一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用

一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用。所述嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其靶向作用于CXCR4+肿瘤细胞，协同抑制肿瘤细胞内CXCR4/SDF?1a功能轴和NF?kB信号通路，降低CXCR4+肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。具体地，该嵌合肽由SDF?1a的氮端序列和NF?kB P50亚基的核定位序列（NLS）嵌合而成，通过氮端序列靶向识别肿瘤细胞表面受体CXCR4，抑制细胞内SDF?1a/CXCR4功能轴作用；又作为穿膜肽促使NF?kB p50亚基 NLS序列有效进入肿瘤细胞，靶向抑制NF?kB的入核转录过程，在研究多靶点抗肿瘤转移药物方面具有重要价值。
【专利说明】
一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种双靶向嵌合肽及其在制备抗 肿瘤转移药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是当前危害人类健康的一类重大疾病，其典型特点是不受控制的增殖及转 移。虽然在过去的几十年中，因手术、放化疗等方法的进步肿瘤治疗取得了长足的进展，但 肿瘤转移导致的多器官性衰竭依然是肿瘤致死的主要原因，所以高转移性的肿瘤被称为恶 性肿瘤。因此，针对新的作用靶点和作用机制，研发有效抑制肿瘤转移的药物是今后改善恶 性肿瘤多器官转移的重要方向，也是整体改变肿瘤治疗现状的重要途径。
[0003] 大量研究表明，乳腺癌，胃癌，前列腺癌，肝癌，宫颈癌等约23种具有高转移活性的 癌细胞表面高表达趋化因子受体CXCR4,其特异性配体-趋化因子SDF-I (CXCL12)在人体肝 脏，骨髓、肺等器官高表达。肿瘤细胞离开原发病灶后，通过血液/体液/淋巴系统到达高表 达SDF-Ia的器官组织，其表面受体CXCR4与SDF-Ia发生特异性识别，激活下游信号通路，包 括NF-kB信号通路的持续激活，促使肿瘤细胞产生伪足而具有迀移能力，并分泌细胞外基质 金属蛋白酶MMP9,血管内皮生长因子(VEGF)等一系列分子帮助肿瘤细胞侵袭细胞外基质， 从而促使肿瘤细胞在这些特异器官落巢，该过程与SDF-Ia呈浓度依赖性，因此CXCR4+肿瘤 通常会出现肝，骨髓和肺部的特异性转移(机制如图1所示）。实验证明CXCR4的抗体或拮抗 剂（如AMD3100)或重组SDF-Ia可有效抑制CXCR4+肿瘤细胞的特异性器官转移。由此说明， CXCR4/SDF-1的相互作用直接介导了肿瘤的特异性器官转移，是研究肿瘤转移抑制剂的重 要靶点。
[0004] 另外，核转录因子KB(NF-kB)是由NF-KBl(p50/pl05)，RELA(p65)和RELB等网状内 皮组织增殖(Reticuloendothel iosis，REL)蛋白形成的一系列二聚体家族的总称，近年发 现其在肿瘤发展过程中扮演关键角色。在多种血液和实体瘤中，NF-kB过度表达并通过多种 途径被持续激活。活化后的NF-kB(主要以p65/p50亚基构成的二聚体形式存在)通过p50亚 基的核定位序列（nuclear localization sequrence，NLS)与核质转运受体复合物 (import in-a)结合，转运入细胞核，从而启动多种癌基因的转录，促进肿瘤细胞的恶性增 殖、侵袭转移和凋亡逃逸等。在卵巢癌、结肠癌及胰腺癌等多种体内模型研究中，阻断NF-kB 信号通路的不同环节均可有效发挥抗肿瘤作用。因此NF-kB信号通路已成为抗肿瘤药物作 用的重要靶标。其中阻断NF-kB的入核转运过程即是有效抑制NF-kB信号通路活性的重要手 段。
