h) (Vh-'或V^Vh)。通过使用短至 不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配 对并形成两个抗原结合位点。双抗体更全面地阐述于例如EP 404, 097 ;W0 93/11161;和 HolIiger 等（I"3) Proc. Natl. Acad. Sci. USA9O :6444-6448 中。
[0126] "结构域抗体片段"是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免 疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个％区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体 片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
[0127] 本发明抗体片段可包含足以使重链二聚体化（或多聚体化）的恒定区部分，所述 重链具有降低的二硫键合的能力，例如，如本文所述改变了通常参与重链间二硫键的铰链 半胱氨酸中的至少一个。在另一个实施方案中，抗体片段（例如包含Fc区的抗体片段） 保留了当以完整抗体存在时通常与Fc区有关的生物学功能中的至少一种，这些功能例如 FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和/或补体结合（例如抗体具有对ADCC功能或补体 结合必不可少的糖基化特征）。
[0128] 术语"嵌合"抗体指这样的抗体以及表现出所需生物学活性的所述抗体的片段：其 中部分重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体相应的序列 等同或同源，同时所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体 相应的序列等同或同源（参见例如美国专利第4, 816, 567号和Morrison等，1984、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855)。
[0129] 非人类（例如鼠）抗体的"人源化"形式为含有最小限度的来源于非人类免疫球 蛋白序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白（受体抗体），其中受体抗体的 高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种（供体抗体）高变区的残基置 换，非人类物种例如有小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv 构架区（FR)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体或供体 抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体包含至少 一个且通常为两个可变结构域的几乎全部，其中全部或几乎全部超变环对应于非人类免疫 球蛋白的超变环，全部或几乎全部FR区为人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选 包含至少部分免疫球蛋白（通常为人免疫球蛋白）恒定区（Fe)。更详细的资料参见Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature 332 :323-329(1988);和 Presta， Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992) 〇
[0130] 本文所用术语"超变区"是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。超变区包含以下 氨基酸残基：来自序列比对所界定的"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基，例如，轻链可 变结构域的24-34 (LI)、50-56(L2)和89-97 (L3)位残基和重链可变结构域的31-35 (Hl)、 50_65(H2)和 95_102(H3)位残基，参见 Kabat 等，1991，Sequences of proteins of Immunological Interest(免疫目的物的蛋白质序列），第 5版，Public Health Service， NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.;和/或来自根据结构来界定的"超变 环"（HVL)的残基，例如，轻链可变结构域的26-32 (LI)、50-52(L2)和91-96 (L3)位残基和 重链可变结构域的26-32 (HI)、53-55 (H2)和96-101 (H3)位残基，参见Chothia和Leskl， 1987, J. Mol. Biol. 196 :901-917。"构架"残基或"FR"残基为除本文定义的超变区残基之 外的可变结构域残基。
[0131] "人抗体"为其氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体，和/或业 已用任何用于制备本文所示的人抗体的技术制备的抗体。该定义明确排除了包含非人类抗 原结合残基的人源化抗体。
[0132] "分离的"抗体为业已被鉴定并分离和/或回收自其天然环境组分的抗体。其天 然环境的污染组分是会干扰所述抗体的诊断性或治疗性应用的物质，可包括酶、激素和其 它蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将所述抗体纯化到以下程度：（1)超过 95%重量的抗体，最优选超过99%重量，其由Lowry法测定；（2)足以通过用旋杯式测序仪 获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或（3)通过在还原或非还原条件 下用考马斯蓝或优选银染色的SDS-PAGE确定为同质。分离的抗体包括在重组细胞内的原 位的抗体，因为抗体自然环境中的至少一种组分将不存在。然而，分离的抗体通常由至少一 个纯化步骤制备。
[0133] "分离的"核酸分子为被鉴定并与至少一种污染性核酸分子（通常在抗体核酸的天 然来源中与其缔合）分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境。 因此，分离的核酸分子与在其天然细胞中存在的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包 括在如常表达抗体的细胞中所含的核酸分子，例如，所述核酸分子所处的染色体位置不同 于天然细胞的染色体位置。
[0134] 本文所用术语"单克隆抗体"是指从基本上同种抗体群中获得的抗体，即除了可能 少量存在的可能的天然突变体外，构成所述群的各个抗体是一致的。单克隆抗体具有高度 特异性，可针对单个的抗原位点。此外，与通常包括针对多个不同的决定簇（表位）的多 种不同抗体的常规（多克隆）抗体制备物相反，每种单克隆抗体仅针对抗原上的单个决定 簇。修饰语"单克隆"表示从基本上同种抗体群获得的抗体的特性，不能理解为需要通过任 何特定方法来制备所述抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过由Kohler等（1975， Nature 256:495)首先阐述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法（参见例如美国 专利第4, 816, 567号）制备。"单克隆抗体"还可用例如Clackson等（1991，Nature352 : 624-628)和Marks等（1991，J. Mol. Biol. 222 :581-597)所述技术分离自噬菌体抗体文库。 本文单克隆抗体明确包括"嵌合"抗体。
