针对人程序性死亡受体pd-1的抗体的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请日为2008年6月13日的国际申请PCT/US2008/007463进入中 国、申请号为200880103544. 3的题为"针对人程序性死亡受体Η)-1的抗体"的发明专利申 请的分案申请。
技术领域 [0002] 和【背景技术】
[0003] 程序性死亡受体I (PD-I)是首先在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受 体。该受体与其配体的相互作用在体外和体内一直显示减弱的T细胞应答。阻断ro-i与 其配体之一 ro-Ll间的相互作用显示提高肿瘤特异性⑶8+T细胞的免疫性，因此，可有助于 免疫系统清除肿瘤细胞。
[0004] PD-I (由基因 Pdcdl编码）为与⑶28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族成员。 业已显示ro-i当与其配体（PD-L1和/或ro-L2)结合时会负调节抗原受体信号转导。业 已弄清鼠 F1D-I结构以及小鼠 F1D-I与人F1D-Ll的共结晶结构（Zhang，X.等，Immunity20 : 337-347(2004) ;Lin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3011-6(2008))。PD-I 及类似的家 族成员为I型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的Ig可变型（V-型）结构域和负责结合信 号转导分子的胞质尾区。ro-ι胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体ΙΤΙΜ(免疫受 体酪氨酸抑制作用模体）和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体）。
[0005] 在T细胞刺激后，ro-i将酪氨酸磷脂酶SHP-2募集到胞质尾区内的ITSM模体， 这导致效应分子的去磷酸化作用，效应分子例如有⑶3 ζ、PKC Θ和ZAP70,这些分子参与 CD3T细胞信号转导级联。Η)-1减量调节T细胞应答的机理与CTLA-4的相似，但又有所 不同，因为这两种分子都调控重叠的一系列信号转导蛋白（Parry等，Mol. Cell Biol. 25 : 9543-9553.)。Bennett及合作者表明，仅当激活和抑制两种信号都在同一表面时，Η)-1介 导的对τ细胞信号转导的抑制作用才会有效，这表明ro-i信号转导机制由时间及空间决定 (Bennett F.等，J Immunol. 170 :711-8(2003)) 〇
[0006] 研宄显示ro-1在激活的淋巴细胞（外周⑶4+和⑶8 +T细胞、B细胞和单核细胞） 上表达，并且还显示在胸腺发育期间在⑶4TD8_ (双阴性）T细胞以及NK-T细胞上表达。
[0007] ro-i配体（PD-L1和ro-L2)为组成型表达，或在多种细胞类型中可被诱导，这些细 胞类型包括非造血组织以及各种肿瘤类型。PD-Ll在B细胞、T细胞、髓样细胞和树突状细 胞（DC)上表达，但也在外周细胞（例如微血管内皮细胞）和非淋巴器官（如心脏、肺等） 中表达。与此相反，PD-L2仅在巨噬细胞和DC中存在。ro-i配体的表达模式提示了 ro-i 在维持外周耐受中的作用，并且用于调节在外周中的自我活化的T细胞和B细胞应答。两 种配体都为含有胞外区域中的IgV-样和IgC-样结构域的I型跨膜受体。两种配体都含有 含未知信号转导模体的短胞质区。
[0008] 迄今有大量的研宄显示ro-i与其配体的相互作用在体外及体内导致抑制淋巴细 胞增殖。业已显示破坏ro-1/PD-Ll相互作用可增加 T细胞增殖和细胞因子产生，并阻断 细胞周期进展。最初对Pdcdl+小鼠的分析并没有鉴定任何明显的免疫学表型。然而，老 龄小鼠自发发展了与Pdcdl缺陷回交株系不同的自身免疫疾病。这些疾病包括狼疮样增殖 性关节炎（C57BL/6) (Nishimura H.等，Int. Immunol. 10:1563-1572(1998))、致死性心肌 病（BALB/c) (Nishimura Η·等，Science 291 :319-322(2001))和 I 型糖尿病（NOD) (Wang J.等，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A 102:11823-11828(2005))。总之，对敲除动物的分析使 得清楚了 ro-1主要起诱导并调节外周耐受的作用。因此，治疗性阻断ro-i途径可有助于克 服免疫耐受。这种选择性阻断可用于治疗癌症或感染以及用于在接种（预防性或治疗性） 期间加强免疫性。
[0009] 在文献中已确定了 ro-i在癌症中的作用。已知肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受 有效的免疫破坏。最近显示ro-Li在许多小鼠和人肿瘤中表达（并在大多数ro-Li阴性肿 瘤细胞系中可由IFNy诱导），并被推定介导免疫逃避（Iwai Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 :12293-12297 (2002) ;Strome S.E.等，Cancer Res·，63 :6501-6505 (2003) 〇