[0005] 目前有大量研究作用于CXCR4/SDF-1功能轴和NF-kB信号通路的抑制剂用于抗肿 瘤药物发现。例如CXCR4的内源性配体SDF-Ia的衍生肽被用于研究抑制CXCR/SDF-la相互作 用或作为其他药物的引导肽靶向识别CXCR4+肿瘤细胞，但由于肿瘤细胞内的NF-kB信号通 路的持续激活，CXCR4处于持续表达状态，因此单纯抑制CXCR4/SDF-1的相互作用较难发挥 持续的作用。NF-kB P50亚基的碳端含有一段由5个碱性氨基酸构成的典型NLS (VQRKRQKLMP)，能够特异性识别核转运受体（importin-a)，引导NF-kB的入核转运。研究证 明，合成P50的NLS作为多肽探针分子，能够特异性抑制内源性NF-kB的P50亚基与核转运受 体复合物的键合，阻断NF-kB的核转运，抑制相关基因转录。但P50 NLS主要由碱性氨基酸构 成，难以穿过脂质细胞膜进入胞内，因此生物利用度很低，难以直接作为药物使用。Hawiger 等报道，由脂溶性穿膜肽序（the hydrophobic region/h_region，AAVALLPAVLLALLAP)与 P50 NLS肽序构成的嵌合肽-SN50及其环肽分子，通过h-region的穿膜作用有效引导P50-NLS进入细胞，抑制NF-kB与核转运受体复合物的亲和作用，阻断NF-kB的核转运。但因为脂 溶性穿膜肽能够穿透所有细胞膜，缺乏肿瘤靶向性，存在较大的毒副作用。因此，寻找对癌 细胞具有特异性识别、并能有效携带P50 NLS进入细胞内的定向穿膜引导分子具有重要意 义。
[0006] 已有的报道中，针对CXCR4的抑制剂可实现对肿瘤细胞的靶向性，但对肿瘤细胞内 其他靶点包括NF-kB信号通路没有抑制作用，抗肿瘤转移及增值的效果较低；而针对BF-kB 信号通路的多肽药物研究，普遍存在生物利用度低的问题，需要加入一段穿膜肽，目前主要 使用脂溶性穿膜肽作为进入细胞的引导肽，但这类分子没有肿瘤靶向性，相应的毒副作用 显著。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是克服现有技术中关于抑制肿瘤转移药物研究的缺陷和不足，提供 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用。该双靶向嵌合肽具有显著的双靶 向协同作用，可有效靶向CXCR4+肿瘤细胞，并携带NF-kB信号通路的靶向抑制剂进入细胞， 从而实现对SDF-1/CXCR4功能轴和NF-kB信号通路的双靶向协同抑制作用，在用于抗肿瘤转 移药物的应用方面具有重要作用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 一种双靶向嵌合肽，所述双靶向嵌合肽的氨基酸序列由氮端序列和碳端序列两部分序 列构成，所述氮端序列如SEQ ID NO. 2所示，具体为KPVSLSYRSPSRFFESH，其特征为有效识别 肿瘤细胞表面受体;所述碳端序列为能够有效识别NF-kB核质转运受体的多肽分子。
[0009] 优选地，所述碳端序列为NF-kB p50亚基的入核转运序列（nuclear localization sequence，NLS)，或其他能够有效识别NF-kB核质转运受体的多肽分子，如从 噬菌体多肽库中筛选得到的可有效识别核质转运受体，且抑制NF-kB入核转运的多肽分子。 [0010] 更优选地，所述为NF-kB p50亚基的入核转运序列（nuclear localization sequence，NLS)，即所述碳端序列如SEQ ID从).3所示，具体为￥〇服1^!101^1(。
[0011]即优选地，所述双靶向嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为： KPVSLSYRSPSRFFESHVQRKRQKLMPK。
