足以实行 本发明任何方面（包括其最佳方式），也不能理解为将权利要求的范围限制到其所代表的 特殊例子。实际上，除了本文所展示和阐述的内容之外，本领域技术人员从前述说明中显然 可对本发明进行各种修改，这些修改落入所附的权利要求的范围内。
[0202] 通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，这些实施例不应该理解为限 制本发明范围。本文提及的所有文献和专利引用都明确地通过引用并入本文。
[0203] 实施例
[0204] 实施例1 :免疫接种和选择抗ro-i抗体
[0205] 用hPD-lcDNA免疫小鼠
[0206] 为了产生针对人ro-l( 'hro-Γ)受体的抗体，通过PCR获得编码hPD-Ι受体可读 框的cDNA，并将其亚克隆到载体pcDNA3. I (Invitrogen，Carlsbad，CA)中。接下来，用hPD-1 稳定转染CHO-Kl细胞，用流式细胞术监测表达。分离在其膜上表达人ro-1的CHO-Kl克隆 并命名为CH〇-hroi。
[0207] 通过用Helios基因枪（BioRad)和涂覆DNA的金弹（BioRad)根据制造商用法说 明进行基因枪免疫来免疫接种小鼠。简言之，用2 : I : 1比例的hPD-1 cDNA(克隆到 pcDNA3. 1中）和既定的市售小鼠 Flt3L表达载体及小鼠 GM-CSF(二者都来自Aldevron， Fargo ND)涂覆1 μ m金微粒。用总共1 μ g的质粒DNA来涂覆500 μ g的金弹。
[0208] 具体而言，对7-8周龄的雌性BALB/C小鼠用基因枪在耳上进行免疫接种，在双耳 上接受2、3或4个周期的轰击（参见表1)。一只小鼠在腹腔接受5xl0 6个CH〇-hPDl细 胞的最后加强免疫接种。通过用CH〇-hro-l对比CH0-K1母体细胞的细胞ELISA可检测到 两次DNA免疫接种后的小鼠血清中抗hPD-Ι滴度大约为1 : 1000。在最后免疫接种后4 天，处死小鼠，根据已有的文献所述（Steenbakkers 等，1992, J. Immunol. Meth. 152 :69-77 ; Steenbakkers等，1994, Mol. Biol. R印· 19 :125-134)制备去除红细胞的脾细胞群，冷冻 在-140 °C 中。
[0209] 表1 :用于在Balb/c小鼠中诱导M3D-I特异性抗体滴度的免疫时间表
[0211] 选择产生抗ro-i抗体的B细胞
[0212] 为了挑选产抗人ro-i抗体的B细胞克隆，将来自经hPD-lDNA免疫接种的小鼠（即 小鼠730、731和738)(参见表1)的2xl0 7个去除红细胞的脾细胞合并用于B细胞培养。让 脾细胞在DMEM/HAM氏F12/10%小牛血清（Hyclone，Logan，UT，USA)中于37°C下在塑料培 养瓶中孵育1个小时以除去单核细胞。对非贴壁细胞进行一轮针对CH0-K1细胞的负淘选， 接着进行针对CH〇-hPDl细胞的正淘选。两个挑选程序都对在21cm 2培养皿或T25培养瓶 中的汇合生长的培养物于37°C下进行1小时（细胞培养物在使用前接受总剂量为2000RAD 的辐射）。在正淘选后，通过用补充有0. 132% CaCl2. 2H20和0. 1% MgCl2. 6H20的PBS洗涤 10次来除去未结合的细胞。最后，通过胰蛋白酶处理来收获结合的B细胞。
[0213] 如 Steenbakkers 等（1994, Mol. Biol. R印· 19 :125-134)所述培养所挑选的 B 细胞 并使其永生化。简言之，让所选B细胞与7. 5% (v/v) T细胞上清液及50, 000个经辐射的 (2, 500RAD)EL-4B5 养育细胞（Bursing cell)于终体积为 200 μ L 的 DMEM/HAM 氏 F12/10% 小牛血清中在96-孔平底组织培养板中混合。在第8天，用以下程序通过CHO-hro-Ι细胞 ELISA根据其抗hPD-Ι反应性来对上清液进行筛选。使CHO-Kl和CHO-hPDl细胞在平底 96-孔板中于50 μ L DMEM/HAM氏F12/10% FBS中培养到汇合。接下来，加入50 μ L含有免疫 球蛋白的上清液，在37°C孵育1小时。在用PBS-Tween洗涤3次后，加入100 μ L含（1 : 1000 稀释的）山羊抗小鼠-辣根过氧化物酶（HRP，Southern，Birmingham，AL，USA)的DMEM/HAM 氏 F12/10% FBS，在 37°C孵育 1 小时。用 PBS-Tween 洗涤 3 次后，用 UPO/TMB(Biomerieux， Boxtel，Netherlands)显现固定化的免疫球蛋白。
