-i有97%的同一 性。除了来自食蟹猴的ro-Ι外，在实施例3所述的SEB刺激的血细胞培养物中hPD-1. 08A 和hPD-1. 09A也起到阻断恒河猴（rhesus macaques)PD-I的作用。在所用的任何测定中没 有一种测试抗体能以可检测的亲和力结合小鼠 ro-Ι。
[0236] 综上所述，纯化并表征了 5种抗F1D-I单克隆抗体，所述抗体接受过基于其调节 Jurkat功能的能力的分离。这些抗体与ro-Ι紧密结合（解离常数在20pM-3nM的范围内） 并能够以不同的IC5tl值阻断与H)-L1和TO-L2二者的相互作用。这些抗hPD-lmAb中有4 种比最好的市售抗I 3D-ImAb还要好很多。当加入到溶液中时，每种抗体都起受体拮抗剂作 用，最终增强了 T细胞应答（参见实施例3)。
[0237] 实施例3 :对抗ro-Ι抗体的功能概况分析
[0238] hPD-1. 08A和hPD-1. 09A增强了人T细胞对SEB的应答
[0239] 用来自健康志愿者的血细胞在体外测试了抗ro-i抗体提高T细胞活性的能力。一 个测定用于表征用葡萄球菌肠毒素 B(SEB)阻断人ro-Ι受体以动员和激活所有表达νβ 3 和V β 8T细胞受体链的T细胞的功能结果。获取健康人供者血液，以I : 10稀释到培养基 中。将稀释的全血铺板（150 μ 1每孔）到96-孔圆底板中，用mAb (用各种浓度）预孵育 30-60分钟。然后以lOng/mL-lOyg/mL的不同浓度范围加入SEB。在培养2-4天后收集 上清液，用ELISA (实施例1中所述）或用标准多重技术（Luminex平台-Biosource细胞因 子检测试剂盒）定量测量所产生的IL-2的量。从100ng/mL到高达10 μ g/mL的SEB滴定 显著刺激全血细胞的IL-2产生。通常在用1 μ g/mL SEB刺激后2-4天，可由ELISA检测到 100-1000pg/mL IL-2,视供者而定。hPD-1.08A 和 hPD-1.09A 的加入提高了 IL-2 产生，在 最高测试抗体浓度（25 μ g/mL)下平均高于对照小鼠 IgGl的2-4倍。在对一组独立的健康 志愿者实施的实验中对刺激指数取平均值（图4)。这些实验证明hPD-1. 08A和hPD-1. 09A 二者都在SEB刺激稀释的全血细胞下提高IL-2的产生。在SEB刺激全血细胞后ro-1和 ro-Li (但ro-L2不是）表达水平随时间上调（由流式细胞术定量测定）。抗ro-Li单克 隆抗体（克隆 MIH5, Ebiosciences 编号 16-5982)和抗 CTLA-4(克隆 14D3, eBiosciences 编号16-1529)也在类似条件下诱导IL-2产生的增加，这一发现进一步证实可采用SEB刺 激测定法以在操纵共同刺激途径后定量测定τ细胞活性（图4)。发现由抗ro-i抗体提高 的IL-2产生具有剂量依赖性。除IL-2外，通过Luminex技术还发现TNFa、IL-17、IL-7、 IL-6和IFNy水平受到hPD-1. 08A和hPD-1. 09A显著调节。这些实验结果表明hPD-1. 08A 和hPD-1. 09可用于刺激人T细胞应答。
[0240] 用来源于癌症患者的血细胞在体外进一步测试抗ro-Ι抗体hPD-1. 09A提高T细 胞活性的能力。按照上述方案测试来自晚期黑素瘤（1名患者）或前列腺癌（3名患者）的 患者的血液。在表1II中，细胞因子的定量结果表示为：当细胞在25ug/mL hro-1.09A存在 下受刺激时所产生的细胞因子相对于在缺乏抗体下SEB刺激所产生的细胞因子的倍数增 加。总的来说，结果发现对于4名患者中的每一位，hro-1. 09A使SEB诱导的IL-2产生提 高2-3. 5倍。同样地，提高了 TNFa、IL-17和IFNy的产生，而IL-5和IL-13的产生则降 低。这些实验表明hro-1. 09A有能力在癌症患者中刺激T细胞应答。此外，这些实验提示 了对Thl应答的偏爱性。
[0241] 表1II :在hPD-1. 09A存在下SEB刺激的细胞因子产生
[0243] hro-1. 08A和hPD-1. 09A提高人回忆T细胞对TT攻击的应答
