-120))两者均反应，但不与 SsDps反应（图8B)。这指示，融合的肽具有抗原性并且展示在Dps融合蛋白纳米颗粒的表 面上。
[0169] 实施例9
[0170] 具有SsDps的Dps融合蛋白的热稳定性
[0171] 为了评价Dps融合蛋白的热稳定性，在PBS中制备的具有融合蛋白的澄清的细胞 溶胞产物在60°C处理不同的时间段。在应激条件诸如热和强酸或强碱下，蛋白通常丧失溶 解度并形成沉淀物。结果显示，直至处理结束（60min) SsDps和SsDps融合蛋白均保持可溶 或保持在上清液中，没有明显的降解，包括在两端处分别地融合两种肽的融合蛋白。另一方 面，当蛋白溶液开始变浑浊时，大多数宿主细胞蛋白在刚2分钟后就形成聚集体并且沉淀。 通过以12, OOOg离心10min去除沉淀物。
[0172] 采用双-肽融合蛋白 M2e-SsDps-FP 和 L2 (12-36)-SsDps-L2 (108-120)的结果显 示图9A和9B中。显然在热处理结束时远超过50%的融合蛋白明显地仍然是稳定的。这通 过密度测量来确认。在热处理结束时或热处理期间的任何时间点时的损失量实际上是零或 极小。
[0173] 重要的是，在60°C下处理Ihr后纯化的SsDps融合蛋白，包括M2e-SsDps_FP和 L2 (12-36) -SsDps-L2 (108-120)，通过色谱法和EM确认仍然为纳米颗粒，并且在斑点印迹 和免疫印迹测试中均与特异性抗体反应。这些结果证明，具有SsDps的Dps融合蛋白在使 用的条件下是热稳定的。
[0174] 还通过在不同的温度（60、70、80或90 °C )下处理融合蛋白IOmin来检验 热稳定性。发现SsDps可以承受在80 °C下的处理lOmin，损失小于50 %。值得注 意的是，发现融合蛋白M2e-SsDps-FP与SsDps -样稳定，而其他的融合蛋白，包括 L2 (12-36)-SsDps-L2 (108-120)可以承受在70°C的处理lOmin。因此这些结果显示，SsDps 融合蛋白保留了天然SsDps的至少很大程度的热稳定性。考虑到这些融合蛋白中的一些在 两个末端处同时融合两种肽，值得注意的是实际上保留了如此高程度的耐热性，使得这些 融合蛋白远比大多数其他蛋白更稳定。
[0175] 实施例10
[0176] 具有EcDps的Dps融合蛋白的热稳定性
[0177] 大肠杆菌是中温生物。EcDps和EcDps融合蛋白不预期是热稳定的。因此，发现 天然EcDps和两种EcDps融合蛋白（M2e_Dps和M2e_EcDps_FP)当在60°C处理Ihr时均同 样稳定。采用M2e-EcDps的结果显示在图9C中。还在上述的不同温度下进行处理。EcDps 可以承受在70°C下的处理lOmin，损失小于50%。M2e-Dps和M2e-EcDps-FP融合蛋白两者 在该条件（70°C，10min)下与EcDps相比稍稍不太稳定，损失稍稍多一些，然而，仍然远低于 50%〇
[0178] 然而，实施例3中产生的M2e_ Δ N22EcDps在使用的相同条件下不是热稳定的，即， 在60°C下处理刚好10分钟后发生多于50%的损失，指示并不是所有融合蛋白均保持热稳 定性，并且热稳定性的保留取决于Dps的末端序列的保留。
[0179] 实施例11
[0180] Dps融合蛋白与碳水化合物的结合
[0181] 乳糖、蜜二糖和酵母甘露聚糖用作用于通过还原胺化与Dps或Dps融合蛋白结合 的碳水化合物或糖实例。甘露聚糖用IOmM醋酸钠 （pH 6.0)中的IOmM NaIO3在室温下氧 化lhr，然后在添加甘油（0. 1%，v/v)后在水中透析。二糖蜜二糖和乳糖在不氧化的情况使 用。对于结合，糖类与蛋白在200mM NaCl和50mM磷酸盐（pH 8.0)中混合，然后任选地添 加氰基硼氢化钠（5mg/ml)。甘露聚糖和蛋白以2-5mg/ml使用，二糖以30 - 150mg/ml使用。 混合物在室温下或37°C下保持不同的时间。结合物通过琼脂糖凝胶分析。使用Bio-gel Al. 5柱纯化具有甘露聚糖的结合物，并且通过在PBS中透析回收具有二糖的那些结合物。
