一种ERK信号通路抑制剂NdpA的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种ERK信号通路抑制剂NdpA，属于细胞生物学领域。本发明确定了可以抑制ERK信号通路的肺炎克雷伯杆菌分泌蛋白NdpA，并且发现NdpA通过直接结合ERK并抑制其磷酸化而实现对ERK信号通路的抑制。本发明成果可为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，尤其在抗肿瘤、缓解动脉粥样硬化和痛风等多种药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开发ERK的抑制剂。此外，该成果还对寻找新的抗感染药物靶点和筛选新药具有重要的理论意义。
【专利说明】
一种ERK信号通路抑制剂NdpA
技术领域
[00011本发明涉及一种ERK信号通路抑制剂NdpA，尤其是一种能抑制ERK信号通路的肺炎 克雷伯杆菌分泌蛋白，属于细胞生物学领域。
【背景技术】
[0002]炎症，也就是人们常说的"发炎"，本是机体对外界刺激产生的一种保护性反应，其 临床表现为：红、肿、热、痛和功能性障碍。通常情况下，炎症对机体是有益的，但是有些时 候，炎症也是某些疾病的罪魁祸首。
[0003] 丝裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应通 路是真核细胞信号传递的重要途径之一。在哺乳动物细胞中，几乎所有的生长因子和细胞 因子都可以激活该途径，并启动早期应答基因的表达。MAPK信号通路可以被多种应激原(如 病原产物、促炎因子、渗透压、机械刺激等)激活，最终磷酸化大量蛋白质，包括转录因子、细 胞骨架蛋白、激酶和其他酶类，因而极大地影响了细胞的代谢、形态、生长、生存和分裂等功 能。
[0004] 细胞外信号调节激酶（The extracellular signal-regulated kinase，ERK)是 MAPK家族中首先被鉴定出来的成员，包括分子量为44kDa的ERK1、分子量为42kDa的ERK2等 多种亚型，它们有90%的同源性，其保守的磷酸化位点为11^185-611117^87^狀2)或 Thrfos-Glu-TyrfOS(ERKl)t3ERK信号通路可被胰岛素和各种生长因子通过受体酪氨酸激酶 (Receptor tyrosine kinase，RTK)激活。当受体结合配基被活化后，小G蛋白Ras便会释放 GDP并结合GTP而被活化，活化的Ras随即招募MAP3K家族成员Raf到质膜，并激活两个ERK特 异性激活剂MEKl和MEK2。除了沿着Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2途径激活外，ERK信号通路还 可以被促炎因子和病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMMs)激活，如TNFa和LPS。此外，ERK信号通路还可以被身体内的"危险信号"激活，如动脉 粥样硬化患者的氧化型低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein，LDL)和痛风患者的尿酸 结晶。已有大量实验证实ERK信号通路的活性与多种病理过程及重要疾病密切相关，包括： 炎症反应、肝脏疾病、风湿性关节炎、肥胖症和糖尿病等代谢性疾病以及肿瘤等。因此， ERK1/2可作为潜在的药物靶点，ERK1/2的抑制剂对多种疾病的治疗也将取得很好的临床效 果。
[0005] 肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)属于肠杆菌科(Enterrobacteriace) 克雷伯菌属(KlebsielIae)，在自然界分布很广泛。近几年，肺炎克雷伯杆菌成为了仅次于 大肠杆菌的最重要的条件致病菌，严重威胁着人类的健康，常引起医院和社区获得性感染。 肺炎克雷伯杆菌通常聚集在人类的皮肤、咽、胃肠道、伤口、尿道和呼吸道，其中在医院内感 染中，该菌最常出现在呼吸道和尿道。肺炎克雷伯杆菌倾向于感染免疫力低下的群体，例如 老人和儿童。当机体抵抗力低下或服用免疫抑制剂以及长期大量服用抗生素导致菌群失调 时，该病原菌易感染宿主致病，如肺炎、败血症、肝脓肿、脑膜炎、泌尿系统发炎或是伤口感 染。而且在肺炎克雷伯杆菌感染的早期阶段，宿主的炎症反应受到了抑制。由于具有快速传 播的特点，肺炎克雷伯杆菌在医院有着爆发的态势。
