oxicon. 56:1186-1192, 2010)。因此，用 HpDps 制成的融合蛋白可能 具有佐剂作用，其增强针对融合的蛋白或肽抗原的免疫应答。
[0103] 两种蛋白或肽抗原在N-和C-末端两端处分别的融合以及两种抗原的表面呈现可 特别地可用于增强和拓宽免疫应答。即，同一抗原的两个拷贝可以与N-和C-末端两端分 别地融合从而将呈现的蛋白或肽的数目加倍并且由此增强免疫应答。另一方面，两种不同 的抗原可以与N-和C-末端两端分别地融合从而拓宽免疫应答，这可以特别地用于开发意 在提供广谱或通用保护作用的疫苗。包含两种不同的蛋白或肽抗原的疫苗可以用其中两种 蛋白或肽在Dps的不同的位点处同时融合的一种Dps融合蛋白或用两种Dps融合蛋白（每 种融合蛋白含有在一个或多个位点处与Dps融合的一种蛋白或多肽）来制成。还要理解， 各种肽可以作为单个拷贝或串联的多个拷贝与Dps融合。
[0104] Dps同时融合和表面呈现一种以上的蛋白或肽抗原的能力对基于保守肽抗原的 疫苗带来了极大的优点，因为经常存在来自于病原体、癌症或其他疾病状态的一种以上的 此类保守抗原。流感病毒经历恒定的抗原性改变，这些改变对开发用于控制流感流行和大 范围流行的疫苗提出了极大的挑战。迫切需要一种通用的流感疫苗，其可以用来控制季 节性流行以及大范围流行，无需每年改变疫苗抗原。其中，流感病毒的M2e和融合肽（FP) 是最高度保守的表位或肽抗原并且因此非常适合于通用型流感疫苗。因此，在实施例2 和3中，M2e和融合肽两者独特地与Dps的N-和C-末端分别地融合（M2e-SsDps-FP和 M2e-EcDps-FP)，并且得到的融合蛋白具有免疫原性，如实施例12中用M2e-SsDps-FP所示 的那样。M2e是次要包膜蛋白M2的24个aa胞外结构域，并且融合肽按Chun等人（疫苗 (Vaccine) 26:6068-6076, 2008)所述的例子由主要包膜蛋白HA的HA2部分的前14个aa组 成。另外，还可以以与实施例4中所述的相同方式掺入或加入其他保守的肽，诸如HA2的螺 旋A、B、C和D。以前没有人将流感病毒的两种独立的保守肽与Dps或其他纳米颗粒蛋白载 体融合使得两种肽都暴露在表面上。
[0105] 另一疫苗候选物是基于两种或更多种高度保守的HPV L2蛋白肽的通用型HPV疫 苗。因此，这两种肽L2 (aal2-36)和L2 (aal08-120)分别融合于Dps的N-和C-末端。来 自HPV L2蛋白的L2 (12-36)和L2 (108-120)肽构成关键性的细胞结合位点，并且每种肽还 带有中和性表位（Karanam等人，2009)。通过掺入这两种高度保守的肽，可以拓宽针对不同 致癌HPV类型的保护作用。还可以使用来自L2和其他蛋白的可选的或另外的保守肽。以 前没有人将HPV L2蛋白的两种独立的保守肽与Dps或其他纳米颗粒蛋白载体融合，使得得 到的融合蛋白是可溶的以及热稳定的。
[0106] 还有另一种Dps融合蛋白疫苗候选物是包含与Dps融合的一种或多种保守的蛋 白或肽抗原的HIV疫苗，包括被中和性单克隆抗体广泛识别的那些。这些保守的HIV蛋白 或肽抗原包括被中和性单克隆抗体（包括2F5、4E10、Z13el、VRCOl和PG16)广泛识别的表 位（Shi 等人，生物化学（J Biol Chem.) 285:24290-24298, 2010 ;Burton 和 Weiss,科学 (Science)，329:770-773,2010)。它们中的许多见于gp41的不同区域中（FP、HR1、HR2和 MPER)，包括融合肽。如图1和实施例6中所述，它们可以容易地与Dps融合为可以提供较 宽的保护效应的疫苗。