[0182] 用所有测试的糖类获得与SsDps和SsDps融合蛋白的结合。在1 %琼脂糖和IOmM Tris-boric-EDTA 缓冲液（89mM, pH 8. 3 ;Sigma Chemical Co)中的琼脂糖凝胶电泳是一种 评价结合过程的非常有效的方法，其中通过与未结合的Dps或Dps融合蛋白相比改变的结 合物迀移模式来指示结合。分子在琼脂糖凝胶中的迀移受到尺寸以及电荷的影响。因此， 取决于使用的糖类，蛋白可能更快或更慢地移动，并且连接的糖分子越多，这种迀移的变化 变得越大。
[0183] 图10显示SsDps和M2e-SsDpS-FP与甘露聚糖、蜜二糖和乳糖的结合。融合蛋白 明显地与甘露聚糖、蜜二糖或乳糖结合，如SsDps那样，如与未结合的对照相比结合物较快 的迀移所示。通过SDS-PAGE，SsDps和融合蛋白与甘露聚糖的结合物由于它们的大尺寸导 致大多数被积层凝胶俘获。
[0184] 具有蜜二糖的结合物在斑点印迹中与天然鸡抗-aGal抗体反应（图11)。 抗-a Gal抗体使用蜜二糖-琼脂糖柱分离自正常的鸡血清。鸡，象人一样，也已知具有天 然的抗-a Gal抗体。采用未结合的Dps或Dps融合蛋白对照，没有观察到反应。融合蛋白 结合物的反应比Dps结合物更强（图11)。如果向抗体溶液中加入蜜二糖，则反应大幅度减 弱或被阻断。这些结果因此进一步确认糖类与Dps融合蛋白的结合，并且显示结合的糖类 与特异性抗体具有反应性。
[0185] 实施例12
[0186] Dps融合蛋白的免疫原性
[0187] 一组Balb/c小鼠 （η = 5)通过以50yg/小鼠与不完全弗氏佐剂联合肌内注射 M2e-SsDpS-FP融合蛋白而接种三次（第0、14和28天）。在免疫接种前1周和第二次或第 三次免疫接种后2周或3周采集血清样品。每个时间点的汇集血清样品使用来自每只小鼠 的相同部分产生，并用于免疫印迹和ELISA中以检测特异性抗体。使用从感染的MDCK细胞 纯化的灭活的HlNl全病毒粒子（A/New Caledonia/20/99)以及同一菌株的HA蛋白进行免 疫印迹，所述HA蛋白使用凝集素 （RCA 120)亲和色谱法从感染的MDCK细胞纯化，然后进行 Triton X-100 处理。
[0188] 全病毒粒子抗原含有所有病毒蛋白，包括M2和HA2。结果显示，免疫血清与M1/HA2 和M2蛋白两者均反应（图12A)，指示融合蛋白M2e-SsDp S-FP诱导针对M2e和融合肽的特 异性抗体，M2e和融合肽分别与M2和HA2蛋白相关。在HlNl病毒中，HA2蛋白与Ml蛋白 共同迀移（图12A)。抗-M2e抗体也可能与Ml在一定程度上反应，因为在Ml和M2之间的 前9个N-末端氨基酸是相同的。因此，通过使用纯化的HA蛋白证明诱导的抗-融合肽抗 体与HA2的反应（图12A)。
[0189] 测量抗_M2e抗体的ELISA程序已经被完全确立。因此，由融合蛋白生成 的抗_M2e抗体也通过ELISA进行测量。96孔板（Nunc)用1 μ g/ml合成的M2e肽 (MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD)在 4°C 以 100 μ 1/ 孔在 IOmM 碳酸盐缓冲液（pH9. 6)中包被 过夜。板用PBS-T (PBS+0. 05 % Tween 20)洗涤，并用PBS-T中的3 % BSA在37 °C封闭2小 时。血清样品在PBS-T/1 % BSA中连续稀释两倍，起始稀释度为1:400,并一式两份地加入至 板中。在37°C温育Ihr后，洗涤板并加入抗小鼠 IgG碱性磷酸酶结合物（Sigma Chemical Co)，然后在 37°C温育 lhr。加入底物 pNPP(Pierce Chemical Co)，并且测定 OD 410nm。终 点抗体效价确定为得到空白孔的本底之上2倍的OD值的最高稀释度。在第二次和第三次 免疫接种后的汇集血清样品的结果在图12B中给出。它们显示，诱导了抗-M2e IgG抗体并 在第三次免疫接种后大为增加。