[0012]上述双靶向嵌合肽为28个氨基酸残基的多肽，其氮端序列即SEQID NO. 2所示序列 (KPVSLSYRSPSRFFESH)是取自SDF-Ia序列的1位到17位氨基酸残基，其碳端序列即SEQID NO.3所不序列（VQRKRQKLMPK)为NF-kB p50 亚基的入核转运序列（nuclear localization sequence，NLS)〇
[0013]上述双靶向嵌合肽的氮端序列具有靶向CXCR4并引起受体复合物内化的作用，实 现整个分子对CXCR4+肿瘤细胞的靶向选择性，并引导碳端序列（来源NF-kB p50亚基的 NLS)进入肿瘤细胞;碳端序列则与细胞内的入核转运受体蛋白importin-a结合，从而有效 抑制细胞内处于激活状态的NF-kB移位入核，进而抑制下游靶基因的表达，包括CXCR4，实现 双靶向协同抑制作用。
[0014] 另外，上述双靶向嵌合肽在制备靶向抗肿瘤药物中的应用，也在本发明的保护范 围之内。
[0015] 优选地，所述抗肿瘤药物是指抗肿瘤转移药物。
[0016] 更优选地，所述肿瘤为表达CXCR4受体的恶性肿瘤。进一步地，所述肿瘤为高表达 CXCR4受体的恶性肿瘤。更进一步地，所述肿瘤细胞存在CXCR4高表达和NF-kB信号通路的持 续激活。
[0017] 更优选地，所述肿瘤为肺癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌或膀胱癌等 表达CXCR4受体的恶性肿瘤。
[0018] 上述双靶向嵌合肽对肿瘤转移的抑制作用是通过对CXCR4+肿瘤细胞中CXCR4+/ SDF-1 a功能轴和NF-kB信号通路的协同抑制作用来实现的。
[0019] 另外，上述双靶向嵌合肽在制备协同抑制CXCR4+肿瘤细胞中CXCR4+/SDF_la功能 轴和NF-kB信号通路的药物中的应用，也在本发明的保护范围之内。
[0020] 进一步地，上述对CXCR4+/SDF-la功能轴的抑制包括细胞表面受体的内化和蛋白 表达的降低;对NF-kB信号通路的抑制包括对NF-kB入核的抑制及下游基因的表达。
[0021] 本发明实际上是在上述基础上提供了一种可用于治疗高表达CXCR4受体的肿瘤的 转移的方法。具体地说是通过肿瘤细胞表面的趋化因子受体CXCR4实现对肿瘤靶向性，并通 过协同抑制CXCR4/SDF-la功能轴和NF-kB信号通路的活性，发挥双靶点抑制CXCR4+肿瘤细 胞的转移，用于肿瘤的治疗。这一发明基于以下研究发现：（1)具有高转移活性的恶性肿瘤 细胞(如乳腺癌，肺癌，胰腺癌，肝癌等)普遍高表达趋化因子受体CXCR4,其特异性配体SDF-Ia在肝脏，肺，骨髓中高表达;研究表明CXCR4与SDF-Ia的相互作用直接介导了肿瘤细胞特 异性地向肝，肺及骨髓转移;CXCR4基因沉默或阻断CXCR4/SDF-la的相互作用可有效抑制地 肿瘤细胞的迀移活性；因此CXCR4成为高转移活性肿瘤细胞的有效靶点和标志分子；（2) SDF-Ia与CXCR4受体相互作用分析显示其氮端序列是受体识别和引起受体内化的重要结 构区域;SDF-Ia的1位到17位氨基酸序列组成的多肽分子，可有效识别CXCR4并引起受体内 化，具有CXCR4受体部分激动剂的效果；（3)NF-kB信号通路在肿瘤细胞中处于持续激活状 态，而CXCR4/SDF-1 a的相互作用也与NF-kB的持续激活呈正相关;激活后的NF-kB (主要以 p50/p65亚基组成的二聚体)进入细胞核并转录表达多种癌基因，也包括MMP9和CXCR4,促进 肿瘤的生长和迀移；因此NF-kB信号通路和CXCR4/SDF-la功能轴在肿瘤的转移过程中发挥 协同作用。
[0022] 研究证明，乳腺癌等细胞中持续活化的NF-kB通过特异性识别CXCR4启动子-66~+1 的DNA序列，上调表达CXCR4，是肿瘤细胞高表达CXCR4的重要途径，直接参与了CXCR4/SDF-Ia介导的癌细胞转移过程。因此我们发现，CXCR4/SDF-la和NF-kB信号通路在肿瘤的增殖 与转移过程中相互关联，具有协同作用，研究同时针对二者的双靶向分子将显示更强的抗 肿瘤活性，设计多靶向的药物分子协同作用于上述两种信号通路将发挥更好地抗肿瘤转移 作用。本发明克服了现有技术中缺陷:关于CXCR4/SDF-la功能轴和NF-kB信号通路的抗肿瘤 药物研究都为单一靶向的，没有考虑到二者在肿瘤细胞生长及转移过程中发挥的协同作 用，无基于上述两种靶点的成功药物。本发明基于CXCR4/SDF-1功能轴和NF-kB信号通路在 肿瘤生长和转移过程中的协同作用，开发了靶向作用于二者的多功能药物，即上述的双靶 向嵌合肽，具有重要的意义。