[0107] 还有另一个疫苗候选物实例是用于治疗和预防癌症的包含肿瘤相关抗原的疫苗。 肿瘤相关抗原经常由肽制成，包括来自WTl蛋白的那些。已经发现来自WTl的几种肽作为针 对癌症的免疫治疗性疫苗是有效的，包括RMFPNAPYL和SLGEQQYSV(Oka等人，Curr. Opinion in Immunol. 20:211-220)。它们可以容易地与Dpa融合为疫苗候选物。由于T-细胞免疫 在清除癌症中是至关重要的，来自幽门螺杆菌（HpDps)的Dps可能是优选的，因为其已知具 有免疫调节效应，该免疫调节效应将免疫应答转变为Thl或细胞介导的免疫应答。可以对 针对结核分枝杆菌（TB)的疫苗采用相同的策略，因为TB是细胞内病原体。对于此疫苗可 以与HpDps -起使用的抗原可以包括来自TB的ESAT-6、Ag85A和其他抗原的那些免疫显性 表位。
[0108] 对于天然形成三聚体结构的蛋白或肽，本发明还表现为由融合在Dps的N-或 C-末端处的蛋白或肽形成三聚体结构。对于这种应用，与C-末端的融合可能是优选的，因 为来自三个亚基的C-末端在C-末端3次折叠界面处紧靠在一起。三聚体形成蛋白或肽的 实例包括流感病毒的HA2和HIV的gp41。要理解的是，可以通过这种蛋白或肽的恰好三聚 体形成区诸如HA2的螺旋A和gp41的HRl形成三聚体。可以引入连接序列诸如来自酵母 亮氨酸拉链GCM的连接序列以促进三聚体形成。另外，蛋白或肽或Dps的末端序列的长度 可以延长或缩短以促进三聚体形成。三聚体形成将允许呈现不仅线性表位而且仅见于三聚 体结构中的构象表位。通过电子显微术、晶体学的结构分析，和/或使用识别特异性构象表 位的抗体来证明三聚体形成。
[0109] 病毒融合肽见于所有包膜病毒中，包膜病毒依赖于细胞融合以引发感染。此 类包膜病毒包括流感病毒、HIV、登革热病毒、呼吸道合胞病毒和西尼罗病毒。众所 周知，病毒融合肽自身是不溶的并且由于其疏水性而难以处置（Chun等人，疫苗 (Vaccine) 26:6068-6076, 2008)，并且在其N-末端处具有融合肽的流感病毒HA2蛋白自身 作为重组蛋白不能表达（Swalley等人，生物化学（Biochemistry)43:5902_5911，2004)。本 发明显示，可以产生具有病毒融合肽的可溶性Dps融合蛋白，尤其是当该融合肽与Dps的 C-末端融合时，如实施例2、3和7中所示。由于融合肽是包膜病毒中最保守的序列，这种 Dps融合蛋白作为疫苗抗原以及作为检测这些病原体的诊断试剂将非常有用，所述诊断试 剂通过测量动物或人中针对所述融合肽的特异性抗体来检测。
[0110] 热稳定性对于疫苗产品是非常需要的特性，因为其可以显著地减少疫苗的储 存、分销和使用的物流需求。在远高于75°C的温度下最适生长的嗜超高温细菌或古细 菌的Dps可以承受高温下的处理，如采用硫磺矿硫化叶菌的Dps(SsDps)所观察到的那 样（Wiedenheft 等人，美国国家科学院院刊（Proc Natl Acad Sci USA) 102:10551 -10556, 2005)。我们进一步显示SsDps是稳定的或在高温（彡60°C )下处理Ihr后仍然是 可溶的纳米颗粒。然而，与蛋白或肽的融合可能彻底地消除这种承受热的能力。因此，本发 明显示SsDps融合蛋白当在相同条件下处理时保持稳定，即使采用融合在Dps的两个末端 处的蛋白或肽。