[0135] 本文所用术语"免疫细胞"包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免 疫细胞包括：淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨 噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
[0136] 本文所用"免疫缀合物"是指与治疗性部分缀合的抗ro-i抗体或其片段，所述治 疗性部分例如有细菌毒素、胞毒药物或放射性毒素。可用本领域的有效方法使毒性部分与 本发明抗体缀合。
[0137] 本文使用以下核酸双关码：R = A或G ;Y = C或T ;M = A或C ;K = G或T ;S = G 或C ;和W = A或T。
[0138] 本文所用序列"变体"是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留 所得到的分子的生物学活性的序列。
[0139] "保守修饰的变体"或"保守的氨基酸取代"是指本领域技术人员已知的氨基酸 取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员 公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性（参见例如Watson等， Molecular Biology of the Gene(基因的分子生物学），The Benjamin/Cummings Pub. Co.， 第224页（第四版，1987))。这样的例示性取代优选依照以下所示的取代来进行：
[0140] 例示性保守氨基酸取代
[0141]
[0142] 本文所用的两个序列之间的"％同一性"是指所述序列共有的等同位置的数目 的函数（即％同源性=等同位置数/总位置数X 100)，其中会考虑到空位数目及各空位 长度，所述空位需要在进行两个序列最佳比对时引入。序列比较和两个序列之间％同一 性的确定可用数学算法来完成。例如，两个氨基酸序列之间的％同一性可用E.Meyers 和W. Miller (Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17(1988))的算法来确定，该算法业已被引入 到ALIGN程序（2.0版）中，其使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12,空位罚分 为4。另外，两个氨基酸序列之间的％同一性可用Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 : 444-453(1970))算法来确定，该算法已被引入到GCG软件包的GAP程序（可在www. gcg. com中得到）中，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或 4,长度权重为1、2、3、4、5或6。
[0143] 本文所用术语"约"是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受 误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定（即测量体系的限度）。例如，在本领域 每一次实行中"约"可意味着在1内或超过1的标准差。或者，"约"或"基本上包含"可意 味着至多20%的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数 量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，"约" 或"基本上包含"的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
[0144] 当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，"特异性"结合是指在蛋白和/或 其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如ro-i的结合反应。因此，在所指定 的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的 其它蛋白结合。
[0145] 当用"给予"和"治疗"提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指 将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接 触。"给予"和"治疗"可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研宄方法和实验方法。治 疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。"给予" 和"治疗"还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和 离体治疗。
[0146] "有效量"包括足以改善或防止医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以 使得可以诊断或促进诊断的量。对具体受治疗者的有效量可视多种因素而变化，例如待治 疗的疾病、患者的整体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重性。有效量可为避 免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。作用效果将导致提高诊断措施或参数 的至少5%、通常至少10%、更通常至少20%、最通常至少30%、优选至少40%、更优选至 少50%、最优选至少60%、理想地至少70%、更理想地至少80%和最理想地至少90%，其 中100%界定为正常受治疗者所显示的诊断参数（参见例如Maynard等（1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice (良好临床实践的 SOP 手册），Interpharm Press， Bocaraton，FL ;Dent(2〇01)Good Laboratory and Good Clinical Practice(良好实验室 实践和良好临床实践），Urch Publ.，London，UK) 〇
[0147] 单克隆抗体
[0148] 可根据本领域知识和技能来制备针对ro-i的单克隆抗体，制备时用ro-i抗原注 射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
