专利名称：降解河豚毒素的提取液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及药用微生物开发和利用领域，更具体地涉及一种从细菌发酵液中制备可降解河豚毒素提取液的方法，以及由其提取得到的河豚毒素降解物质提取液。
背景技术：
河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX),是一种氨基全轻基喹唑啉的生物碱,为一种毒性极强的神经毒素，通过特异性阻断细胞膜上的电压门控钠离子通道，造成全身麻痹、最终死于呼吸和回流衰竭。TTX中毒潜伏期很短，短至10-30min，长至3_6h发病，发病急，如果抢救不及时，中毒后最快的IOmin内死亡，最迟4-6h死亡。临床治疗只能依赖于催吐、洗胃、导泻等减少毒物的吸收的方法，以及使用肾上腺皮质激素，提高组织对毒素的耐受性。目前尚无有效的解毒剂。目前已有通过制备河豚毒素抗体来阻断河豚毒素与其受体钠离子通道的研究报道，但还没有发现存在直接降解河豚毒素的药物。
发明内容
本发明发现，I株产TTX的细菌不但能合成河豚毒素，而且其发酵液中同时存在降解河豚毒素的物质。本发明的主要内容是:通过人工丢失产TTX细菌的质粒，使其失去产TTX的能力但却可以保留生产降解TTX的物质，通过抽提失去质粒的细菌发酵液，可获取降解河豚毒素的物质。本发明提供了人工造成质粒丢失的方法、质粒丢失的检测方法、以及降解河豚毒素物质的制备方法。降解河豚毒素物质可用作河豚毒素中毒的解毒药的开发和相关的科学研究。本发明的一个目的在于提供一种提取降解河豚毒素的物质的方法，包括如下步骤:(I)将质粒丢失的产河豚毒素的细菌发酵培养至少48小时(优选48-66小时，更优选67-96小时)，离心收集细胞，优选在4°C下4000 Xg离心30min后收集细胞；(2)用0.1%-1%乙酸(优选用1%的乙酸)溶解细胞，超声波破碎细胞；(3)95-105°C (优选100°C )煮20_25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)过滤上清；(5)对过滤液过活性碳柱，洗脱液的配方为:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ； (6)洗脱液在40-50°C (优选45°C )减压浓缩，冷冻干燥；(7)溶于无菌去离子水中；(8)过 Bio-Gel P2 柱子；(9)用0.02-0.05M (优选0.03M)乙酸洗脱，收集洗脱液；(10)洗脱液再用 C18Sep_Pak cartridges 过柱；(11)用5-20 ml0.3%的乙酸洗脱，优选用IOml0.3%的乙酸洗脱，收集洗脱液；
(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在无菌去离子水中，得到降解河豚毒素的物质的提取液。在一实施方式中，本发明所述的方法进一步包括以下检测步骤:将滤液作为待测样本,调整pH值为6.5-7.4，用ELISA法检测样本中的河豚毒素。在一实施方式中，本发明的提供一种提取降解河豚毒素的物质的方法，包括如下步骤:(I)将质粒丢失的产河豚毒素的细菌发酵培养至少48小时，4°C下4000Xg离心30min收集细胞；(2)用0.1%乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞；(3) 100°C煮20_25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)过滤上清；(5)对过滤液过活性碳柱，洗脱液的配方为:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ；(6)洗脱液在45 °C减压浓缩，冷冻干燥；
(7)溶于2ml无菌去离子水中；(8)过 Bio-Gel P2 柱子；(9)用0.03M乙酸洗脱，从洗脱液流出开始收集,收集2ml ；(10)洗脱液再用 C18Sep_Pak cartridges 过柱；(11)用IOml0.3%的乙酸洗脱，从第二个柱体积洗脱液流出开始收集，收集两个柱体积的洗脱液；(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在Iml无菌去离子水中；(14)将滤液作为待测样本，调整pH值为6.5-7.4，用ELISA法检测样本中的河豚毒素。