[0244] 在用于分析抗人ro-i抗体阻断受体与其天然配体相互作用的功能效果的概况的 另一测定中，使用了破伤风类毒素（TT)抗原来刺激在健康供者血液中预先存在的记忆T细 胞。为该目的，将新鲜制备的PBMC(2xl0 5个细胞）铺板到含RPMI 1640完全培养基（含 有5%热灭活的人血清）的96孔圆底板中，与各种浓度的测试抗体预孵育，用100ng/mL浓 度的TT(Astarte Biologies)刺激。在收获上清液后，让细胞在37°C、5%C02下孵育3-7 天。通过ELISA(来自eBioscience的IL-2和IFN-γ yELISA检测抗体对组）和多重分析 (Luminex平台-Biosource细胞因子检测试剂盒）测定细胞因子浓度。与单独的抗原相比， 对Η)-1的阻断提高了细胞增殖并显著提高细胞因子（包括IFNy和IL-2)的产生（图5)。 Luminex分析显示在Η)-1阻断时提高了细胞因子GM-CSF、RANTES和IL-6的产生。
[0245] 对福尔马林固定石蜡包埋的人细胞中的人ro-i的染色
[0246] 由于由流式细胞术证明了经SEB刺激的血细胞提高Η)-1表达，因而将这些细胞用 于判定hPD-1. 09A是否能检测用于组织学应用的福尔马林固定石蜡包埋组织中的Η)-1。用 0. 1 μ g/mL SEB刺激人供者外周血单核细胞3天，随后收集非贴壁细胞（主要是淋巴细胞）， 用PBS洗涤2次并离心（IlOOrpm 5分钟）。在4%甲醛中让细胞固定10分钟，将细胞沉淀 包埋在琼脂糖中，在乙醇（依次为70%、80%、96%和100% )和二甲苯中脱水，此后在石蜡 中包埋。将切片（4ym)固定到载玻片上并进行水合（二甲苯、100%、96%、80%、70%的乙 醇、PBS缓冲液），随后用标准方法在热柠檬酸盐缓冲液中实施抗原提取。用包含0. 3% H2O2 的100%甲醇阻断过氧化物酶活性，用水和PBS、Tween 0. 1%漂洗载玻片。在室温下让切片 与hPD-1. 09A孵育1. 5小时，用PBS-Tween漂洗，接着使用标准检测方法。在室温下用苏木 精复染载玻片30秒，用二甲苯脱水，固定用于显微镜检查。这些实验显示，与未刺激的PBMC 培养物相反的是，使用hPD-1. 09A致使来源于SEB刺激的PBMC培养物的淋巴细胞被强烈染 色（与同型对照相比），这表明hro-1. 09A可用作诊断试剂。
[0247] 实施例4 :抗ro-Ι抗体序列和随后的人源化
[0248] 克隆免疫球蛋白cDNA
[0249] 用基于简并引物PCR的方法，测定编码由杂交瘤hPD-1. 08A和hPD-1. 09A表达的 小鼠抗体可变区的DNA序列。简言之，用iScript Select cDNA合成试剂盒（Biorad编号 1708896)按厂商用法说明制备重链和轻链的基因特异性cDNA。所用PCR引物基于Ig-引 物组（Novagen编号69831-3)。用Taq聚合酶按照Novagen引物组方案实施简并PCR反应。 由琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。重链和轻链二者的可变区扩增子的预期大小约为500 个碱基对。根据厂商指导将反应所得的条带大小合适的2 μ 1的Taq扩增PCR产物克隆到 pCR4T0P0载体（Invitrogen编号Κ4595-40)中，并转化到DH5_a大肠杆菌中。通过用通用 的M13正向和反向引物的菌落PCR筛选克隆，从每个反应选择2-3个克隆用于DNA测序分 析。
[0250] 用通用引物M13正向、M13反向、T3和T7在两个方向上对克隆进行测序。用Seqman 分析用于每个克隆的每个测序反应结果。用NCBI Ig-Blast(http ://www.ncbi.nlm.nih. gov/projects/igblast/)在种系和重排Ig可变区序列数据库中搜索共有序列。hPD-1. 08A 的Blast结果确定了无终止密码子引入的产生性（框内）重排重链。确定了编码两个不同 序列的轻链克隆；一个是无终止密码子引入的产生性（框内）重排轻链，另一个是非产生性 重排序列，其含有导致终止密码子在FR4区内的移码。所观察到的非产生性无效转录物很 可能来源于骨髓瘤融合配偶体（Carroll W. L.等，Mol. Immunol. 25 :991-995(1988)，将其 排除在外。
[0251] hro-1. 09A的Blast结果确定了无终止密码引入的产生性（框内）重排的重链和 轻链。通过质谱法确证所表达蛋白的氨基酸序列。序列在所附序列表中公开并在表1V中 列出。
[0252] 表1V :本发明鼠抗人ro-1抗体的序列ID号
[0253]
[0255] CDR 和构架区按照如下文献注释：Kabat Ε· Α·等，1991，Sequences of proteins of Immunological interest(免疫目的物的蛋白质序列），In :NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services，Bethesda，MD〇
