一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，试样经提取液提取后低温高速离心，上清液经液相色谱分离、二极管阵列检测器检测，保留时间定性、外标法定量。步骤一：制备标准工作溶液、加标用标准使用液和模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油；步骤二：采用高效液相色谱对步骤一的三种溶液分别进行液相色谱测定；以标准工作溶液中叶绿素铜钠的浓度x为横坐标，以对应测得的峰面积y为纵坐标，绘制标准工作溶液回归曲线，根据曲线得到的线性方程y=ax+b，计算出回归曲线的斜率a和截距b；步骤三：根据标准曲线方程，计算橄榄油叶绿素铜钠浓度。本发明的方法采用通用型的液相色谱柱和紫外检测器对叶绿素铜钠进行高效液相色谱测定，并能排除其他物质测定的干扰。本发明的方法可以准确测量出橄榄油中叶绿素铜钠含量，定量准确可靠，且重现性良好。
【专利说明】一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种测定橄榄油中叶绿素铜钠的方法。
【背景技术】
[0002]橄榄油以其独特理化指标与保健功能，逐步成为新世纪理想的食用油，富含丰富的单不饱和脂肪酸，即油酸及亚油酸、亚麻酸,还有维生素A、维生素B、维生素D、维生素E、维生素K及抗氧化物等，被认为是迄今所发现的油脂中最适合人体营养的油。
[0003]美国农业部2013年9月发布的报告显示，2012年10月至2013年9月，美国市场葵花籽油的平均价格是每吨约合人民币9000元；大豆油每吨的平均价格是约合人民币6500元；而正品特级初榨橄榄油的价格在每吨3.2万-3.6万元人民币。即便以成本较高的葵花籽油计算，每吨食用油的成本也只有正品特级初榨橄榄油的1/3左右。巨大的利益诱惑下，有些不法商家会在葵花籽油和大豆油等油品中加叶绿素铜钠冒充橄榄油销售。由于市场上销售的很多未充分精炼的初榨橄榄油含有部分叶绿素，看上去都是黄绿色，导致人们以为黄绿色的橄榄油才是纯正的橄榄油，这也成了人们选择橄榄油的一个重要依据。不法商家就利用消费者的这一心理，在大豆油、葵花籽油等低廉油加叶绿素铜钠冒充橄榄油。2013年，台湾的味全橄榄油事件就是一起典型的橄榄油掺假事件，引起社会的广泛重视。
[0004]叶绿素铜钠，是叶绿素的一类衍生物铜叶绿素的钠盐，在食品工业中常做着色剂使用，也就是我们通常所说的色素，常用的还有叶绿素铜钾。叶绿素是地球上分布最广的天然色素，主要存在于绿色植物中。由于叶绿素极不稳定，导致叶绿素在食品工业中难以得到应用。故在食品工业中常采用叶绿素铜钠作为着色剂广泛使用。除此之外，叶绿素铜钠还被人们应用在医药领域。在我国食品添加剂标准GB2760-2011及GB26406-2011中，叶绿素铜钠可用于冷冻饮品、蔬菜罐头、熟制豆类、加工坚果、糖果、烘烤食品、果蔬汁以及配制酒食品中，最大使用量一般不得超过0.5克/千克。但是，叶绿素铜钠盐在食品中的应用范围并不包括食用油，因为人类每天都会摄入大量的食用油，尤其是食用油在高温烹调过程中会释出铜及氧化，将会导致人体肝肾受损，危害健康。人体吸收过量，会伤肝肾或造成贫血，长期食用会危害健康。联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)对叶绿素铜钠进行安全评估认为，叶绿素铜钠的半数致死量(LD)50>10000毫克/千克(小鼠经口)，每日允许摄入量(ADI)为0-15毫克/千克。因此，叶绿素铜钠用于食用油中，无论是否有害，都是违反了食品安全国家标准的规定(GB2760-2011)。2013年台湾橄榄油掺假事件使得叶绿素铜钠以及橄榄油掺假问题成为公众高度关注的领域。
[0005]目前尚无关于叶绿素铜钠含量的检测方法及标准，因此迫切需要制定橄榄油中叶绿素铜钠的标准检测方法来填补国内外空白，以加强市场上橄榄油的检验监管。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于:。本发明所述的的技术问题可通过以下步骤得以解决:
1)制备叶绿素铜钠标准工作溶液、加标用标准使用液以及模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油并提取其中的叶绿素铜钠，制备叶绿素铜钠提取液；
2)采用高效液相色谱对I)中的3种溶液进行检测，采用保留时间定性、峰面积定量；
3)根据标准曲线方程，对橄榄油中叶绿素铜钠的含量进行准确定量分析。
[0008]所述的一种用高效液相色谱方法对橄榄油中叶绿素铜钠进行定性、定量分析方法，包括以下步骤:
步骤一:制备标准工作溶液、加标用标准使用液和模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油并提取其中的叶绿素铜钠，制备叶绿素铜钠提取液；所述标准工作溶液为由叶绿素铜钠配备而成的标准工作溶液和橄榄油标准工作溶液；所述模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油由空白橄榄油样品添加加标用叶绿素铜钠使用液获得；所述空白橄榄油样品为未受叶绿素铜钠污染的橄榄油；
步骤二:采用高效液相色谱对步骤一的溶液分别进行测定；以标准工作溶液中叶绿素铜钠的浓度X为横坐标，以对应的测得的峰面积y为纵坐标，绘制标准工作溶液回归曲线，根据曲线得到的线性方程y^aA+bi和y2=a2x2+b2，分别计算出回归曲线的斜率和截距；步骤三:根据公式X= (y-b) /a，计算待测橄榄油中叶绿素铜钠的浓度；其中y为测得的叶绿素铜钠(a和b)的峰面积之和。
[0009]所述步骤一中，模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油和空白试液均平行制备两份，然后进行步骤二和步骤三，若两次独立测试结果的绝对差值不超过其算术平均值的20%，则测试准确。
[0010]所述步骤一中，标准工作溶液的制备方法具体为:准备叶绿素铜钠标准储备溶液:准确称取叶绿素铜钠的标准品0.lg，加入优级纯的亚硫酸氢钠2g，加入15mL超纯水溶解混匀后，分别加入50mL甲醇、20mL丙酮，最后用甲醇定容至刻度。该储备液在4 °〇下密封避光储存。
[0011]所述步骤一中，模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油的制备方法为:(a)由空白橄榄油添加入加标用叶绿素铜钠标准使用液作为模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油；(b)加标用叶绿素铜钠制备:根据叶绿素铜钠易溶于水不溶于油的特点以及四氢呋喃既溶于甲醇又溶于油的特点，固体标准品用尽可能少的甲醇溶解，再用四氢呋喃定容，即为样品加标用标准溶液。(c)提取:取2g油样于15mL离心管中，加入混合提取液5mL，充分混匀，涡旋振提5min ;在40C、10000转/min离心5min，取ImL的上清液做为测试液，进HPLC分析测试。
[0012]所述的叶绿素铜钠含量的测定方法，其色谱条件为:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱或性能相当者；
柱温:20-40 0C ；
检测波长:400-410 nm ；
流动相:有机相和醋酸盐缓冲液组成；
所述流动相中醋酸盐缓冲液的浓度为0.1-0.2mol/L, pH为7.0-8.0，有机相为甲醇或 丙酮。
[0013]所述步骤一中，标准工作溶液的制备方法具体为:准备叶绿素铜钠标准储备溶液:准确称取叶绿素铜钠的标准品并利用合适的溶剂配置标准溶液，并在溶液中加入适量保护剂，避光、4°c保存。
[0014] 有益效果
采用上述技术方案后，本发明具有积极的效果:
由于本发明是采用了保留时间定性、峰面积定量的色谱分离分析技术，从而保证了检测结果的准确性。本发明的新颖之处在于发明了橄榄油中叶绿素铜钠的液相色谱检测方法，保持检测技术直观、快速、方便、成熟、廉价等优点。本发明的方法采用普通高效液相色谱，仪器成本低，易于推广使用，且操作简单。
[0015]本发明的方法可以广泛用于叶绿素铜钠成分的鉴定，在食品安全检测领域都有广泛的应用前景。本发明目的在于提供一种橄榄油中掺入的叶绿素铜钠含量的检测方法。其他常见食品中叶绿素铜钠含量的测定都可以采用与此类似的方法完成。
[0016]本专利所申请的叶绿素铜钠检测技术，作为一种液相色谱分析检测技术，具有以下优点:
前处理简单:只需要将流动相溶液与待测样品混合均匀后提取即可，不需要复杂的前处理设备，便于推广；
快速:检测15分钟后判读结果；
灵敏:最低检出限可达2ppm ；
特异性高:由于在检测过程采用保留时间定性，结果准确；
价格便宜:本检测方法采用普通的液相色谱仪器，费用大大低于液相色谱质谱联用仪器，易于检测机构推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1:0.05mg/mL的叶绿素铜钠标准液相色谱图；(叶绿素b铜钠:10.67min)、叶绿素 a 铜钠:13.47min)
图2:橄榄油空白样品液相色谱图；
图3:在图2所用的橄榄油空白样品添加50ppm叶绿素铜钠后测定的液相色谱图。