在本发明的一实施方式中，所述气单胞菌可以是软体动物气单胞菌(Aeromonas molluscorum),也可以是其它产河豚毒素的气单胞菌，例如来自假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌(Shewanella)、交替单胞菌(Alteromonas)、芽抱杆菌(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产喊菌属(Alcaligenes)、黄杆菌属(Flavobacterium)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、微球菌属(Micrococcus)、莫拉菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、放线菌(Actinomycetes)、柄杆菌属(Caulobacter)等类群的产TTX细菌。在本发明的一实施方式中，造成所述的产河豚毒素的细菌丢失质粒的人工发酵培养方法，包括如下步骤:( I)将所述的产河豚毒素细菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基中；(2)20-280C (优选23°C )下，200-450转/分钟(优选225转/分钟)，至少培养48小时。在本发明的一实施方式中，所述ORI液体培养基的组成为:0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，0.2 %大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088 %柠檬酸铁，3 % NaCl，余量为蒸馏水，PH7-8.5 (优选 pH8.0)。
在本发明的一实施方式中，所述ORI液体培养基的制备方法(IOOOml):在800ml去离子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，Ig酵母抽提物(OXOID公司)，30g氯化钠(宜兴市第二化学试剂厂)和0.5g L-精氨酸(国药集团化学试剂有限公司)，搅拌溶解后，再加入0.88g柠檬酸铁(国药集团化学试剂有限公司)，继续搅拌，直到完全溶解后，加入去离子水定容至1000ml，并调节PH至7-8.5 (优选PH8.0)后封口灭菌。在本发明的一实施方式中，所述的检测步骤中的ELISA法检测包括如下步骤:(I)在固定有抗原的酶标板上分别加入TTX标准品，待测样本和添加了 TTX标准品的待测样本；(2)在酶标板上加入TTX的特异性抗体溶液；(3) 20-400C (优选室温或37°C )孵育至反应完全，加入洗涤液洗涤酶标板3次；(4)加入酶标二抗，20-40°C (优选室温或37°C )孵育至反应完全，加入洗涤液洗涤酶标板3次；(5)加入显色液，37°C孵育10_15min后，每孔加入终止液以终止反应；(6)结果检测:将酶标板插入酶标仪中,检测450nm处的吸光值。在本发明的一实施方式中，所述ELISA法的步骤(I)中，添加了 TTX标准品(Sigma-Aldrich公司，产品号:T8024_1MG)的待测样本，其TTX标准品添加终浓度为25_200ng/mL。
在本发明的一实施方式中，所述ELISA法的步骤(2)中的特异性抗体为TTX的特异性单抗(北京中卫食品卫生科技公司，产品号:5561)。在本发明的一实施方式中，所述ELISA法的步骤(3)中，孵育至反应完全所需时间为1.5h ;所述ELISA法的步骤(4)中孵育至反应完全为lh。本发明的另一目的在于提供一种造成产河豚毒素的气单胞菌丢失质粒的人工发酵培养方法，包括如下步骤:(I)将产河豚毒素的气单胞菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基中；(2) 23°C下，225转/分钟，至少培养48小时。在本发明的一实施方式中，上述方法采用的所述ORI液体培养基的组成为:0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，0.2%大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088%柠檬酸铁，3% NaCl,余量为蒸馏水，PH7-8.5 (优选ρΗ8.0)。本发明的另一目的在于提供一种实时定量PCR检测方法，其用于检测上述任一方法采用的细菌或气单胞菌的质粒丢失，包括如下步骤:(I)定量PCR标准曲线制作:将提取的Ne-1质粒用无菌水进行10倍系列稀释，分别稀释成6个梯度，作为模板，进行荧光定量PCR来建立标准曲线，按以下公式计算质粒拷贝数:质粒拷贝数(copies.μ L-1) =6.02 X IO23 (copies.moF1) X 质粒浓度(g.