[0149] 用常规方法（例如通过用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因 的寡核苷酸探针）便可容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测定其序列。杂交瘤细胞用作 所述DNA的优选来源。所述DNA -经分离便可将其置于表达载体中，然后将该载体转染到 宿主细胞中以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成，所述宿主细胞例如有大肠杆菌细 胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵（CHO)细胞或不会另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。抗体的 重组制备将在下文更详细地阐述。
[0150] 在另外的实施方案中，抗体或抗体片段可分离自用McCafferty等（1990，Nature， 348 :552-554)所述技术制备的抗体噬菌体文库。Clackson等（1991 ,Nature，352 :624-628) 和Marks等（1991，J. Mol. Biol. 222 :581-597)阐述了用噬菌体文库分别分离鼠和人抗 体。后来的出版物阐述了通过链改组（Marks等，1992，Bio/Technology，10 :779-783)以及 作为构建极大噬菌体文库策略的组合感染和体内重组（Waterhouse等，1993, Nuc. Acids. Res. 21 :2265-2266)来制备高亲和力（nM范围）的人抗体。因此，这些技术是对于用于分 离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的备选。
[0151] 嵌合抗体
[0152] 还可对抗体DNA进行修饰，例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代 同源性鼠序列（美国专利第 4, 816, 567 号；Morrison 等，1984，Proc. Natl Acad. Sci. USA， 81 :6851)，或通过使编码免疫球蛋白的序列与编码非免疫球蛋白物质（例如蛋白质结构 域）的全部或部分序列共价连接。通常用所述非免疫球蛋白物质取代抗体的恒定结构域， 或被取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生二价嵌合抗体，所述二价嵌合抗 体包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同的抗原具有特异性的另一抗原结 合位点。
[0153] 人源化抗体和人抗体
[0154] 人源化抗体具有一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。非人类氨基酸残基通 常被称为"输入（import) "残基，并通常取自"输入"可变结构域。通常可根据Winter及 其合作者的方法（Jones 等，1986, Nature321 :522-525 ;Riechmann 等，1988, Nature，332 : 323-327 ;Verhoeyen 等，1988, Science 239 :1534-1536)，通过用啮齿类动物 CDR 或 CDR 序 列取代人抗体的相应序列来实施人源化。因此，所述"人源化"抗体为嵌合抗体（美国专利 第4, 816, 567号），其中极小部分的完整人可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代。 实际上，人源化抗体通常为其中某些⑶R残基和可能的某些FR残基被来自非人类（例如啮 齿类动物）抗体的类似位点的残基取代的人抗体。
[0155] 挑选用于制备人源化抗体的人可变结构域（轻链和重链二者）对于降低抗原性极 为重要。根据所谓的"最佳拟合（best fit)"方法，根据已知的人可变结构域序列的完整 文库来筛选啮齿类动物抗体的可变结构域序列。然后使最接近啮齿类动物序列的人序列作 为用于人源化抗体的人构架（FR) (Sims 等，1987, J. Immunol. 151 :2296 ;Chothia 等，1987， J. Mol. Biol. 196 :901)。另一方法则利用来源于轻链或重链的特定亚群的所有人抗体共同 序列的特定构架。相同的构架可用于若干不同的人源化抗体（Carter等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :4285 ;Presta 等，1993, J. Tmmnol. 151 :2623)。
[0156] 更重要的是对抗体进行人源化，使其保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学 性质。为了达到这一目的，根据优选的方法，通过用母体和人源化序列的三维模型分析母体 序列及各种概念上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般是可 利用的，并为本领域技术人员所熟悉。可利用阐明并显示所挑选的候选免疫球蛋白序列的 可能的三维构象结构的计算机程序。对这些显示结构的检查使得可以分析残基在候选免疫 球蛋白序列功能中所起的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的 残基。以此方式，可从受体和输入序列选择并联合FR残基，以便获得所需的抗体特性，例如 对一种或多种靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接并最充分地参与影响抗原结 合。
[0157] 对抗体的人源化是简单的蛋白质工程工作。几乎所有鼠抗体都可通过CDR嫁接来 人源化，从而保持抗原结合性。参见Lo, Benny，K.C.编者，载于Antibody Engineering: Methods and Protocols (抗体工程：方法和方案），第 248 卷，Humana Press，New Jersey， 2004〇
[0158] 或者，现在还可能产生在免疫后在不产生内源性免疫球蛋白下能够产生完整人 抗体库的转基因动物（例如小鼠）。例如，业已阐明在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连 接区（JH)基因的纯合缺失完全抑制了内源性抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列 转移到所述种系突变小鼠中将导致在遇到抗原攻击时产生人抗体。参见例如Jakobovits 等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551 ;Jakobovits 等，1993，Nature362 :255-258 ; Bruggermann等，1993，Year in Immunology 7:33;和Duchosal 等，1992，Nature 355:258。 人抗体还可来源于·菌体展示文库（Hoogenboom等，1991，J. Mol. Biol. 227 :381 ;Marks等， J. Mol. Biol. 1991，222 :581-597 ;Vaughan 等，1996, Nature Biotech 14:309)。
[0159] 抗体纯化
[0160] 当使用重组技术时，抗体可产生在细胞内、周质空间或直接分泌到培养基中。若 抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片（宿主细胞或裂解 的片段）。Carter等（1992, Bio/Technology 10:163-167)阐述用于分离分泌到大肠杆菌 (E. coli)周质空间的抗体的方法。简言之，在乙酸钠 （pH 3. 5)、