[0006] 类核相关蛋白（Nucleoid-associated proteins)是一类广泛存于革兰氏阴性细 菌中非常保守的蛋白，参与细菌DNA的构象改变、复制、重组、修复和转录。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种ERK信号通路抑制剂，旨在抑制ERKl/ 2磷酸化，使其上游激活剂MEKl不能与ERK1/2相互作用，从而抑制ERK1/2磷酸化。
[0008]所述抑制剂是肺炎克雷伯杆菌分泌蛋白NdpA，其氨基酸序列如(a)或(b)或(c):
[0009] (a)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0010] (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有 抑制ERK信号通路活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；
[0011] (c)与(a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类似 物。
[0012 ]所述抑制剂能抑制细胞外信号调节激酶ERK1 /2的磷酸化。
[0013] 本发明还提供一种ERK信号通路抑制剂突变体，是在SEQ ID NO. 1所示序列基础 上，将第15位的赖氨酸K突变为丙氨酸A，或将第16位的精氨酸突变丙氨酸A，或将第23位的 亮氨酸L突变为谷氨酸E。
[0014]本发明要解决的第二个技术问题是提供所述抑制剂的制备方法，包括以下步骤： [0015] (1)构建含有编码NdpA蛋白的基因的重组质粒pET-28a-NdpA，并将质粒转化到大 肠杆菌BL21中，在30°C以IPTG诱导蛋白表达；
[0016] (2)超声破菌，高速离心后收取上清液，将上清液流过填充好的Ni-NTA Agarose 中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入含有咪唑的洗脱液洗脱蛋白，将收集的 洗脱液加入到I OkD的蛋白浓缩管中，离心浓缩；
[0017] ⑶在蛋白浓缩管中加入PBS混勾后离心、分装蛋白，先用液氮速冻，再放到-80°C 保存待用。
[0018] 本发明提供ERK信号通路抑制剂可用于筛选、制备治疗ERK信号通路相关的疾病的 药物，或用于筛选、制备抗肿瘤、缓解动脉粥样硬化和痛风的药物，或用于筛选、制备治疗肺 炎克雷伯杆菌导致的感染性疾病的药物。
[0019] 本发明发现肺炎克雷伯杆菌分泌性效应蛋白NdpA通过抑制ERK1/2磷酸化而抑制 ERK信号通路。本发明发现NdpA通过自身的D模序与ERK1/2直接结合，导致MEKl不能与ERKl/ 2相互作用，使得ERK1/2不能磷酸化激活。由于临床上多种疾病的发生都与ERK信号通路的 异常激活相关，因此控制ERK1/2的磷酸化水平有利于治疗很多疾病。本发明成果将来可为 临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，尤其在抗肿瘤、缓解动脉粥样硬化和痛风等多 种药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开 发ERK信号通路的抑制剂。此外，该成果还对寻找新的抗肺炎克雷伯杆菌等病原导致的感染 性疾病的药物靶点和筛选新药具有重要的实际意义。
【附图说明】
[0020] 图I = (A)NdpA抑制ERK信号通路，每组数据(平均值土标准误差）至少代表3个独立 的实验，*P〈〇. 05，#P〈0.0 l (双尾未配对t检验）；（B)NdpA抑制ERK1/2磷酸化。
[0021] 图2:NdpA 与 ERK1/2 相互作用。
[0022] 图3: NdpA抑制MEK1和ERK1 /2的相互作用。
[0023] 图4: (A)D模序的突变体NdpA(L21E)显著地削弱了NdpA对ERK信号通路的抑制作 用，每组数据(平均值土标准误差)至少代表3个独立的实验，扑〈0.05，*扑〈0.01(双尾未配 对t检验）；（B)D模序的突变体NdpA(L21E)不能有效结合ERK1/2; (C)突变体NdpA(L21E)不能 有效抑制ERK1/2的磷酸化。
【具体实施方式】
[0024] 由于ERKl和ERK2高度相似，其同源性高达90%，且细胞中ERK2的含量远高于ERKl， 所以以下是实施例采用ERK2，ERK2基因序列如GeneID :5594所示。MEKl基因的序列如 GeneID: 5604所不。