[0023]发明人在设计了双靶向嵌合肽（SEQ ID NO.1)的同时，还合成了其他两个多肽分 子，单独的VQRKRQKLMPk(SEQ ID N0.3)(NF-kB p50亚基入核转运序列）和 AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMPK(SEQIDN0.4，g卩在SEQIDN0.3序列的前面加了一段脂溶 性穿膜肽）。设计这两个多肽的目的是为了确证(SEQ ID NO.3)是否能够进入细胞以及其对 肿瘤细胞是否具有选择性。细胞实验结果显示SEQ ID NO.3不能独立进去任何细胞，而添加 了脂溶性穿膜肽段的SEQ ID NO.4无选择性进入CXCR4+肿瘤细胞和非肿瘤CHO细胞。该结果 进一步说明SEQ ID NO. 1不仅保留了SDF-Ia序列对CXCR4受体的选择性识别，而且也是有效 地保障NF-kB信号通路抑制剂选择性进入肿瘤细胞发挥靶向抑制作用的有效手段。
[0024] 该嵌合肽靶向作用于CXCR4+肿瘤细胞，协同抑制肿瘤细胞内CXCR4/SDF-la功能轴 和NF-kB信号通路，降低CXCR4+肿瘤细胞的迀移和侵袭能力，具有抑制肿瘤转移过程的作 用。CXCR4/SDF-1功能轴和NF-kB信号通路在肿瘤生长和转移过程中发挥协同作用，该嵌合 肽由SDF-Ia的氮端序列和NF-kB P50亚基的核定位序列(NLS)嵌合而成，通过SDF-I的氮端 序列靶向识别肿瘤细胞表面受体CXCR4,抑制细胞内SDF-la/CXCR4功能轴作用;又作为穿膜 肽促使NF-kB p50亚基NLS序列有效进入肿瘤细胞，靶向抑制NF-kB的入核转录过程，在制 备双靶向抗肿瘤转移药物方面具有重要价值。
[0025]本发明具有以下有益效果： 本发明首次提出利用双靶向嵌合肽实现对CXCR4+肿瘤细胞的靶向选择性并抑制肿瘤 细胞转移活性的应用，首次提出利用双靶向抑制剂选择性识别具有高转移活性的CXCR4+肿 瘤细胞，并通过协同抑制CXCR4/SDF-1功能轴和NF-kB信号通路活性，从而抑制肿瘤细胞向 特异性器官(肝，肺和骨髓等)转移的抗肿瘤治疗方法。该方法具有作用靶点明确，且多靶点 具有协同作用的特点，具有独特的抗肿瘤作用机制。
[0026]肿瘤转移目前是危害肿瘤患者生命健康的重要原因，目前原发肿瘤的放化疗技术 已取得了较大进步，但肿瘤转移治疗目前尚无有效手段和方法。因此本发明提出的一种多 靶向治疗CXCR4+肿瘤细胞转移的方法和手段，对恶性肿瘤的转移治疗提供了一种策略。
【附图说明】
[0027]图1为CXCR4/SDF-1介导的肿瘤特异性器官转移机制。
[0028]图2为不同细胞表面受体CXCR4的流式细胞分析图；图D和A为Hela细胞加 PE标记的 CXCR4单抗12G5和空白对照图；图E和B为A549细胞加 PE标记的CXCR4单抗12G5和空白对照 图；图F和C为CHO细胞加 PE标记的CXCR4单抗12G5和空白对照图。