[0018]
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
[0020]某品牌橄榄油中叶绿素铜钠量的测定
1、材料:橄榄油、叶绿素铜钠标准品、甲醇、丙酮等色谱纯有机溶剂、超纯水、一次性离心管。
[0021]2、方法
2.1、制备叶绿素铜钠标准工作溶液、加标用叶绿素铜钠使用溶液:
标准工作溶液的制备方法具体为:(a)准备叶绿素铜钠标准储备溶液:准确称取叶绿素铜钠的标准品(含量≥99%) 0.1g (精确到0.1mg),置于100 mL棕色容量瓶中，加入优级纯的亚硫酸氢钠2g,加入15mL超纯水溶解混匀后,分别加入50mL甲醇、20mL丙酮,最后用甲醇定容至刻度，该储备液在4 °C下密封避光储存；(b)准备加标用标准使用液:根据叶绿素铜钠易溶于水不溶于油的特点以及四氢呋喃既溶于甲醇又溶于油的特点，固体标准品用尽可能少的甲醇溶解，再用四氢呋喃定容，即为样品加标用标准溶液；用四氢呋喃按照所需的稀释液浓度大小进行稀释，再按照所需的加标浓度的大小进行样品加标。
[0022]2.2、模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油的制备及叶绿素铜钠的提取方法为:(a)用空白橄榄油加入加标用叶绿素铜钠标准使用液获得掺入叶绿素铜钠橄榄油模拟物；(b)准确称取橄榄油样品或前述(a)中得到橄榄油模拟物2g于15mL离心管中，精确至0.01g ;(c)提取:向离心管中加入混合提取液5mL,充分混匀，润旋振提5min ;在4°C、10000转/min离心5min，取ImL的上清液做为测试液，进HPLC分析测试。
[0023]2.3、液相条件: a)色谱柱
中检维康 ODS C18 分析柱，250 mmX 3.9 mm , 10 Mm。
[0024]b)流动相
流动相A:甲醇:0.lmol/L醋酸铵(PH=7.5):丙酮=65:20:15 ；
流动相B:甲醇:丙酮=60:40 ；
梯度洗脱
流动相 A:0-15min: 100% — 0% ；
15-18min: 0% ；
18-18.5min: 0% — 100% ;
18.5-20min: 100%。
[0025]进样量:10μ L ；
柱温:35 °C ；
流速:1.0 mL/min ；
检测波长:λ =404 nm ；
2.4、标准曲线的绘制:分别移取标准储备溶液用流动相配制成浓度分别为l.0yg/mL, 5.0 μ g/L，10.0 μ g/L，50.0 μ g/L，100.0 μ g/L 的标准工作溶液，取 10 μ L 注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。标准曲线方程分别为:叶绿素a铜钠:yi = 47.09Xl+9.79 ;叶绿素b 铜钠:y2 = 29.17x2+5.21 ;相关系数分别为 r2 = 0.9999 和 r2 = 0.9999.根据公式计算待测橄榄油中叶绿素铜钠浓度以及添加加标用叶绿素铜钠标准使用液的橄榄油中叶绿素铜钠浓度。
[0026]2.5、计算结果及方法的重复性试验以及精密度和回收率 经计算，所测样品橄榄油中未检出叶绿素铜钠。
[0027]采用添加回收法，对不含叶绿素铜钠的橄榄油也即对空白试液分别添加叶绿素铜钠为2.00 yg/L、25.0 μ g/L,50.0 μ g/L水平进行测定，每个水平平行测定6次，进行回收率和精密度计算，回收率和精密度试验结果详见表1。
[0028]表1叶绿素铜钠在模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油中添加回收率和精密度
I添加浓度II添加浓度2I添加浓度3
添加浓度(μ g/L) 2.00~25.050.0
测定值(μ g/L)1.98~24.549.0
回收率99.0%%~θ%98.0%_
相对标准偏差2.5%~%1.9%— 由表I可以看出，本方法的回收率和精密度良好。方法对橄榄油模拟物测定的回收率在98.0%?99.0% ;精密度在10%以下；两次独立测试结果的绝对差值不超过其算术平均值的20% ;定量准确可靠，且重现性良好。
[0029]以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)制备叶绿素铜钠标准工作溶液、加标用标准使用液以及模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油并提取其中的叶绿素铜钠，制备叶绿素铜钠提取液； 2)采用高效液相色谱对待测溶液进行检测，采用保留时间定性、峰面积定量； 3)根据标准曲线方程，对橄榄油中叶绿素铜钠的含量进行准确定量分析。