[0025]实施例1 NdpA对ERK信号通路活化的抑制作用
[0026] (A)采用双荧光报告基因技术检测NdpA对ERK信号通路的影响
[0027] 1)构建含有编码NdpA基因的重组质粒p3 XFlag-CMVH-NdpA;
[0028] 2)采用重叠延伸PCR法将MEKl蛋白中的218位丝氨酸以及222位丝氨酸分别突变为 谷氨酸和天冬氨酸后获得MEKl-ED基因片段，构建含有编码MEKl-ED基因的重组质粒pCS2-HA-MEKl-ED；
[0029] 3)采用磷酸钙转染法将重组质粒p3 X Flag-CMVH-NdpA和检测ERK信号通路活化 情况的质粒 pGal4-Elk、pGal4-luc、pRL-TK(购买自 Promega 公司）以及质粒 pCS2-HA-MEKl-ED共转染进HEK293T细胞；
[0030] 4)转染6h后换新鲜的无血清培养基，24h后用promega公司的试剂盒以及荧光测量 仪检测NdpA对MEKl -ED激活的ERK信号通路的影响。
[0031] (B)检测NdpA对ERK1/2磷酸化的影响
[0032] 将上述检测荧光后的细胞裂解液用BCA法定量后用于Western Blot实验，用P-ERKl/2(9101;Cell Signaling)抗体和ERK1/2抗体（9102;Cell Signaling)分别检测ERKl/ 2的磷酸化水平和总ERK1/2蛋白量。
[0033] (C)实验结果分析
[0034] 双荧光报告基因实验结果表明NdpA可以显著抑制MEKl-ED激活的ERK信号通路(见 图1A);而对应的Western Blot证明NdpA可以抑制ERK1/2的磷酸化（见图1B);因此NdpA是通 过抑制ERK1/2的磷酸化而阻碍ERK信号通路的活化。
[0035]实施例2 NdpA蛋白能够与ERK蛋白相互作用
[0036] 由于肺炎克雷伯杆菌与大肠杆菌同属于肠杆菌科，两者的相似性较高，用大肠杆 菌纯化的蛋白较在细胞里转染表达的蛋白更能够模拟肺炎克雷伯杆菌NdpA与宿主靶蛋白 的相互作用，所以本实施例用大肠杆菌BL21纯化了融合蛋白His-NdpA，用His-NdpA检测其 与HEK293T细胞内过表达的Flag-ERK2的相互作用。
[0037] (A)His-NdpA蛋白的制备
[0038] 1)构建含有编码NdpA基因的重组质粒pET-28a-NdpA，并将质粒转化到大肠杆菌 BL21 中；
[0039] 2)将携带质粒的大肠杆菌BL21在30°C条件下加入IPTG过夜诱导蛋白表达；
[0040] 3)超声破菌，高速离心后收取上清液；
[0041 ] 4)将上清液缓缓流过填充好Ni-NTAAgar〇Se(Qiagen公司）中，然后加入柱洗涤缓 冲液充分洗涤柱子，最后加入2_3ml洗脱液洗脱蛋白；
[0042] 5)将收集的洗脱液加入到IOkD的蛋白浓缩管(millipore)中，3000rpm离心浓缩 20min；
[0043] 6)在蛋白浓缩管中加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)混匀后重复离心（同步骤5);
[0044] 7)分装蛋白，先用液氮速冻，再放到-80°C保存待用。
[0045] (B)免疫共沉淀（0〇-;[1111]11111(^代(^。;^&1:;[011，&3-1?)实验
[0046] 1)构建编码ERK2的质粒p3XFlag-ERK2转染到HEK293T细胞，6h后更换新鲜含有 10 %FBS的DMEM培养基继续培养，24h后收集细胞，用Co-IP裂解液裂解，4°C、12000g离心 IOmin，收集上清；
[0047] 2)在裂解后的上清中加入偶联了Flag抗体的凝胶颗粒(F3165 !Sigma-AldrichMPI His-NdpA，4°C 过夜孵育；
[0048] 3)Western Blot检测Flag_ERK2和His-NdpA的结合情况。
[0049] (C)实验结果分析
[0050]从图2中可以看出，偶联了Flag抗体的凝胶颗粒不能免疫沉淀HiS-NdpA，而在 Flag-ERK2的存在的情况下则可以有效地免疫沉淀His-NdpA，这就说明NdpA能够与ERK蛋白 相互作用。
[0051 ] 实施例3 NdpA蛋白抑制MEKl与ERK2的相互作用
[0052] (A)Co-IP 实验
[0053] 1)构建重组质粒 pCNDA6A-MEKl、p3 X Flag-ERK2、p3 X Flag-NdpA;