[0214] 鉴定了来自该B细胞培养物的13份hPD-Ι反应性上清液，其显示当固定化在 塑料上时抑制Jurkat T细胞活化，通过按照以下公开的程序（Steenbakkers等，1992， J. Immunol. Meth. 152 :69-77 ;Steenbakkers 等，1994，Mol. Biol. Rep. 19 :125-134)进行微 电融合，使来自阳性孔的B细胞克隆永生化。具体而言，让B细胞与IO6个NS-I骨髓瘤细胞 混合，通过用DMEM/HAM氏F12洗涤去除血清。接着用链霉蛋白酶溶液处理细胞3分钟，随后 用融合培养基洗涤。通过30秒、2MHz、400V/cm的交变电场，接着10微秒、3kV/cm的方形高 电场脉冲和再次30秒、2MHz、400V/cm的交变电场，在50 μ L融合槽内实施电融合。最后，将 融合槽的内容物转移到杂交瘤选择培养基中，并在有限稀释条件下置于96-孔板上。在融 合后第14天，检查培养物中的杂交瘤生长情况，并筛选是否存在对hPD-Ι的抗体活性。该程 序制得 5 株不同的抗 hPD-Ι 杂交瘤，命名为 hPD-1. 05A、hPD-l. 06B、hPD-l. 08A、hPD-l. 09A 和hPD-1. 13A，通过有限稀释将它们亚克隆以保护其完整性，并进一步培养以产生抗体。从 这些杂交瘤获得的上清液强烈抑制Jurkat E6. 2. 11细胞在受到抗⑶3/抗⑶28刺激时产 生IL-2(参见图1和下文）。
[0215] 通过用标准方法的有限稀释对Jurkat E6. 1细胞（美国典型培养物保藏中心）进 行亚克隆，并测试亚克隆在交联⑶3和⑶28时提高的产IL-2能力。获得高产IL-2的亚 克隆，将其命名为Jurkat E6. 2. 11，并用于进一步测定。用5yg/mL绵羊抗小鼠 Ig(Sheep Anti-Mouse Ig，SAM)在4°C过夜包被Costar 3370 96-孔测定板。去除过量的SAM，用 200 μ L/孔PBS/10 %胎牛血清在室温将板封闭1小时。在用PBS洗涤3次后，用100 μ L/ 孔抗CD3 (0ΚΤ3 ; 10或60ng/mL)在37°C包被1小时。在用PBS洗涤3次后，加入50 μ L/孔 PBS/10%胎牛血清和50 μ L/孔B细胞或杂交瘤上清液，在37°C孵育30分钟。在用PBS洗涤 3次后，加入120 μ L/孔细胞悬浮液（Jurkat E6. 2. 11细胞）（含2xl05个细胞/孔+0. 5 μ g/ mL抗 CD28(Sanquin#M1650,Central Laboratory for Bloodtransfusion, Amsterdam, NL) 的DMEM/F12/10%胎牛血清）。培养6小时后，用来自Pharmingen的抗hIL-2捕获和生物素 化的检测抗体对和链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Southern Biotech)作为检测试剂，用标 准夹心ELISA检查上清液的IL-2生产。为了测定这些抗体与H)-L1相比的功效，大规模制 备一小组mAb。用蛋白G亲和色谱纯化这些mAb (参见实施例2)。如上文所述，将纯化的抗 体hPD-Ll/Fc(重组人B7-H1/FC嵌合体，R&D systems)或作为阴性对照的小鼠 IgGlK (来 自Sigma)以同样的浓度包被含抗⑶3的板。加入Jurkat E6. 2. 11细胞和抗⑶28孵育6 小时，根据上清液中产生的IL-2来测量T细胞活化情况。结果显示两种抗体（hroi. 08A和 hroi. 09A)相对于固定化的ro-Ll/Fc抑制功效高8-10倍。
[0216] 实施例2 :鼠抗ro-i抗体的纯化和表征
[0217] 产生抗ro-Ι的杂交瘤的稳定化和抗PD-I抗体的纯化
[0218] 通过让各株杂交瘤接受多轮（> 4)有限稀释从所述杂交瘤获得克隆细胞群。然 后在无血清条件下用CELLine生物反应器（Integra-biosciences)培养稳定的杂交瘤细胞 6-8天。将15mL含密度为3xl06个细胞/mL的细胞的无血清培养基接种到内室中，并经8天 使其增殖到大约4xl07个细胞/mL。外室加满补充有至多10% BCS(小牛血清）的培养基。 在第6-8天，收获内室培养物，用15mL SF培养基洗涤，用杂交瘤细胞重新接种。合并生物 反应器上的清液和洗涤物，并离心澄清。通过〇.22μΜ滤膜过滤得到的上清液。为了纯化 抗体，将上清液以I : 1稀释在高盐结合缓冲液（1Μ甘氨酸/2Μ NaCl，pH 9.0)中，用蛋白 G HiTrap 5mL 柱（GE healthcare)纯化 mAb。在用 PBS 洗绦后，用 0· IM 甘氨酸（pH = 2. 7) 洗脱已结合的抗体，接着用3M Tris中和pH。最后，用F1D-IO凝胶过滤柱（GE healthcare) 以PBS替换缓冲液，用Ultra-15离心浓缩仪（Amicon)浓缩抗体，并用分光光度法进行定 量。