[0029]图3为双靶向嵌合肽（SEQ ID NO. 1)进入不同细胞的荧光标记图；图A:肿瘤细胞 A549,图B:中华仓鼠卵巢细胞CH0,图C和D分别为A549细胞和CHO细胞对多肽（SEQ ID N0.1) 的FITC标记复合物的摄取情况。 图4为双靶向嵌合肽（SEQ ID NO. 1)进入不同细胞的荧光标记图；图中，E和F分别为 A549细胞和CHO细胞对多肽（SEQ ID NO.3)的FITC标记复合物的摄取情况，G和H分别为A459 细胞和CHO细胞对多肽(SEQ ID NO.4)的FITC标记复合物的摄取情况。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0031] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0032] 以下示例性实施例中未注明条件的实验方法可以按本领域内的常规实验方法进 行，例如可以参考Sambrook等人的《Molecular Cloning: A Laboratory ManualKCold Spring Harbor Laboratory Press,2000)。在以下实施例中，RPMI1640培养基和DMEM培养 基如无特殊说明指在灭菌后加入10%灭活小牛血清，青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL。
[0033] 术语解释：SDF-la(CXC12):趋化因子，又称基质细胞衍生因子，是CXCR4的特异性 配体。CXCR4: -种七次跨膜G-蛋白偶联受体。NF-kB:转录因子蛋白家族;P50 NLS:NF-kBP50 亚基的核定位序列（nuclear localization sequence)。
[0034] 实施例1双靶向嵌合肽的合成及鉴定 1、本发明的具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的双靶向嵌合肽是通过Fmoc/tBu固相 有机合成方法得到。得到的多肽可以通过与趋化因子受体CXCR4的靶向识别选择性进入 CXCR4+肿瘤细胞，并有效抑制CXCR4+/SDF-la功能轴和NF-kB信号通路。因此，根据本发明的 多肽具有肿瘤细胞靶向及抑制肿瘤迀移作用，可以应用于肿瘤靶向治疗的药物中，如应用 在靶向抗肿瘤转移药物体系中。
[0035]另外，发明人同时合成了其他两个多肽分子，单独的VQRKRQKLMP(SEQ ID N0.3) (NF-kB p50 亚基入核转运序列）和AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMPK(SEQ ID N0.4，即在SEQ ID NO. 3序列的前面加了一段脂溶性穿膜肽）。设计这两个多肽的目的是为了确证(SEQ ID NO. 3)是否能够进入细胞以及其对肿瘤细胞是否具有选择性。
[0036] 2、具体地，本发明双靶向嵌合肽（以下也简称多肽)的合成及鉴定方法如下： 以CLTR树脂（2-氯-三苯甲基氯树脂)为载体，Fmoc/tBu为氨基酸保护策略，20%哌啶/ DMF为脱保护试剂，根据氨基酸序列进行耦合及脱保护反应，最后以95%的TFA/U0把多肽分 子从树脂上切除，通过高效液相分离纯化得到。详细实验步骤可以参照Chan W.C.《Fmoc solid phase peptide synthesisKOxford University press,2000)。
[0037] 为便于利用荧光标记的方法检测多肽进入细胞的情况，在多肽序列的碳段耦合 biot in分子，获得每个多肽分子的biotin标记多肽分子，经高效液相色谱和质谱鉴定为设 计目的肽序，纯度均超过95%。具体合成工作由上海强耀生物有限公司合成完成。合成的肽 序如下表1所示。
[0038] 表1
实施例2双靶向嵌合肽靶向进入CXCR4+肿瘤细胞 1、多肽靶向进入CXCR4+肿瘤细胞 (1)流式细胞分析法鉴定CXCR4+A表达细胞株 两种肿瘤细胞A549和Hela采用DMEM培养基，非肿瘤细胞CHO(中华仓鼠卵巢细胞CHO)采 用RPMI1640培养基，于37°C 5% CO2培养箱中培养。在细胞状态良好时，加入胰酶消化，PBS 清洗并进行细胞计数。每种细胞分别取2 X 100μΙ(含IO6个细胞），其中一份加入5μ1含有 PE标记的CXCR4单抗(PE-12G5 )，另一份为阴性对照。4 °C避光孵育30miη，流式细胞分析细胞 表面受体数量。