μ L-1)/质粒分子量(g.moF1)；(2)实时定量PCR体系:将待测样品和标准品分别做3个重复置于同一次实验中进行反应，按下列组分配制PCR反应液:iQ SYBR Green Supermixl2.5 μ 1，PCR正向引物(2ymol/L) I μ 1，PCR反向引物(2ymol/L) 1μ 1，质粒模板2 μ 1，加入ddH20补足至25 μ 1，PCR正向引物序列5’ -GACAAGGCTCGGAGACACGCA-3’，PCR反向引物序列5’ -TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC-3’，所述待测样品为所述丢失质粒的气单胞菌或所述丢失质粒的细菌；(3)实时定量PCR反应程序:95°C 5min预变性质粒DNA模板，然后以95°C 30s、59°C 30s,72°C 30s进行30个温度变化循环，80°C ls、82°C Is进行I个循环，最后59°C至95°C延伸20s，最后，利用随机软件进行熔解曲线分析和CT值分析，确定质粒拷贝数；(4)利用含精氨酸的ORI培养基培养至少48小时后，质粒完全丢失。本发明的另一目的在于提供一种根据上述方法所提取制备得到的河豚毒素降解物质的提取液。本发明的另一目的在于提供上述的河豚毒素降解物质的提取液在制备用于治疗河豚毒素中毒的药物中的应用。本发明第一公开了通过改变培养基成分的方法，人工造成气单胞菌Aeromonasmolluscorum质粒丢失,使其失去原具备的合成TTX的能力,其特征在于,包括如下步骤:(I)将细菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基(0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，
0.2%大豆蛋白胨，0.1%酵母抽提物，0.088%柠檬酸铁，3% NaCl，余量为蒸馏水，ρΗ8.0)中；23°C下，225转/分钟，培养·48小时。(2)定量PCR标准曲线制作:将提取的标准质粒用无菌水进行10倍系列稀释，分别稀释成6个梯度，作为模板(稀释的时候用移液枪吹打20次，振荡5s后离心，使溶液充分混匀)，进行荧光定量PCR来建立标准曲线。按以下公式计算质粒拷贝数:质粒拷贝数(copies.μ L-1) =6.02 X IO23 (copies.moF1) X 质粒浓度(g.μ L-1) / 质粒分子量(g.moF1)。(3)实时定量PCR体系:将待测样品和标准品分别做3个重复置于同一次实验中进行反应，按下列组分配制PCR反应液:iQ SYBR Green Supermixl2.5 μ 1，PCR正向引物(2ymol/L) I μ 1，PCR反向引物(2ymol/L) 1μ 1，质粒模板2 μ 1，加入ddH20补足至25 μ I。PCR正向引物序列5’ -GACAAGGCTCGGAGACACGCA-3’ ；PCR反向引物序列5’ -TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC-3’。(4)实时定量PCR反应程序:95°C 5min 预变性，然后以 95°C 30s、59°C 30s,72°C 30s进行30个循环，80°C ls、82°C Isl个循环，最后59°C至95°C延伸20s。最后，利用随机软件进行熔解曲线分析和CT值分析，确定质粒拷贝数。(5)利用含精氨酸的ORI培养基培养至少48小时，气单胞菌Aeromonasmolluscorum48小时后质粒完全丢失。本发明第二公开了所述产河豚毒素细菌发酵过程中降解河豚毒素的物质的提取方法，其特征在于，包括如下步骤:(I)发酵培养66小时后，4°C下4000Xg离心30min收集细胞；(2)用0.1%乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞；(3) 100°C煮20_25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)上清用直径0.25 μ m滤纸过滤；(5)过滤液过活性碳柱，用洗脱液洗脱活性碳，洗脱液的配方为:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ；(6)洗脱液45°C减压至0.001-0.003M Pa浓缩，冷冻干燥；
(7)溶于2ml无菌去离子水中；(8)过 I X 80cm 的 Bio-Gel P2 柱子；(9)用0.03M乙酸洗脱，从洗脱液流出开始收集，收集2ml ；(10)洗脱液再用 C18Sep_Pak cartridges 过柱；(11)用IOml0.3%的乙酸洗脱，从第二个柱体积洗脱液流出开始收集，收集两个柱体积的洗脱液；(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在Iml无菌去离子水中。本发明第三公开了所述的提取样本中河豚毒素的检测方法，其特征在于，包括如下步骤:(I)在固定有抗原的酶标板上分别加入TTX标准品，待测样本和添加了 TTX标准品的待测样本；(2)在酶标板上加入TTX的特异性抗体溶液；(3)室温或37°C孵育至反应完全，加入洗涤液洗涤酶标板3次；(4)加入酶标二抗，室温或37°C孵育至反应完全，加入洗涤液洗涤酶标板3次；
