ps的N-末端处的一种蛋白或 肽；B，融合在Dps的C-末端处的一种蛋白或肽；C，融合在Dps的内部位点处的一种蛋白或 肽；D，融合在Dps的N-和C-末端两端处的两种蛋白或肽；E，融合在Dps的N-末端和内部 位点处的两种蛋白或肽；F，融合在Dps的C-末端和内部位点处的两种蛋白或肽；G，分别融 合在Dps的N-末端、C-末端和内部位点处的三种蛋白或肽。当一种以上的蛋白或肽与Dps 融合时，蛋白或肽可以相同或不同。
[0067] 图2显示下述的示意性图示：来自天然Dps的单体（A)，与蛋白或肽在Dps的N-和 C-末端两端处融合的Dps融合蛋白（B)，以及与蛋白或肽在Dps的N-和C-末端两端处融 合的Dps融合蛋白，寡糖或多糖通过所述蛋白或肽中包含的氨基酸连接到Dps，所述氨基酸 适合于这种连接（C)。尽管在图C中没有显示，寡糖或多糖还可以在存在有合适的氨基酸的 位点处与Dps连接。
[0068] 图3显不了在用于表达Dps融合蛋白的表达载体质粒中Dps融合蛋白基因的不意 性图示。
[0069] 图4显示了具有流感病毒肽的Dps融合蛋白的表达和纯化。图A显示了双-肽融 合蛋白M2e_SsDps_FP的表达。泳道1，分子量标记；泳道2和3,分别为未诱导和诱导的大 肠杆菌；泳道4和5,分别为来自诱导的大肠杆菌的细胞溶胞产物的上清液和沉淀物；泳道 6和7,细胞溶胞产物上清液和沉淀物（泳道4)，在65°C处理lOmin。箭头指示融合蛋白并 且箭头头部指示用于细胞溶解的溶菌酶。图B显示了与SsDps比较的两种纯化的SsDps融 合蛋白。泳道1，分子量标记；泳道2, SsDps ;泳道3,单-肽融合蛋白M2e-SsDps ;泳道4， 双-肽融合蛋白M2e-SsDps-FP。
[0070] 图5显示了 SsDps和融合蛋白M2e-SsDps-FP在Bio-gel AL 5柱上的色谱图。
[0071] 图6显不了双-肽Dps融合蛋白M2e_SsDps_FP在电子显微镜下的图像。标尺表 不 20nm〇
[0072] 图7显不具有HPV妝的Dps融合蛋白的表达和纯化。图A显不了两种 双-肽融合蛋白的表达。泳道1，分子量标记；泳道2和3,未诱导和用融合蛋 白L2 (12-36) -SsDps-L2 (108-120)诱导的大肠杆菌；泳道4和：未诱导和用融合蛋 白L2 (17-36) -SsDps-L2 (108-120)诱导的大肠杆菌。图B显示了纯化的融合蛋白， 泳道 1，分子量标记；泳道 2, SsDps ;泳道 3, L2 (12-36)-SsDps-L2 (108-120,泳道 4， L2(17-36)-SsDps-L2(108-120)。
[0073] 图8显示了 Dps融合蛋白的抗原性。图A显示了具有流感病毒肽的Dps融合蛋白 与特异性抗体通过免疫印迹和斑点印迹的反应。泳道l，SsDps ;泳道2，M2e-SsDpS ;泳道3， M2e-Dps-FP。Dps融合蛋白用抗-M2e单克隆抗体（16C2)或羊抗-HlNlHA血清探测。图B 显示具有HPV L2肽的Dps融合蛋白与兔抗HPV L2蛋白抗体的反应。泳道1，SsDps ;泳道 2, L2 (12-36) -SsDps-L2 (108-120);泳道 3, L2 (17-36) -SsDps-L2 (108-120)。一片 SDS-PAGE 凝胶或斑点印迹膜用考马斯蓝（CB)染色以确认蛋白的存在。