[0010] 通过免疫组织化学评估活组织检查业已在人的很多原发性肿瘤中发现ro-i (在 肿瘤浸润淋巴细胞上）和/或ro-Li(在肿瘤细胞上）。这样的组织包括肺癌、肝癌、 卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔 鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤（Brown J.A.等，J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003) ;Dong Η·等，Nat. Med. 8 :793-800 (2002) ;Wintterle 等，Cancer Res. 63 :7462-7467 (2003) ;Strome S.E.等，Cancer Res·，63 :6501-6505 (2003); Thompson R. H.等，Cancer Res. 66 :3381-5 (2006) ；Thompson 等，Clin. Cancer Res. 13 ： 1757-61 (2007) ;Nomi T.等，Clin. Cancer Res. 13 :2151-7. (2007))。更引人注目的是，PD 配体在肿瘤细胞上的表达在多种肿瘤类型中与癌症患者预后不良相关联（在Okazaki和 Honjo, Int. Immunol. 19 :813-824(2007)中综述）。
[0011] 阻断ro-1/PD-Ll的相互作用可导致肿瘤特异性T细胞的免疫性提高，因此，有助 于由免疫系统清除肿瘤细胞。针对这一问题，进行了大量研宄。在侵袭性胰腺癌的鼠模型 中，Nomi 等（Clin. Cancer Res. 13 :2151-2157(2007))证明 PD-1/PD-L1 阻断的治疗功效。 给予针对ro-i或ro-Li的抗体显著抑制肿瘤生长。抗体阻断有效促进了肿瘤活性CD8+T 细胞浸润到肿瘤中，导致对抗肿瘤效应物（包括IFNy、粒酶B和穿孔蛋白）的增量调节。 另外，作者表明ro-i阻断可与化疗有效联合以产生协同作用。在另一项研宄中，使用小鼠 鳞状细胞癌模型，对ro-i或I 3D-Ll的抗体阻断显著抑制肿瘤生长（Tsushima F.等，Oral Oncol. 42 :268-274(2006)) 〇
[0012] 在其它研宄中，当与肿瘤特异性CTL克隆共同培养时，用ro-Li转染鼠肥大细胞瘤 细胞系导致肿瘤细胞的裂解减少。当加入抗ro-LlmAb时，细胞裂解得以恢复（Iwai Y.等， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 :12293-12297(2002))。研宄显示在小鼠肿瘤模型中体内 阻断roi/ro-Ll的相互作用提高过继性T细胞转移疗法的功效（Strome S.E.等，Cancer Res. 63 :6501-6505(2003))。ro-1在癌症治疗中所起作用的另外的证据来自用ro-1敲除 小鼠所做的实验。表达ro-Li的骨髓瘤细胞仅在野生型动物中生长（导致肿瘤生长并与 动物死亡有关），而不能在F 1D-I缺陷型小鼠中生长（Iwai Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 :12293-12297 (2002)) 〇
[0013] RIWong 等（Int. Immunol. 19 :1223-1234(2007))在对人的研宄中显示，在用疫 苗抗原和来自免疫个体的细胞进行的离体刺激测定中，用全人抗ro-i抗体对ro-i的阻断 增加了肿瘤特异性cds+t细胞（CTL)的绝对数量。在相似的研宄中，对ro-Li的抗体阻断 导致肿瘤相关抗原特异性细胞毒性T细胞的溶细胞活性提高，以及由肿瘤特异性T h细胞产 生的细胞因子增加 （Blank C.等，Int.J. Cancer 119:317-327(2006))。相同作者显示，在 体外当与抗CTLA-4阻断联合使用时，PD-Ll阻断增强了肿瘤特异性T细胞应答。
[0014] 总之，PD-i/ro-Li途径是开发癌症治疗的抗体疗法的被充分证实的靶标。抗ro-i 抗体还可用于慢性病毒性感染。在急性病毒性感染后产生的记忆CD8+T细胞具有很高功 能，并构成保护性免疫的重要组分。与此相反，慢性感染的特征常常在于病毒特异性T细胞 应答的不同程度的功能受损（衰竭），这种缺陷是宿主不能消除持续的病原体的主要原因。 尽管在感染的早期阶段最初产生功能效应T细胞，但它们在慢性感染期间逐渐失去功能。 Barber等（Barber等，Nature 439 :682-687(2006))显示，用LCMV实验室毒株感染的小鼠 发展为导致血液和其它组织中有高水平病毒的慢性感染。这些小鼠最初会产生较强的T细 胞应答，但随着T细胞衰竭而最终受到感染。作者发现在慢性感染小鼠中的效应T细胞的 数量和功能下降可通过注射阻断ro-ι和ro-Li之间相互作用的抗体来逆转。
[0015] 最近，有研宄显示ro-i在来自HIV感染的个体的T细胞中高度表达，并且受体表 达与T细胞功能损伤和疾病进展相关（Day等，Nature443 :350-4(2006) ;Trautmann L.等， Nat. Med. 12 :1198-202(2006))。在两项研宄中，对配体TO-Ll的阻断都显著增加了 HIV特 异性产IFNy细胞的体外增殖。