·
(5)加入显色液，37°C孵育10_15min后，每孔加入终止液以终止反应；(6)结果检测:将酶标板插入酶标仪中,检测450nm处的吸光值。所述步骤(I)中，添加了 TTX标准品的待测样本，其TTX标准品添加终浓度为25_200ng/mL。所述步骤(2)中的特异性抗体为TTX的特异性单抗。所述步骤(3)中，孵育至反应完全所需时间为1.5h ;所述步骤(4)中孵育至反应完全为lh。本发明所述的“0RI液体培养基”的制备方法(1000ml):在800ml去离子水中加入2g胰蛋白胨(OXOID公司)，2g大豆蛋白胨(英国OXOID公司)，Ig酵母提取物(英国OXOID公司)，30g氯化钠(宜兴市第二化学试剂厂)和0.5g L-精氨酸(国药集团化学试剂有限公司)，搅拌溶解后，再加入0.88g柠檬酸铁(国药集团化学试剂有限公司)，继续搅拌，直到完全溶解后，加入去离子水定容至1000ml，并调节PH至8.0后封口灭菌。本申请采用在已于2011年3月30日公开的中国专利申请号201010179363.8中记载的产河豚毒素的气单胞菌(Aeromonas molluscorum),该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。保藏日期:2010年04月23日，保藏编号:CGMCC N0.3760。造成产河豚毒素细菌的质粒丢失的培养方法是可以重复再现的。将产河豚毒素的细菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基中(0RI液体培养基的组成为:0.05%精氨酸，
0.2%胰蛋白胨，0.2%大豆蛋白胨，0.1%酵母抽提物，0.088%柠檬酸铁，3% NaCl，余量为蒸馏水，pH8.0),在23°C下，225转/分钟，至少培养48小时后，可造成产河豚毒素细菌的质粒丢失。本发明所采用的试剂、样品均为可通过商业途径获得的市售产品，大部分购自英国OXOID公司和国药集团化学试剂有限公司。本发明的有益效果:
I)本发明是通过从细菌发酵液中制备对河豚毒素具有降解效果的提取液，该提取液可作为今后临床治疗河豚毒素中毒的药物。2 )本发明的河豚降解物质的提取方法可用作降解河豚毒素物质的规模化生产，可为科学研究、医药行业等相关领域提供原料。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。
图1为气单胞菌Aeromonas molluscorum细菌质粒丢失时间序列。图2为ELISA检测TTX的标准曲线。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例11、利用改进培养基造成气单胞菌Aeromonas molluscorum质粒丢失的方法,可按照以下步骤操作:(I)将细菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基中，ORI液体培养基制备方法(1000ml)为:在800ml去离子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，Ig酵母提取物(0X0ID公司)，30g氯化钠(宜兴市第二化学试剂厂)和0.5g L-精氨酸(国药集团化学试剂有限公司)，搅拌溶解后，再加入0.88g柠檬酸铁(国药集团化学试剂有限公司)，继续搅拌，直到完全溶解后，加入去离子水定容至1000ml，并调节PH至8.0后封口灭菌。(2) 23°C下，225转/分钟，至少培养48小时。2、利用实时定量PCR检测细菌Aeromonas molluscorum质粒丢失的方法,可按照以下步骤操作:(I)定量PCR标准曲线制作:将提取的标准质粒用无菌水进行10倍系列稀释，分别稀释成6个梯度，作为模板(稀释的时候用移液枪吹打20次，振荡5s后离心，使溶液充分混匀)，进行荧光定量PCR来建立标准曲线。按以下公式计算质粒拷贝数:质粒拷贝数(copies.μ L-1) =6.02 X 1023 (copies.moΓ1) X 质粒浓度(g.μ L-1)/质粒分子量(g * moF1)。(2)将细菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基中，分别培养至18、24、48、72、96小时后，收集细菌，以碱法同时抽提各期细菌的质粒。