[0074] 图 9 显示 Dps 融合蛋白 M2e-SsDps-FP (A)、L2 (12-36) -SsDps-L2 (108-120) (B)和 M2e-EcDpS(C)的热稳定性。具有融合蛋白的细胞溶胞产物在60°C处理各种时间（分钟）， 然后以12, OOOg离心10min。上清液（Spt)和沉淀物（Pt)通过SDS-PAGE分离。箭头指示 Dps融合蛋白并且箭头头部指示用于细胞溶解的溶菌酶。
[0075] 图10显示了 SsDps和融合蛋白M2e-SsDpS-FP与甘露聚糖、蜜二糖和乳糖的结合。 反应在37°C下进行3天。反应混合物通过在1 %琼脂糖凝胶中电泳来分离。
[0076] 图11显示了在斑点印迹中，与蜜二糖结合的SsDps和融合蛋白M2e-SsDpS-FP 与天然鸡抗-a Gal抗体的反应。使用与蜜二糖结合的或未结合的SsDps和融合蛋白 M2e-SsDps-FP〇
[0077] 图12显示在小鼠中针对融合蛋白M2e-SsDps-FP产生的特异性血清与流感病毒的 M2和HA2蛋白通过免疫印迹（A)的反应和与M2e肽通过ELISA⑶的反应。在图A中，a) 考马斯蓝染色的凝胶；b)免疫印迹;M，预染色的分子量标记，泳道1，灭活的流感病毒全病 毒粒子（A/New Caledonia/20/99，H1N1);泳道 2, A/New Caledonia/20/99(H1N1)株的 HA 蛋白。白色箭头头部指示灭活的全病毒粒子中的M1/HA2。
【具体实施方式】
[0078] 定义
[0079] 字"抗原"和"免疫原"在本文中可互换使用，并且代表可以诱导特异性免疫应答 的分子或物质。
[0080] 在本文中使用的字"抗原性"是指与特异性抗体的反应能力。在本文中使用的字 "免疫原性"是指诱导特异性免疫应答的能力。
[0081] 术语"免疫应答"是指抗体介导的或细胞介导的免疫应答或两者。
[0082] 字"疫苗"是指用于治疗性治疗或主动或被动预防针对感染或非感染性疾病的免 疫接种的抗原组合物。
[0083] 在本文中使用的字"蛋白"是指通过肽键连接在一起的>100个氨基酸残基的链。 "肽"是指通过肽键连接在一起的< 100个氨基酸残基的链。蛋白或肽中的氨基酸序列以标 准形式显示，即，从氨基端（N-末端）至羧基端（C-末端）。
[0084] 术语"融合蛋白"表示一蛋白或肽与另一蛋白或肽通过它们各自的N-和C-末端 氨基酸残基之间的肽键而连接在一起或反之亦然，或通过将第一蛋白或肽通过插入的蛋白 或肽的N-和C-末端处的两个肽键插入至第二蛋白或肽的内部区域中而连接在一起。肽键 是一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间形成的共价化学键。在本文中使用的"融 合蛋白"通过在表达宿主中表达融合蛋白基因来产生，其中第一蛋白或肽的编码序列与第 二蛋白或肽的编码序列连接。
[0085] 术语"融合位点"是指与另一蛋白或肽通过肽键连接的蛋白或肽的位点或氨基酸 残基。
[0086] 字"纳米颗粒"是指尺寸在IOOnm以下的颗粒。
[0087] 字"碳水化合物（carbohydrate) "与"糖类"可互换使用，并且具有Cni (H2O) n的经 验公式。碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。单糖也称为简单糖。
[0088] 字"多糖"是指通过糖苷键连接在一起的>10个简单糖残基的链。"寡糖"是指通 过糖苷键连接在一起的< 10个简单糖残基的链。