[0016] 其它研宄还涉及ro-i途径在控制病毒感染中的重要性。ro-i敲除小鼠表现出比 野生型小鼠更好地控制腺病毒感染（Iwai等，J. Exp. Med. 198 :39-50 (2003))。同样，将HBV 特异性T细胞过继性转移到HBV转基因动物中会引发肝炎（Isogawa M.等，Immunity 23 : 53-63(2005))。这些动物的疾病状态因肝中的抗原识别和肝细胞增量调节Η)-1而游移不 定。
【发明内容】
[0017] 本发明提供结合人和犬ro-i的分离的抗体及抗体片段。在一些实施方案中，所述 抗体或抗体片段阻断人ro-Li和人ro-L2与人ro-i的结合。在一些实施方案中，本发明 ro-l抗体或抗体片段包括选自以下的一个或多个⑶R(抗体互补决定区）：SEQ ID N0:9、 10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19和20 ;在另外的实施方案中，包括以下一个或多个重链 CDR:SEQIDN0:12、13、14、18、19和20和/或以下一个或多个轻链CDR :SEQIDN0:9、10、 11、 15、16和17。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段为嵌合抗体、人抗体、人源化抗体 或它们的片段。
[0018] 在一个实施方案中，本发明提供结合人ro-ι的分离的抗体或抗体片段，其包含： 包含⑶R SEQ ID NO :9、10和11或任何所述序列变体的轻链；和/或包含⑶R SEQ ID NO: 12、 13和14或任何所述序列变体的重链。
[0019] 在另一个实施方案中，本发明提供结合人ro-ι的分离的抗体或抗体片段，其包 含：包含⑶R SEQ ID NO: 15、16和17或任何所述序列变体的轻链；和/或包含⑶R SEQ ID NO : 18、19和20或任何所述序列变体的重链。
[0020] 在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：重链可变区SEQ ID NO :5或其变体；和/或包含SEQ ID NO :6或其变体的轻链可变区。
[0021] 在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：重链可变区SEQ ID NO :7或其变体；和/或包含SEQ ID NO :8或其变体的轻链可变区。
[0022] 在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO :30 的20-139位氨基酸残基或其变体的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO :32的20-130位氨 基酸残基或其变体的轻链可变区。
[0023] 在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO :30 的20-139位氨基酸残基或其变体的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO :33的20-130位氨 基酸残基或其变体的轻链可变区。
[0024] 在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO :30 的20-139位氨基酸残基或其变体的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO :34的20-130位氨 基酸残基或其变体的轻链可变区。
[0025] 在一个实施方案中，本发明包括抗体或抗原结合片段，其包含：包含具有与SEQ ID NO :30的20-139位氨基酸残基至少90%同源性的氨基酸序列的重链可变区；和/或包含具 有与SEQ ID NO :32、33、34的20-130位氨基酸残基至少90%同源性的氨基酸序列的轻链 可变区。
[0026] 在一个实施方案中，本发明提供结合人ro-i的分离的抗体或抗体片段，其包含： 包含SEQ ID NO :31的20-466位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO :36的 20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。
[0027] 在一个实施方案中，本发明提供结合人ro-i的分离的抗体或抗体片段，其包含： 包含SEQ ID NO :31的20-466位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO :37的 20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。
[0028] 在一个实施方案中，本发明提供结合人ro-i的分离的抗体或抗体片段，其包含： 包含SEQ ID NO :31的20-466位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO :38的 20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。