在处理后融合蛋白保持为纳米颗粒，并且与Dps融合的蛋白或肽保持抗原 性。本发明进一步显示，与具有来自大肠杆菌的Dps (EcDps)的融合蛋白在这种条件下也是 稳定的。这也是非常出人意料的，因为大肠杆菌是中温生物一一在适中的温度（25 - 40°C) 下最佳生长的一种生物体或微生物。然而，当在不同温度出〇, 70, 80或90°C )下测试时， Dps融合蛋白不能承受与天然Dps-样高的温度，例外是M2e-SsDpS-FP，如实施例9和10 中所示。尽管如此，值得注意的是，融合蛋白实际上保留了很大程度的初始热稳定性，这使 得它们远比大多数其他蛋白稳定得多。然而，由于其中EcDps的游离N-末端的前22个氨 基酸缺失并用M2e替代的M2e- △ N22EcDps是对热不稳定的，因此所有融合蛋白没有保留热 稳定性，提示热稳定性依靠末端序列的保留和/或蛋白或肽的融合方式。
[0111] 除了疫苗以外，Dps融合蛋白可以用作用于诊断感染性或非感染性疾病的诊断剂。 例如，它们可以用作免疫测定诸如ELISA (酶联免疫吸附测定）和用于检测对与Dps融合的 蛋白或肽特异的抗体的免疫印迹中的抗原。在微阵列形式中，具有不同蛋白或肽的Dps融 合蛋白可以一起用于检测一定范围的特异性抗体。肽适体也可以与Dps融合用于诊断。它 们是10-20个氨基酸的短可变肽结构域，其与特异性靶标或受体结合。Dps融合蛋白可以 进一步与酶或荧光染料结合或负载有铁或其他金属作为检测量度或信号发射体。此外，Dps 融合蛋白可以用来产生针对与Dps融合的蛋白或肽的特异性多克隆或单克隆抗体，后者又 可以用作诊断剂以检测蛋白或肽，或与其相关的病原体或细胞。来自嗜超高温生物或其他 嗜极端生物的Dps，诸如SsDps，对于诊断应用是优选的，因为嗜超高温生物或其他嗜极端 生物很少与动物或人接触，并且因此没有或具有很少的交叉反应性机会。
[0112] 可以使用本领域中熟知的重组DNA技术通过一个或多个氨基酸的置换、插入或缺 失来修饰Dps或Dps融合蛋白。一种这样的修饰是修饰Dps的末端和内部序列以优化融合 蛋白的颗粒形成和抗原递呈。例如，附加的氨基酸残基可以添加至N-或C-末端以延长游 离的末端序列以确保末端和与它们融合的蛋白或肽的全部表面暴露，并且为同一目的，在 一些情况下可以从N-或C-末端将氨基酸剔除。一种另外的修饰是制备嵌合Dps蛋白，诸 如具有来自一个Dps的一个或两个末端序列以及来自另一 Dps的内部序列从而确保N-和 C-末端两端均适宜地在表面上延伸的一种嵌合Dps蛋白。另一种修饰是通过改变参与铁结 合的氨基酸来消除铁结合活性。然而，此功能可以不去处理，因为通过铁结合阻止自由基生 成可能对疫苗和其他产品是有益的。
[0113] Dps融合蛋白可以进一步通过与碳水化合物分子结合或共价连接来修饰。一种这 样的碳水化合物分子是a Gal表位（Gal a l-3Gal β l_4GlcNAc)或其类似物。人和灵长类 动物天然地具有非常高的抗aGal抗体效价。因此，将此a Gal表位与融合蛋白连接允许 形成抗原-抗体复合物，该复合物又可以促进抗原递呈并增强针对与Dps融合的蛋白或肽 的免疫应答。尽管人抗a Gal抗体与Gal a l-3Gal β l_4GlcNAc结构反应反应最强，但它们 也与蜜二糖（Gala l-6Glc)强烈地反应。结果，蜜二糖已经被用作这些人抗体的亲和纯化 的配体（Galili等人实验医学（J. Exp. Med. ) 160:1519-1531)。在实施例11中，通过还原胺 化将蜜二糖成功地与双-肽Dps融合蛋白M2e-SsDpS-FP和SsDps连接。还原胺化将碳水 化合物分子与蛋白上赖氨酸残基的ε-氨基连接并且是被最广泛使用和最温和的碳水化 合物结合方法之一。M2e或FP均不含有任何赖氨酸残基，并且因此采用此方法它们的结构 不受结合的影响。除了 aGal表位以外，其它和CiGal表位结构或功能类似的能促进抗原 递呈并增强免疫应答的碳水化合物分子也可以按照本发明来和Dps融合蛋白结合或共价 连接。