[0054] 2)将重组质粒 pCNDA6A-MEKl 和 p3XFlag-ERK2和（或）p3XFlag-NdpA 共转染到 HEK293T细胞，转染6h后，更换新鲜含有10 % FBS的DMEM培养基继续培养，24h后收集细胞，用 Co-IP裂解液裂解细胞，4°C、12000g离心10min，收集上清；
[0055] 3)在裂解后的上清中加入偶联了Myc抗体的凝胶颗粒(SC-40AC;Santa Cruz)，4°C 过夜孵育；
[0056] 4)Western Blot检测Flag_ERK2和Myc-MEKl的结合情况。
[0057] (B)实验结果分析
[0058] 从图3中可以看出，MEKl能够结合ERK2,但是过表达NdpA后，MEKl便不能有效结合 ERK2〇
[0059] 实施例4突变体NdpA(L21E)
[0060] (A)采用双荧光报告基因技术检测NdpA对ERK信号通路的影响
[0061 ] 1)构建含有编码NdpA/NdpA (K15A) /NdpA (R16A) /NdpA (L21E) /NdpA (2 3E)基因的重 组质粒 p3XFlag-CMV14-NdpA/NdpA(K15A)/NdpA(R16A)/NdpA(L21E)/NdpA(23E);
[0062] 2)采用磷酸钙转染法将重组质粒 p3XFlag-CMV14-NdpA/NdpA(K15A)/NdpA (R16A)/NdpA(L21E)/NdpA(23E)和检测 ERK 信号通路活化情况的质粒 pGal4-Elk、pGal4-luc、pRL-TK以及表达ERK信号通路组成型激活剂HA-MEKl-ED的质粒pCS2HA-MEKl-ED共转染 进HEK293T细胞；
[0063] 4)转染6h后换新鲜的无血清培养基，24h后用promega公司的试剂盒以及荧光测量 仪检测 NdpA 及突变体 NdpA(K15A)/NdpA(R16A)/NdpA(L21E)/NdpA(23E)对 MEKl-ED 激活的 ERK信号通路的影响。
[0064] (B) Hi s -NdpA/Hi s -NdpA (L21E)蛋白的制备
[0065] 1)构建含有编码NdpA基因的重组质粒pET-28a-NdpA、pET-28a-NdpA(L21E)，并将 质粒转化到大肠杆菌BL21中；
[0066] 2)将携带质粒的大肠杆菌BL21在30°C条件下加入IPTG过夜诱导蛋白表达；
[0067] 3)超声破菌，高速离心后收取上清液；
[0068] 4)将上清液缓缓流过填充好Ni-NTAAgar〇Se(Qiagen公司）中，然后加入柱洗涤缓 冲液充分洗涤柱子，最后加入2_3ml洗脱液洗脱蛋白；
[0069] 5)将收集的洗脱液加入到IOkD的蛋白浓缩管(millipore)中，3000rpm离心浓缩 20min；
[0070] 6)在蛋白浓缩管中加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)混匀后同步骤5)重复离心；
[0071] 7)分装蛋白，先用液氮速冻，再放到-80°C保存待用。
[0072] (C)ERK蛋白的制备
[0073] 1)构建含有编码ERK2基因（GeneID:5594)的重组质粒pGEX-6p-1-ERK2，并将该质 粒和编码GST-PreScission Protease(PSP)的质粒（SG3050-0101;SHANGHAI GENOMICS)分 别转化到大肠杆菌BL21中；
[0074] 2)将携带GST-ERK2和GST-PSP质粒的大肠杆菌BL21分别在30°C条件下加入IPTG诱 导蛋白表达，过夜诱导表达；
[0075] 3)超声破菌，高速离心后分别收取上清液；
[0076] 4)将上清液分别缓缓流过填充好Glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare公 司）中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入2-3ml洗脱液洗脱蛋白；
[0077] 5)将收集的洗脱液分别加入到IOkD的蛋白浓缩管(millipore)中，3000rpm离心浓 缩20min;
[0078] 6)将等体积的GST-ERK2和GST-PSP混合，并与Glutathione Sepharose 4B在4°C过 夜孵育；