(3)实时定量PCR体系:将待测质粒样品和标准品分别做3个重复置于同一次实验中进行反应，按下列组分配制PCR反应液:iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad公司)12.5μ 1，PCR 正向引物(2μπιο1/υ μ 1，PCR 反向引物(2μπιο1/υ μ 1，质粒模板 2μ 1，加入 ddH20 补足至 25 μ I。PCR 正向引物序列 5’ -GACAAGGCTCGGAGACACGCA-3’ ；PCR 反向引物序列 5’ -TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC-3’。(4)实时定量PCR反应程序:95°C 5min 预变性，然后以 95°C 30s,59°C 30s,72°C 30s进行30个循环，80°C ls、82°C Isl个循环，最后59°C至95°C延伸20s。最后，利用随机软件进行熔解曲线分析和CT值分析，确定质粒拷贝数。3、降解河豚毒素的物质的提取方法，包括如下步骤:(1)将丢失质粒的气单胞菌发酵培养48小时后，4°C下4000 Xg离心30min收集细胞；(2)用0.1%乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞；(3)100°C煮20_25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)上清用直径0.25 μ m滤纸过滤；(5)过滤液过活性碳柱，用洗脱液洗脱活性碳，洗脱液的配方为:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ；(6)洗脱液45°C减压至0.001-0.003M Pa浓缩，冷冻干燥；(7)溶于2ml无菌去离子水中；(8)过 I X 80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脱，从洗脱液流出开始收集,收集2ml ；(10)洗脱液再用 C18Sep_Pak cartridges 过柱(Waters, Milford, MA)；(11)用IOml0.3%的乙酸洗脱，从第二个柱体积洗脱液流出开始收集，收集两个柱体积的洗脱液；(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在Iml无菌去离子水中。(14)将滤液作为待测样本，调整pH值为6.5-7.4，用ELISA法检测样本中的河豚毒素。4、发酵提取样本中河豚毒素的检测，包括如下步骤:(1)采用市售的河豚毒素ELISA检测试剂盒(北京中卫食品卫生科技公司，产品号:5561)，在固定有抗原的酶标板上分别加入50μ L TTX标准品(Sigma-Aldrich公司，产品号:T8024-lMG)(0、10、20、50、200ng/ml)，待测样本和添加了 TTX标准品(终浓度为50ng/mL, 100ng/mL)的待测样本以及对照样本(培养基)；(2)在酶标板上加入TTX的特异性抗体溶液(50 μ L/孔)；(3) 37°C孵育1.5h，加入洗涤液洗涤酶标板3次；(4)每孔加入100 μ L酶标二抗，37°C孵育lh，加入洗涤液洗涤酶标板3次；(5)每孔加入100 μ L显色液，37°C孵育12min,每孔加入终止液50 μ L ;(6)结果检测:将酶标板插入酶标仪中，检测450nm处的吸光值。(7)以Ai/Ao的比值为纵坐标，TTX标准品浓度的对数值为横坐标建立标准曲线，根据标准曲线求出样本中河豚毒素的浓度。其中Ai为样本的吸光值，Ao为标准品浓度为0ng/mL时的吸光值。结果如图2所示，吸光度比值(Ai/Ao)与河豚毒素标准品浓度的对数值成正比关系，其拟合直线的方程式为y=_0.393X+1.2543，其中“y”为Ai/Ao值，“X”为河豚毒素浓度。根据此公式，可以依据检测样本所得吸光值计算出样本中的河豚毒素浓度。实施例2本实施例的操作方法以及步骤同实施例1，不同之处在于将丢失质粒的气单胞菌发酵培养时间为66小时。实施例3
本实施例的操作方法以及步骤同实施例1，不同之处在于将丢失质粒的气单胞菌发酵培养时间为96小时。实施例4本实施例的操作方法以及步骤如同实施例1，不同之处在于将添加精氨酸的ORI液体培养基改为添加河豚肝脏粗提液。ORI液体培养基制备方法(IOOOml)为:在800ml去离子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，lg酵母提取物(0X0ID公司)，30g氯化钠(宜兴市第二化学试剂厂)，搅拌溶解后，再加入0.88g柠檬酸铁(国药集团化学试剂有限公司)，继续搅拌，直到完全溶解后，加入IOml河豚肝脏粗提液，再加入去离子水定容至1000ml，并调节PH至8.0后封口灭菌。