[0089] 术语"重组DNA技术"是指操作并将两个或以上的DNA序列合并在一起的技术，其 包括重组、PCR(聚合酶链式反应）、体外诱变和直接DNA合成。这些技术记述在大量的已 发表的书籍和手册中，包括"分子生物学实验室指南（Current protocols in molecular biology) "（Ausubel 编辑 2008. John Wiley&Son)。
[0090] 术语"疾病状态"是指在动物或人中的任何异常改变，其可以由传染源或其他发生 机制导致。
[0091] 术语"传染原"和"病原体"可互换使用，并且是指传染原以及导致疾病的因子诸 如各种来源的毒素。
[0092] 字"一个（a) "或"一个（an) "意指"一个或多个"。
[0093] 术语"控释制剂"是指提供制剂中的活性成分的持续或控制释放的制剂。
[0094] 字"癌症"和"肿瘤"在本文中可互换使用。
[0095] 详细描沐
[0096] 使用纳米颗粒蛋白如Dps作为用于疫苗、诊断学和其他生物医学应用的载体蛋白 存在许多挑战。与外来蛋白或肽的融合可能破坏纳米颗粒形成，由此消除了作为纳米颗粒 的载体效应。融合的蛋白或肽抗原可能不存在于纳米颗粒的表面上或保留其抗原性。因 此，本发明显示当一种蛋白或肽与Dps的N-或C-末端融合时Dps保留了形成纳米颗粒的 能力。本发明进一步显示当两种蛋白或肽同时与Dps的N-和C-末端两端分别融合时Dps 仍保留了形成纳米颗粒的能力。其进一步显示单独地融合在Dps的N-或C-末端处或同时 融合在Dps的两个末端处的蛋白或肽存在于纳米颗粒的外表面上并且具有抗原性。如用结 合了来自流感病毒的两种肽抗原的Dps融合蛋白所证明的那样，它们也具有免疫原性。通 过色谱法以及电子显微术证明了纳米颗粒的形成。在斑点印迹（非变性）和免疫印迹（变 性）中采用针对肽抗原的已知特异性抗体均显示了表面呈现和抗原性。以前没有证明一种 或多种蛋白或肽抗原与Dps的融合和表面呈现。
[0097] 考虑到蛋白的氨基酸序列中的任何变化，包括外来蛋白或肽与其末端的融合，可 以潜在地破坏蛋白结构，对于Dps与众不同的是在N-末端以及C-末端处的融合能够发生 保留纳米颗粒的形成以及融合的外来蛋白或肽的表面呈现。尤其与众不同的是，当两种不 同的蛋白或肽同时与Dps的N-和C-末端分别融合时这也能够发生。这明显地将Dps与铁蛋 白区分开，铁蛋白仅允许与其N-末端融合的蛋白或肽的表面呈现（美国专利号7608268)。 如上所述，Dps的N-和/或C-末端序列的远端的位置未知并且可能充分地延伸到纳米颗粒 结构的内部中，如用SsDps的C-末端所观察到的那样（Gauss等人，生物化学（Biochemist ry)，45:10815-10827, 2006) dps是相对小的纳米颗粒。因此，尽管不希望受理论的约束，其 可能是由于有限的内部空间引起，与Dps末端序列融合的外来蛋白或肽不可能被容纳在纳 米颗粒的内部中，并且因此留在它们的表面上，即使末端序列的远端可能最初位于内部中。