[0039] 图2中图D和E相比阴性对照显示，肿瘤细胞Α549和Hela细胞高表达CXCR4受体，而 非肿瘤细胞CHO CXCR4表达量较少。该实验结果与大量文献报道结果相近，所以，此三种细 胞可以作为CXCR4+A表达的典型细胞。
[0040] (2)高内涵筛选系统分析多肽选择性进入CXCR4+肿瘤细胞 为了表征多肽进入细胞的情况，在多肽碳端标记biotin，取biotin标记的三种多肽分 子溶于DMS0,分别与avidin-FITC以摩尔比1:1在40°C水浴中反应lh，利用biotion/avidin 的强相互作用形成FITC标记的多肽复合物(荧光复合物）。用2μΜ FITC标记的多肽复合物加 入96孔板中，于37°C分别孵育Α549和CHO细胞2h。同时用2μΜ avidin-FITC孵育两种细胞作 为空白对照。用I X PBS溶液清洗细胞2次，细胞洗后Hoechst染核，5mM的NaCl溶液洗掉非特 异性结合于细胞表面的多肽复合物。采用Thermo的高内涵筛选系统（型号:ArrayScanVTI) 分别拍摄10个视野内的细胞，并进行数据统计分析。
[0041 ] (3)双靶向嵌合肽（SEQ ID NO. 1)以及其他两种合成的多肽进入不同细胞的荧光 标记图如附图3和图4。
[0042] 图3中A和B显示，在空白对照实验中，纯的avidin-FITC分子不会进入A549和CHO 细胞。
[0043] 图3中C和D分别为A549细胞和CHO细胞对多肽（SEQ ID NO. 1)的FITC标记复合物的 摄取情况。图C中的荧光明确表明，肿瘤细胞A549明显有效摄取多肽复合物，而非肿瘤细胞 CHO几乎没有摄取多肽复合物。表明该双靶向嵌合肽(SEQ ID NO. 1)分子对肿瘤细胞具有明 显的靶向选择性。
[0044] 图4中E和F分别为A549细胞和CHO细胞对多肽(SEQ ID NO.3)的FITC标记复合物的 摄取情况。显示多肽分子即没有进入肿瘤细胞A549,也没有进入非肿瘤细胞CH0。
[0045] 图4中G和H分别为A459细胞和CHO细胞对多肽(SEQ ID NO.4)的FITC标记复合物的 摄取情况。显示该多肽分子无选择性地进入任何细胞。
[0046]以上结果明确显示，双靶向嵌合肽(SEQ ID NO. 1)利用氮端肽序对CXCR4的特异性 识别作用可选择性进入CXCR4+肿瘤细胞(肺腺癌细胞A549)，而不进入CXCR4-细胞（中华仓 鼠卵巢细胞CH0)，且氮端肽序可作为靶向穿膜肽引导NF-kB信号通路的抑制剂进入肿瘤细 胞，发挥对肿瘤细胞的特异性作用。
[0047] 实施例3肺腺癌细胞A549和宫颈癌Hela细胞的Transwell细胞迀移抑制试验 1、双靶向嵌合肽对肿瘤细胞的迀移抑制实验 (1)材料 迀移抑制实验采用12孔聚苯乙稀培养板和transwell小室(Costor 3421型）组成的 迀移装置。上室底部覆盖聚碳酸酯膜，直径6.5mm，膜孔径5μηι。
[0048] SDF-la(l〇〇yg/ml，中山大学药学院分子生物学实验室马伟峰博士赠)溶于无菌去 离子水中，-20 °C保存。
[0049] 肺腺癌细胞A549和宫颈癌Hela细胞。
[0050] (2)迀移抑制实验 在12孔细胞培养板和transwell小室中分别加入600μ1和100μΙ DMEM培养液于37°C、5% CO2条件下平衡。30min后，吸掉培养液，在下室中分别加入混有SDF-la(100ng/ml)和嵌合肽 (SEQ ID N0.1)不同浓度（10μΜ、3μΜ、0·3μΜ)的600μ1 DMEM培养液。同时设阳性对照，即在下 室中加入仅含SDF-la(l〇〇ng/ml)的600μ1 DMEM培养液；阴性对照，即在下室中只加600μ1 DMHM培养液。
[0051 ] 取生长状态良好的Α549细胞和Hela细胞，调整细胞密度至IO6个/ml，分别取100μΙ 加入8个transwell小室中，再把小室放入下室培养液中，整个培养板置于37°C、5% CO2条件 下4h。