[0190] 这些结果综合在一起显示，Dps融合蛋白具有免疫原性并且能够诱导针对与Dps 融合的蛋白或肽的特异性免疫应答。
【主权项】
1. 一种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的至少一种蛋白或肽，其中所述Dps融合蛋白 能够自组装成纳米颗粒，并且所述蛋白或肽存在于所述Dps融合蛋白的外表面上；其中所 述Dps融合蛋白与aGal表位共价结合。2. 权利要求1所述的Dps融合蛋白用于制备用于在动物或人中引起免疫应答的药物的 用途，其中所述药物以有效量向所述动物或人施用，并且所述Dps融合蛋白配制在药学可 接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。3. -种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的病毒融合肽，其中所述Dps融合蛋白能够自 组装成纳米颗粒，并且所述病毒融合肽存在于所述Dps融合蛋白的外表面上。4. 权利要求3所述的Dps融合蛋白用于制备用于在动物或人中引起免疫应答的药物的 用途，其中所述药物以有效量向所述动物或人施用，并且所述Dps融合蛋白配制在药学可 接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。5. -种Dps融合蛋白，其包含与Dps的N-末端和C-末端分开并同时融合的两种蛋白 或肽，其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒，并且所述蛋白或肽存在于所述Dps融 合蛋白的外表面上。6. 权利要求5所述的Dps融合蛋白，其中所述Dps融合蛋白还包含与Dps的内部位点 融合的一种蛋白或肽。7. 权利要求5所述的Dps融合蛋白用于制备用于在动物或人中引起免疫应答的药物的 用途，其中所述药物以有效量向所述动物或人施用，并且所述Dps融合蛋白配制在药学可 接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。8. -种Dps融合蛋白，其包含与Dps融合的一种蛋白或肽，其中所述蛋白或肽含有适合 于与碳水化合物结合的氨基酸；其中所述Dps融合蛋白能够自组装成纳米颗粒并与寡糖或 多糖共价结合。9. 权利要求8所述的Dps融合蛋白用于制备用于在动物或人中引起免疫应答的药物的 用途，其中所述药物以有效量向所述动物或人施用，并且所述Dps融合蛋白配制在药学可 接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。10. -种药物，包含有效量的流感病毒的M2e和融合肽，所述药物用于针对流感病毒引 起免疫应答，其中所述M2e和融合肽与载体蛋白融合作为融合蛋白，其中所述药物配制在 药学可接受的媒介物、载体、赋形剂、佐剂或控释制剂中。
【专利摘要】提供了新型纳米颗粒融合蛋白，其包含与Dps蛋白(来自饥饿细胞的DNA-结合蛋白)融合的蛋白或肽，其对开发新型和改良的疫苗、诊断测试和其他生物医学产品带来独特的优势。
【IPC分类】A61K39/12, A61K39/385, A61P31/12, A61K47/48, C07K19/00
【公开号】CN105399833
【申请号】CN201510685617
【发明人】倪亚炜
【申请人】Kj 生物科学有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2010年12月22日
【公告号】CN102711794A, CN102711794B, US9241986, US20130171181, US20160095917, WO2011082087A2, WO2011082087A3, WO2011082087A8