[0098] Dps融合蛋白可以以许多不同的方式产生，包括图1以及SEQ ID No: 1-7中呈现 的那些方式。对于在末端序列处的融合，蛋白或肽可以分别紧邻N-或C-末端的第一个或 最后一个氨基酸融合，或可选地用于代替一部分或整个游离的N-或C-末端序列。蛋白或 肽还可以在三个环序列或四个螺旋中的一个或多个中插入至Dps的内部位点中。两个蛋白 或肽可以在两个末端处同时与Dps融合，每个在一个单独的末端处或一个在一个末端处而 另一个在内部位点处。两个蛋白或肽的位置可以交换。此外，三个蛋白或肽可以与Dps同 时融合，每个在一个单独的位点处-N-末端、C-末端和内部位点。在融合位点处，在蛋白 或肽和Dps蛋白之间可以引入间隔序列或连接序列。例如，一个或多个已知为螺旋断开物 (breaker)的甘氨酸或脯氨酸氨基酸可以用作此类间隔区，以允许蛋白或肽与融合蛋白的 Dps部分分开折叠。
[0099] 如上面指出和实施例中描述的那样，通过电子显微镜术和色谱法证明了纳米颗粒 形成。要理解的是这些方法不能确定纳米颗粒中亚基的确切数目。尽管有可能Dps融合蛋 白也由12个亚基组成，但有可能亚基的数目可以多于或少于12个，并且纳米颗粒的尺寸也 可以变化，这取决于融合的蛋白或肽。因此，亚基数目不是12个的Dps融合蛋白也在本发 明的范围内。
[0100] 来自病毒、细菌、真菌、寄生虫、癌症和其他疾病状态的任何蛋白或肽可以用于与 Dps融合以产生疫苗或诊断剂。然而，肽或肽抗原IOOaa)可能是优选的，因为它们较小 并且可以容易地与Dps融合，而没有干扰纳米颗粒形成的可能性。肽抗原也更好地被确定 并且通常代表用于诱导保护性免疫的蛋白抗原的关键或保守抗体或T细胞表位。肽抗原的 一些实例已经在上面进行了描述。
[0101] Dps广泛地来源于原核生物并且没有在动物或人中被发现。因此，其相对于其他载 体蛋白诸如铁蛋白和热休克蛋白是有利的，所述其他载体蛋白也在动物和人中被发现，并 且当用于疫苗中时可能有导致不希望的自体免疫性的可能性。采用Dps融合蛋白疫苗的另 一个独特的优势是Dps可获自细菌或古细菌的许多不同的家族。任何指定来源的Dps可以 具有其自身独特的和新的特征，这些特征可以更好地适于给定的融合蛋白疫苗或诊断剂。 例如，一些Dps蛋白诸如大肠杆菌的Dps (EcDps) (Swiss-Prot登记号P0ABT2)具有相对长 的N-末端，而其他的诸如耻垢分枝杆菌Dps (MsDps) (Swiss-Prot登记号P0C558)具有相对 长的C-末端。因此，对于给定的融合蛋白，可以评价来自不同来源的Dps以基于结构、生化 和免疫学性质选择最合适的一种。此外，可以形成包含两种或以上融合蛋白的组合物以用 于疫苗和其他生物医学应用，所述两种或以上融合蛋白具有来自细菌或古细菌的不同家族 的Dps。此类组合物可以为给定的蛋白或肽利用最佳的Dps融合蛋白并且因此使每个蛋白 或肽的效应最大化。此类组合物也可以有助于消除干扰，当与同一个载体蛋白分别地连接 的两个抗原一起使用时可能发生干扰。
[0102] 因此，Dps可以来自于通常与人和动物相关的细菌，诸如埃希氏菌属 (Escherichia)、乳杆菌属（Lactobacillus)和拟杆菌属（Bacteroides)的成员。Dps 还可 以来自于嗜极端或嗜超高温细菌或古细菌，诸如硫磺矿硫化叶菌和耐辐射球菌。Dps还可以 来自于致病菌。致病菌的实例可以包括肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)、幽门螺 杆菌、空肠弯曲杆菌和伤寒沙门氏菌。来自这些细菌的Dps本身可以提供针对由这些细菌 引起的疾病的保护效应。因此，除了充当载体以外，Dps还可以针对其来源的细菌提供保护 作用。不像来自幽门螺杆菌（HpDps)的其他Dps，也已知为HP-NAP，具有免疫刺激效应（de Bernard 和 D' Elios, T