[0029] 在一个实施方案中，本发明提供结合人ro-i的分离的抗体或抗体片段，其包含： 包含SEQ ID NO :35的20-469位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO :36的 20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。
[0030] 在一个实施方案中，本发明提供结合人ro-i的分离的抗体或抗体片段，其包含： 包含SEQ ID NO :35的20-469位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO :37的 20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。
[0031] 在一个实施方案中，本发明提供结合人ro-ι的分离的抗体或抗体片段，其包含： 包含SEQ ID NO :35的20-469位氨基酸残基或其变体的重链；和/或包含SEQ ID NO :38的 20-237位氨基酸残基或其变体的轻链。
[0032] 在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段的变体可包含一个、两个或三个 保守修饰的氨基酸取代。
[0033] 在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可包含：人重链恒定区或其变体， 其中所述变体包含至多20个保守修饰的氨基酸取代；和/或人轻链恒定区或其变体，其中 所述变体包含至多20个保守修饰的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多 10个保守修饰的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多5个保守修饰的氨 基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多3个保守修饰的氨基酸取代。在上述 任何实施方案中，人重链恒定区或其变体可为IgGl或IgG4同种型。
[0034] 在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可以以约IOOpM或更低的Kd结合 人ro-i。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约3〇pM或更低的K d结合人ro-i。 在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以与下述抗体接近相同的Kd结合人ro-i:所述 抗体具有包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO :32氨基酸序列的轻链。 在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以与下述抗体接近相同的Kd结合人ro-i:所述 抗体具有包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO :33氨基酸序列的轻链。
[0035] 在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可以以约7. 5xl05l/M*s或更快的 结合人ro-i。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约lx IO6VM · s或更快的k 结合结合人I3D-I。
[0036] 在上述任何实施方案中，抗体或抗体片段可以以约2xl(T5l/s或更慢的1% S结合 人Η)-1。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约2. 7xl0_5l/s或更慢的结合人 ro-i。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以以约3xi(T5i/s或更慢的i%s结合人ro-i。
[0037] 可用任何有效的方法测量KD. 1?^和1%胃值。在优选的实施方案中，用生物发光干 涉测量法（例如，实施例2中所述的ForteBio Octet法）来测量解离常数。在其它优选的 实施方案中，可用表面等离子共振技术（例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。
[0038] 此外，在上述任何实施方案中，本发明抗体或抗体片段可以以约InM或更低的IC5tl 阻断人ro-Li或人ro-L2与人ro-i的结合。可用本领域任何已知的方法测量配体结合的 阻断情况并计算IC5tl，例如下文实施例中所述的FACS或FMT法。
[0039] 本发明还包括与上述任何抗体竞争人ro-i上的结合表位的抗体或抗体片段，所 述抗体或抗体片段以约InM或更低的IC 5tl阻断人ro-Ll或人ro-L2与人ro-i的结合。
[0040] 本发明还包括与上述任何抗体竞争人ro-i上的结合表位的抗体或抗体片段，所 述抗体或抗体片段以约IOOpM或更低的K d结合人ro-i。在一个实施方案中，抗体或抗体片 段以约30pM或更低的Kd结合人ro-i。
[0041]