实施例5本实施例的操作方法以及步骤如同实施例4，不同之处在于将丢失质粒的气单胞菌发酵培养时间为66小时。实施例6本实施例的操作方法以及步骤如同实施例4，不同之处在于将丢失质粒的气单胞菌发酵培养时间为96小时。实施例7本实施例的操作方法以及步骤如同实施例1，不同之处在于将添加精氨酸的ORI液体培养基改为添加河豚卵巢粗提液。ORI液体培养基制备方法(IOOOml)为:在800ml去离子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，lg酵母提取物(0X0ID公司)，30g氯化钠(宜兴市第二化学试剂厂)，搅拌溶解后，再加入0.88g柠檬酸铁(国药集团化学试剂有限公司)，继续搅拌，直到`完全溶解后，加入IOml河豚卵巢粗提液，再加入去离子水定容至1000ml，并调节PH至8.0后封口灭菌。实施例8本实施例的操作方法以及步骤如同实施例7，不同之处在于将丢失质粒的气单胞菌发酵培养时间为66小时。实施例9本实施例的操作方法以及步骤如同实施例7，不同之处在于将丢失质粒的气单胞菌发酵培养时间为96小时。通过对比对照和各检测样本中的TTX的量的变化，可以得出提取液对TTX的降解效果。表I为对不同发酵时间提取液的TTX降解效果比较。表I不同发酵时间提取液的TTX降解效果比较
权利要求
1.一种提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将质粒丢失的产河豚毒素的细菌发酵培养至少48小时，离心收集细胞； (2)用0.1%-1%乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞； (3)95-105°C煮20-25min，冷却后离心去除细胞碎片； (4)过滤上清； (5)对过滤液过活性碳柱，洗脱液的配方为:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ； (6)洗脱液在40-50°C减压浓缩，冷冻干燥； (7)溶于无菌去离子水中； (8)过Bio-Gel P2 柱子； (9)用0.02-0.05M乙酸洗脱，收集洗脱液； (10)洗脱液再用C18Sep-Pak cartridges 过柱； (11)用5-20ml0.3%的乙酸洗脱，收集洗脱液； (12)将洗脱液过滤； (13)过滤液冷冻干燥后，溶解在无菌去离子水中，得到降解河豚毒素的物质的提取液。
2.如权利要求1所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，所述的质粒丢失的产河豚毒素细菌是软体动物气单胞菌，或是其它产河豚毒素的细菌。
3.如权利要求1或2所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下检测步骤: 将滤液作为待测样本，调整PH值为6.5-7.4，用ELISA法检测样本中的河豚毒素。
4.如权利要求1或2所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，造成所述的产河豚毒素细菌丢失质粒的人工发酵培养方法，包括如下步骤: (1)将所述的产河豚毒素细菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基中； (2)20-28°C下，200-450转/分钟，至少培养48小时。
5.如权利要求4所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，所述ORI液体培养基的组成为:0.05%精氨酸，0.2 %胰蛋白胨，0.2 %大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088%柠檬酸铁，3% NaCl，余量为蒸馏水，pH7-8.5。
6.如权利要4所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，所述ORI液体培养基制备方法:在800ml去离子水中加入2g胰蛋白胨,2g大豆蛋白胨,Ig酵母抽提物，30g氯化钠和0.5g L-精氨酸，搅拌溶解后，再加入0.88g柠檬酸铁，继续搅拌，直到完全溶解后，加入去离子水定容至1000ml，并调节PH至7-8.5后封口灭菌。
7.如权利要求3所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，所述的检测步骤中的ELISA法检测包括如下步骤: (1)在固定有抗原的酶标板上分别加入河豚毒素标准品，待测样本和添加了河豚毒素标准品的待测样本； (2)在酶标板上加入河豚毒素的特异性抗体溶液； (3)20-40°C孵育至反应完全，加入洗涤液洗涤酶标板3次； (4)加入酶标二抗，20-40°C孵育至反应完全，加入洗涤液洗涤酶标板3次； (5)加入显色液，37°C孵育10-15min后，每孔加入终止液以终止反应； (6)结果检测:将酶标板插入酶标仪中,检测450nm处的吸光值。