2.根据权利要求1中所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于该检测方法包括以下步骤: 步骤一:制备标准工作溶液、加标用标准使用液和模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油:所述标准工作溶液为由叶绿素铜钠配备而成的标准工作溶液和橄榄油标准工作溶液；所述模拟掺入叶绿素铜钠的橄榄油由空白橄榄油样品添加加标用叶绿素铜钠使用液获得；所述空白橄榄油样品为未受叶绿素铜钠污染的橄榄油； 步骤二:采用高效液相色谱对步骤一的溶液分别进行测定；分别以标准工作溶液中叶绿素a铜钠的浓度X1为横坐标，以对应的测得的峰面积yi为纵坐标；叶绿素b铜钠的浓度X2为横坐标，以对应的测得的峰面积72为纵坐标，绘制标准工作溶液回归曲线，根据曲线得至Li的线性方程Y1=S1Xjb1和y2=a2x2+b2,分别计算出回归曲线的斜率a” a2和截距Vb2 ； 步骤三:根据公式X1= Cy^b) /a和X2= (y2-b) /a计算叶绿素a铜钠和叶绿素b铜钠浓度X1和x2，叶绿素铜钠浓度X=XjX2 ;其中Y1和y2分别为测得的掺入叶绿素铜钠橄榄油中叶绿素a铜钠和叶绿素b铜钠的峰面积。
3.根据权利要求1或2所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于色谱条件为: 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱或性能相当者； 柱温:20-40°C ； 检测波长:400-410 nm ； 流动相:有机相和醋酸盐缓冲液组成； 所述流动相中醋酸盐缓冲液的浓度为0.1-0.2mol/L, pH为7.0-8.0，有机相为甲醇或丙酮。
4.根据权利要求1或2所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于:所述步骤一中，标准工作溶液的制备方法具体为:准备叶绿素铜钠标准储备溶液:准确称取叶绿素铜钠的标准品并利用合适的溶剂配置标准溶液，并在溶液中加入适量保护剂，避光、4°C保存。
5.根据权利要求1或2所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于:所述步骤一中，模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油的制备及叶绿素铜钠的提取方法为:(a)将加标用叶绿素铜钠标准使用液加入到空白橄榄油中得到掺入叶绿素铜钠橄榄油模拟物；(b)取l_2g模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油于离心管中，加入混合提取液5-10mL，充分混匀，涡旋振提5-10min ;在4°C、10000转/min离心5min，取上清液做为测试液，进HPLC分析测试。
6.根据权利要求2所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于:所述步骤一中，模拟掺入叶绿素铜钠橄榄油和空白试液均平行制备两份，然后进行步骤二和步骤三，若两次独立测试结果的绝对差值不超过其算术平均值的20%，则测试准确。
7.根据权利要求1或2所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于:所述步骤一中，橄榄油加标用标准工作溶液的制备方法为:固体标准品用少许甲醇溶解，再用四氢呋喃定容，即为样品加标用标准溶液；用四氢呋喃按照所需的稀释液浓度大小进行稀释，再按照所需的加标浓 度的大小进行样品加标。
8.权利要求3所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于:所述保护剂为亚硫酸氢钠；配置标准品所用试剂为纯水和有机相的混合液。
9.权利要求1或2所述的一种橄榄油中叶绿素铜钠的测定方法，其特征在于:所述叶绿素铜钠的含量为叶绿素a铜钠和叶绿素b铜钠含量的加和。
【文档编号】G01N30/02GK103969373SQ201410229192
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】娄婷婷, 葛宝坤, 陈其勇, 章骅, 赵孔祥 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心