[0079] 7)收集上清并加入到IOkD的蛋白浓缩管(mi 11 ipore)中，3000rpm离心浓缩20min;
[0080] 8)在蛋白浓缩管中加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)混匀后重复离心（同步骤5);
[0081] 9)分装蛋白，先用液氮速冻，再放到-80°C保存待用。
[0082] (D)体外 pull-down 实验
[0083] 1)将携带 His-NdpA 或 His-NdpA(L21E)蛋白的Ni-NTAAgarose(Qiagen 公司）与 ERK2 于4°C过夜孵育。
[0084] 2)Western Blot检测His-NdpA或His-NdpA(L21E)与ERK2的结合情况。
[0085] (E) NdpA (L21E)对ERK1 /2磷酸化的影响
[0086] 1)采用磷酸钙转染法共转染重组质粒pCS2-HA-MEKl-ED和p3 X Flag-CMVH-NdpA 或 p3XFlag-CMV14-NdpA(L21E)进 HEK293T 细胞；
[0087] 2)转染6h后换新鲜的无血清培养基，24h后通过Western Blot检测NdpA或NdpA (L 21E)对磷酸化E RK1 / 2的磷酸化的影响。
[0088] (F)实验结果分析
[0089] 突变体NdpA(L21E)明显削弱了NdpA对ERK信号通路的抑制作用，而突变体NdpA (K15A) /NdpA (R16A) /NdpA (23E)对ERK信号通路依然是明显的抑制(见图4A); NdpA在体外能 够直接结合ERK2,但是突变体NdpA(L21E)却不能有效结合ERK2(见图4B);与NdpA相比，突变 体NdpA(L21E)不能有效抑制ERK1/2的磷酸化(见图4C)。
[0090] 虽然本发明已以较佳实例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术 的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围 应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种ERK信号通路抑制剂，其特征在于，氨基酸序列如以下(a)或(b)或(C)所示： (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有ERK 信号通路抑制活性的由(a)衍生的多肽或其类似物； (c) 与(a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类似物。2. 权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，直接与ERK1/2结合，抑制MEK1和ERK1/2的结 合，从而抑制ERK1/2被MEK1磷酸化激活。3. -种ERK信号通路抑制剂，其特征在于，是在SEQ ID NO. 1所示序列基础上，将第15位 的赖氨酸K突变为丙氨酸A，或将第16位的精氨酸突变丙氨酸A，或将第23位的亮氨酸L突变 为谷氨酸E。4. 一种制备要求1-3任一所述的抑制剂的方法，其特征在于， (1) 构建含有编码NdpA蛋白的基因的重组质粒pET-28a-NdpA，并将质粒转化到大肠杆 菌BL21中，在30°C以IPTG诱导蛋白表达； (2) 超声破菌，高速离心后收取上清液，将上清液流过填充好的Ni-NTAAgarose中，然后 加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入含有咪唑的洗脱液洗脱蛋白，将收集的洗脱液 加入到10kD的蛋白浓缩管中，离心浓缩； (3) 在蛋白浓缩管中加入PBS混匀后离心、分装蛋白，先用液氮速冻，再放到-80°C保存 待用。5. 权利要求1-3任一所述的抑制剂在筛选、制备治疗ERK信号通路相关的疾病的药物中 的用途。6. 权利要求1-3任一所述的抑制剂在筛选、制备抗肿瘤、缓解动脉粥样硬化和痛风的药 物中的用途。7. 权利要求1-3任一所述的抑制剂在筛选、制备治疗肺炎克雷伯杆菌导致的感染性疾 病的药物中的用途。
【文档编号】C12N1/21GK105859844SQ201610213178
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月7日
【发明人】刘翠华, 许光华, 汪静, 李冰曦, 严景华
【申请人】中国科学院微生物研究所