8.如权利要求7所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，所述ELISA法的步骤(I)中，添加了河豚毒素标准品的待测样本，其河豚毒素标准品添加终浓度为25_200ng/mL。
9.如权利要求7所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，所述ELISA法的步骤(2)中的特异性抗体为河豚毒素的特异性单抗。
10.如权利要求7所述的提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，所述ELISA法的步骤(3)中，孵育至反应完全所需时间为1.5h ;所述ELISA法的步骤(4)中孵育至反应完全为lh。
11.一种使产河豚毒素的细菌丢失质粒的人工发酵培养方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将所述产河豚毒素的细菌接种在 添加精氨酸的ORI液体培养基中； (2)23°C下，225转/分钟，至少培养48小时。
12.如权利要求11所述造成产河豚毒素的细菌丢失质粒的人工发酵培养方法，其特征在于，所述产河豚毒素的细菌为产河豚毒素的气单胞菌。
13.如权利要求11或12所述造成产河豚毒素的细菌丢失质粒的人工发酵培养方法，其特征在于，所述ORI液体培养基的组成为:0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，0.2%大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088%柠檬酸铁，3% NaCl，余量为蒸馏水，pH7-8.5。
14.一种实时定量PCR检测方法，其用于检测如权利要求1-13任一项所述方法采用的细菌的质粒丢失，其特征在于，包括如下步骤: (1)定量PCR标准曲线制作:将提取的Ne-1质粒用无菌水进行10倍系列稀释，分别稀释成6个梯度，作为模板，进行荧光定量PCR来建立标准曲线，按以下公式计算质粒拷贝数:质粒拷贝数(copies.μ 厂1) =6.02 X IO23 (copies.moΓ1) X 质粒浓度(g.μ L-1)/质粒分子量(g.moF1)； (2)实时定量PCR体系:将待测样品和标准品分别做3个重复置于同一次实验中进行反应，按下列组分配制PCR反应液:iQ SYBR Green Supermixl2.5 μ 1，PCR正向引物1μ I, PCR反向引物I μ 1，质粒模板2 μ 1，加入ddH20补足至25 μ 1，PCR正向引物序列5’ -GACAAGGCTCGGAGACACGCA-3’，PCR 反向引物序列 5’ -TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC-3 ’，所述待测样品为所述丢失质粒的细菌； (3)实时定量PCR反应程序:95°C5min预变性质粒DNA模板，然后以95°C 30s、59°C 30s,72°C 30s进行30个温度变化循环，80°C ls、82°C Is进行I个循环，最后59°C至95°C延伸20s，最后，利用随机软件进行熔解曲线分析和CT值分析，确定质粒拷贝数； (4)利用含精氨酸的ORI培养基培养至少48小时，质粒完全丢失。
15.一种根据权利要求1-10中任一项所述的方法所提取制备得到的河豚毒素降解物质的提取液。
16.如权利要求15所述的河豚毒素降解物质的提取液在制备用于治疗河豚毒素中毒的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从产河豚毒素的细菌发酵液中制备降解河豚毒素的物质的方法和提取液的制备检测方法，包括人工造成质粒丢失的方法、河豚毒素降解物质的提取方法、降解河豚毒素的检验方法。在本发明中，首次发现气单胞菌Aeromonas molluscorum中存在降解河豚毒素的物质，并建立了提取该物质的抽提方法，该方法有望用于降解河豚毒素物质的规模化生产。本发明涉及的细菌发酵液的抽提物具有降解河豚毒素的作用，可应用于制备用于治疗河豚毒素中毒的药物，可为科学研究、医药行业等相关领域提供原料。
文档编号A61K35/74GK103233043SQ201310135898
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者鲍宝龙, 卢瑛, 马廷龙, 赵静, 刘静, 张莉君 申请人:上海海洋大学