[0052] 之后轻轻移走transwell小室，用倒置显微镜观察迀移至下室的细胞数，记录下室 5个视野中的细胞数，取平均值。
[0053] 2、多肽(SEQ ID NO. 1)对两种肿瘤细胞的迀移抑制效率如表2所示。
[0054] 表2多肽(SEQ ID NO. 1)对两种肿瘤细胞的迀移抑制效率
实验结果表明，在肺腺癌细胞A549和宫颈癌Hela细胞的Transwell细胞迀移抑制试验 中，嵌合肽(SEQ ID N0.1)可有效抑制SDF-la(100ng/ml)可有效引起肿瘤细胞从上室迀移 至下室，在3μΜ浓度下即可抑制50%以上的肿瘤细胞迀移，表明本发明的双靶向嵌合肽分子 具有抑制肿瘤细胞迀移的能力。
[0055] 实施例4双靶向嵌合肽转运入核实验 1、嵌合肽进入细胞后的入核转移效率 同样利用FITC标记的多肽复合物孵育不同细胞，并对细胞核进行染色，然后采用高内 涵系统分析细胞核内荧光强度与细胞质中的荧光强度，计算二者差值，以分析分子入核的 效率。
[0056] 2、实验结果 如表3所示，高内涵荧光数据分析得到的核内平均荧光数-胞浆平均荧光数值，用于反 映分子的入核转移情况。
[0057]表3多肽进入不同细胞后的入核转移效率
表中数据显示嵌合肽(SEQ ID NO. 1)在肿瘤细胞内的入核效率显著高于CHO细胞，而多 肽(SEQ ID NO.4)无选择性进入A549和CHO细胞后，二者的入核效率存在明显差异。
[0058] 综上所述，以上结果表明，本发明的多肽分子(SEQ ID NO. 1)进入肿瘤细胞后，高 效率地转运入核，其在核内分布量高于胞浆分布量，说明其高效识别核质转运受体蛋白 import in-a，转运入核，可有效抑制NF-kB的入核转运，从而抑制下游祀基因的转录表达。
【主权项】
1. 一种双靶向嵌合肽，其特征在于，所述双靶向嵌合肽的氨基酸序列由氮端序列和碳 端序列两部分序列构成，其氮端序列如SEQ ID N0.2所示，具体为KPVSLSYRSPSRFFESH;所述 碳端序列为能够有效识别NF-kB核质转运受体的多肽分子。2. 根据权利要求1所述双靶向嵌合肽，其特征在于，所述碳端序列为NF-kB p50亚基的 入核转运序列，或其他能够有效识别NF-kB核质转运受体的多肽分子。3. 根据权利要求2所述双靶向嵌合肽，其特征在于，所述碳端序列如SEQ ID NO.3所示， 具体为 VQRKRQKLMPK。4. 根据权利要求1所述双靶向嵌合肽，其特征在于，所述双靶向嵌合肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO · 1 所示，具体为:KPVSLSYRSPSRFFESHVQRKRQKLMPK。5. 权利要求1所述双靶向嵌合肽在制备多靶向抗肿瘤药物中的应用。6. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物是指抗肿瘤转移药物。7. 根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述肿瘤为表达CXCR4受体的恶性肿瘤。8. 根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、胃癌、胰腺癌、结直肠 癌、乳腺癌、卵巢癌或膀胱癌。9. 权利要求1所述双靶向嵌合肽在制备协同抑制CXCR4+肿瘤细胞中CXCR4+/SDF-la功 能轴和NF-kB信号通路的药物中的应用。10. 根据权利要求9所述应用，其特征在于，对CXCR4+/SDF-la功能轴的抑制包括细胞表 面受体的内化和蛋白表达的降低;对NF-kB信号通路的抑制包括对NF-kB入核的抑制及下游 基因的表达。
【文档编号】A61K38/16GK105859841SQ201610122787
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月4日
【发明人】邵伟艳, 卜宪章, 孙海霞, 刘翠, 区敬华
【申请人】中山大学