[0256] 构建和表达嵌合cl09A抗体
[0257] 通过将PCR克隆的小鼠 hipD-1. 09A VL和VH区cDNA分别与人κ和IgGl恒定区 连接，来构建嵌合轻链和重链。用PCR引物修饰小鼠 cDNA序列的5'和3'端，所述引物设 计成为各链增加合适的前导序列，并增加使得能克隆到现有重组抗体表达载体上的限制性 位点。
[0258] 用10 μ g各种嵌合重链和轻链表达质粒电穿孔C0S-7细胞（0. 7mL，IOVmL)。然后 在8mL生长培养基中培养这些细胞3天。用夹心ELISA测量来自C0S-7转染上清液的抗体 浓度。这显示在3次单独转染中转染的COS-7细胞分泌约295ng/mL的嵌合IgG1- κ抗体。
[0259] 用Η)-1结合ELISA和CELISA (参见实施例2)测量由经转染的C0S-7细胞产生的 嵌合抗体的结合情况，结果显示所述嵌合抗体以比得上鼠抗体的亲和力结合ro-i。
[0260] 人源化抗体设计
[0261] 用^1?移植技术（参见例如美国专利第5,225,539号）通过1?(：1'化&111131^(^6 UK)使hPD-1. 09A抗体人源化。简言之，将鼠抗体hPD-1. 09A的可变链序列与结构生物信 息学合作研宄协会（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics，RCSB) 蛋白质数据库中的可用序列比较。基于最接近的VH和VK结构生成hPD-1. 09A同源性模 型。鉴定并分析了与hPD-1. 09A具有最高同一性的人序列。（Foote和Winter，J.Mol. Biol. 224 :487-499 (1992) ;Morea V.等，Methods20 :267-279 (2000) ;Chothia C.等， J. Mol. Biol. 186 :651-663(1985).)确定了最合适在其上构建CDR移植重链和轻链的人构 架。
[0262] 对于重链，由基因库登记号AB063829编码的构架确定为最合适。对hPD-1. 09A VK 序列的分析显示在任何人VK中都未发现其CDRl长度（15个残基）。为了这一原因，分析了 3种不同⑶Rl长度（11、16和17个残基）的构架，以测试哪种⑶Rl长度可重现hPD-1. 09A VK的性能。鉴定了在所选的对结构重要的残基处与hPD-1. 09A VK具有最高同一性并具 有11、16和17个残基的⑶Rl长度的人VK序列。选定基因库登记号M29469的构架作为 K109A-L-11的基础。选定来自基因库登记号AB064135的构架作为K109A-L-16的基础和来 自基因库登记号X72431的构架作为K109A-L-17的基础。
[0263] 实施直接移植以产生各链的表达构建体。109A-H、K09A-L-11、K09A-L-16和 K09A-L-17的DNA和蛋白质序列公开于所附的序列表（表1V)中。
[0264] 产生了具有稳定阿代尔（Adair)突变（Angal S.等，Mol. Immuol. 30 : 105-108(1993))的IgG4形式的人源化hl09A抗体，其中241位丝氨酸（Kabat编号系统） 转换为脯氨酸。该序列公开在SEQ ID NO :23和31中。
[0265] 实施例5 :人源化抗F1D-I抗体的结合特性和功能性质
[0266] 制备和纯化
[0267] 通过瞬时转染CHO-S细胞制备人源化抗体h409All、h409A16和h409A17。细胞在 摇瓶中于⑶-CHO(Gibco)和C5467培养基（Sigma)中生长8天。通过蛋白A色谱，洗绦，用 IM乙酸洗脱并用3M Tris中和，来纯化来自细胞上清液的抗体。最后，将缓冲液换成业已用 IM Tris碱调整到pH 5. 5的IOOmM乙酸。
[0268] 结合和动力学分析
[0269] 如实施例2所述实施基于蛋白质和基于细胞的ELISA以测定表观结合亲和力（表 示为EC 5tl值）。各种人源化抗ro-i抗体以比得上鼠母体抗体的EC 5Q值与ro-1/Fc和细胞 表达的ro-i结合（表V)。
[0270] 还用实施例2所述的生物发光干涉测量法实施抗体的动力学结合特性（图6)。两 种人源化抗体h409All和h409A16比使用该测定法所测试的任何其它mAb都结合得更紧 密，且所测定的h409All和h409A16的心分别为29和27pM (表V)。与所测的其它抗Η)-1抗 体相比，亲和力增加主要是由于解离率减慢。结果证明，与鼠母体抗体相似，人源化抗ro-i 抗体h409All、h409A16以测定为低于120pM的Kd与食蟹猴ro-1结合。