[0114] 此外，Dps融合蛋白可以用作寡糖或多糖抗原的载体蛋白以产生糖结合疫苗，其 由与蛋白载体共价连接的碳水化合物抗原组成。糖结合疫苗是一大类针对细菌感染性疾 病的疫苗，并且正在针对其他感染性和非感染性疾病（包括真菌和癌症）进行开发。通过 与蛋白载体连接，碳水化合物抗原成为T细胞依赖性的，即，它们显示出在反复免疫或免疫 记忆时的强化效应。细菌和真菌多糖抗原可以来自于各种细菌和真菌病原体，包括肺炎 链球菌（Streptococcus pneumonia)、脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitides)、空肠 弯曲杆菌（Campylobacter jejuni)、流感嗜血菌（Haemophilus influenzae)、B 组链球菌 (group B Streptococcus)、弗氏志贺菌（Shigella flexneri)、炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi)、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)和白色念珠菌（Candida albican)。 实施例11证明了酵母甘露聚糖多糖与Dps融合蛋白M2e-SsDps-FP通过还原胺化的成功结 合。富含赖氨酸或其他合适的氨基酸的肽可以融合于或插入至Dps的N-和C-末端之一或 两者，以进一步促进结合，如图2中所述。因此，除了 Dps内现有的结合位点以外，为与Dps 融合的肽提供固定数目的附加结合位点。富含赖氨酸的肽的实例可以容易地在病毒和细 菌蛋白中找到，诸如水疱性口炎病毒的基质蛋白的N-末端前20个氨基酸（Swiss Prot登 记号P03519)。与Dps融合的肽可以包含其他的氨基酸，诸如半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸 和酪氨酸，它们均适合于采用其他方法的结合（Pozsgay和Kubler-Kielb,碳水化合物基 疫苗（Carbohydrate-based vaccines)，Rene Roy (编辑）·第 36-70 页· ACS, Washington DC. 2008)。优选该肽含有至少两个适合于与碳水化合物结合的氨基酸。使用Dps融合蛋白 作为细菌糖结合疫苗的载体的一个独特优势是Dps和多糖抗原两者均可以来源于同一细 菌。当使用来自细菌的不同家族的Dps时，含有合适的氨基酸的肽与Dps的融合因此提供 了用于连接碳水化合物抗原的合适氨基酸残基的一致的碱基数目。这相对于使用天然Dps 作为用于糖结合疫苗的载体蛋白提供了明显的优势。除了疫苗以外，Dps融合蛋白糖结合 物还可以用作诊断剂。
[0115] Dps融合蛋白在细菌表达系统中以高收率制备，细菌表达系统是高效的且成本低。 它们可以使用标准的纯化技术纯化，包括沉淀、离子交换和尺寸排阻色谱法。在细菌表达系 统中表达后纯化的Dps融合蛋白可以不包