[0271] 配体阻断
[0272] 如实施例2所述，用同类竞争测定法测量和用FMT竞争测定法检测人源化抗体阻 断ro-Li和ro-L2与ro-i结合的能力。
[0273] hro-Ll/Fc和hPD_L2/Fc二者与CHO-hro-Ι细胞的结合都可被所测试的任何人源 化抗体以剂量依赖方式完全抑制。计算的IC 5tl数据概述于表V中。与鼠母体抗体hPD-1. 09A 相似，人源化mAb :h409All、h409A16和h409A17中的每一种都以低于InM的IC5tl值抑制与 PD-Ll和TO-L2结合。结果证明，与鼠母体抗体相似，人源化抗Η)-1抗体h409All、h409A16 和h409A17能抑制配体与食蟹猴ro-1的结合，且计算的IC 5tl值低于约InM。
[0274] 表V :本发明人源化抗hro-1抗体的结合特性
[0276] 人源化mAb增强人T细胞对SEB的应答
[0277] 如实施例3所述，用来自健康志愿者的血细胞在体外测试人源化抗ro-Ι抗体增强 T细胞活性的能力。培养4天后收集上清液，用ELISA定量测定所产生的IL-2的量。人源 化ro-i抗体表现出提高由SEB刺激的il-2产生的能力（图7)。另外，人源化ro-i抗体在 癌症患者血液中提高SEB诱导的IL-2产生，与实施例3中所述的结果相似。
[0278] 综上所述，人源化mAb h409All、h409A16和h409A17在人源化过程中保留所有功 能活性。h409All和h409A16mAb在人源化后完全保留了小鼠母体抗体hPD109A的亲和力。
【主权项】
1. 结合人程序性死亡受体-I (PD-I)的分离的抗体或抗体片段，包含SEQ ID NOs:9、10 和11的轻链⑶Rs以及SEQ ID N0s:12、13和14的重链⑶Rs ;其中所述抗体片段选自Fab、 Fab'、Fab' -SH、Fv、scFv、F(ab'）2和双抗体；且其中所述抗体或抗体片段阻断人H)-L1和 人ro-L2与人ro-i的结合。2. 权利要求1的抗体或抗体片段，包含： a. 包含SEQ ID N0:5的重链可变区；和 b. 包含SEQ ID N0:6的轻链可变区。3. 权利要求1或2任一项的抗体，进一步包含：包含y 4或y 1人重链恒定区的重链 恒定区。4. 权利要求1的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段为： a. 嵌合抗体或其片段； b. 人抗体或其片段；或 c. 人源化抗体或其片段。5. 编码权利要求1-4中任一项的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸。6. 权利要求5的分离的多核苷酸，其中抗体包含：包含SEQ ID NO: 5的重链和包含SEQ ID NO:6的轻链。7. 权利要求6的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。8. 包含权利要求5-7中任一项的分离的多核苷酸的表达载体。9. 包含权利要求8的表达载体的分离的宿主细胞。10. 组合物，所述组合物包含与可药用载体或稀释剂组合的权利要求1-4中任一项抗 体或抗体片段。
【专利摘要】本发明涉及针对人程序性死亡受体PD-1的抗体。本发明公开了阻断人程序性死亡受体(hPD-1)与其配体(hPD-L1或hPD-L2)及其可变区序列结合的抗体。还公开了通过PD-1途径增加免疫应答活性(或降低下调)的方法。
【IPC分类】A61P35/00, C12N15/13, A61K39/39, A61P37/04, C07K16/28, A61K39/395, A61P31/00
【公开号】CN104945508
【申请号】CN201510367410
【发明人】G.J.卡文, H.范伊宁纳姆, G.J.杜洛斯
【申请人】默沙东有限责任公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2008年6月13日
【公告号】CA2691357A1, CA2691357C, CA2855098A1, CN102131828A, CN102131828B, EP2170959A1, EP2170959B1, EP2535354A1, US8354509, US8900587, US8952136, US20100266617, US20130108651, US20130109843, US20150232555, WO2008156712A1