[0219] 市售抗体
[0220] 在本文所述各种研宄中使用以下市售抗体：抗ro-Ι抗体克隆J116(编号 14-9989)购自 eBioscience。抗 CTLA-4 克隆 14D3(mAb 16-1529)购自 eBioscience。 抗I3D-I克隆192106 (mAb 1086)购自R&D systems (编号mAb 1086)。同种型对照抗体 mlgGl、κ、克隆 M0PC21 购自 Sigma(编号 M9269)。同种型对照 mlgGl κ (mAb 16-4714)和 IgG2aic (mAbl6_4724)购自 eBioscience。
[0221] 结合分析
[0222] 基于蛋白质和基于细胞的ELISA( 'CELISA'）实验用于测定表观结合亲和力 (apparent binding affinity)(报告为EC5tl值）。在某些情况下，比较抗F1D-I抗体的结合 情况与市购抗 F1D-I 抗体 J116(eBiosciences)和 Mabl086(R&D systems)的结合情况。
[0223] 蛋白质ELISA用于测定抗体与人ro-1/Fc的相对结合。通过室温孵育4小时（或 在4°C过夜）将hPD_l/Fc(R&D Systems)固定化在Maxisorp 96-孔板（Nunc)上。通过与 含3% BSA的PBST室温孵育1小时来阻断非特异性结合位点。包被后，用PBST洗涤所述板 3次。用结合缓冲液（含有0. 1% Tween 20和0. 3% BSA的PBS)制备抗Η)-1抗体的稀释 液，将其与固定化的融合蛋白在25°C下孵育1小时。结合后，用PBST洗涤所述板3次，在 25°C下用含稀释至1/4, 000的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG(Southern Biotech)的结 合缓冲液孵育1小时，再次洗涤，用TMB显色。ELISA结果示于图2中。用半最大结合浓度 表示相对结合亲和力的量值（表1I)。
[0224] 还通过CELISA来评估与CH〇-hPD-l细胞的结合情况。对于CELISA，在50 μ L培 养基（01^]?/祖1氏？12/10%?85)中将(：!10-11^)-1细胞培养到80-100%汇合。接着加入 50 μ L含有各种浓度的纯化mAb的培养基，在37°C孵育1小时。在用PBS-Tween洗涤3次 后，加入100 μ 1山羊-抗小鼠-HRP(Southern Biotech，目录编号1030-05)(在培养基中以 1 : 1000稀释），在37°C孵育1小时。在用PBS-Tween再洗涤3次后，用显色过氧化物酶底 物TMB (BD Biosciences)来显现固定化的免疫球蛋白。在微量滴定板读数器中测量因过氧 化物酶活性而增加的吸光度（450nm)。图2显示了浓度和抗体hPD-1. 08A及hPD-1. 09A结 合情况之间的剂量反应相关性。蛋白质和细胞结合研宄的结果概述于表π中。
[0225] 生物发光干涉测量法（ForteBio)的动力学分析
[0226] 为了进一步表征抗体的结合特性，在Octet系统（ForteBio,Menlo Park，CA)上用 生物发光干涉测量法对各种抗体进行概况分析（profile)，以阐明结合动力学并计算平衡 结合常数。通过用标准胺化学试剂让ro-1-Fc融合蛋白（R&D Systems)与胺反应性生物传 感器（Fortebio)偶联来实施该测定。然后观察在各种抗体浓度下抗F1D-ImAb与生物传感器 的结合情况及所述抗体从生物传感器的解离情况。具体而言，通过将胺反应性生物传感器 浸没在含有〇. IM MES pH = 5. 5的孔中5分钟来使其预湿润。然后用0.1 M NHS/0. 4M EDC 混合物激活生物传感器5分钟。通过将生物传感器浸没在12ug/mL PD-1/Fc的0.1 M MES 溶液中7. 5分钟来与ro-1/Fc融合蛋白（R&D systems)偶联。用IM乙醇胺溶液使生物传 感器表面淬灭5分钟。用PBS平衡生物传感器5分钟。通过将生物传感器置于含有各种抗 体浓度（含10_80nM由SDS-PAGE纯化的> 99%的抗体的PBS)的孔中来观察与抗I3D-ImAb 的缔合情况，并监测干涉测量30分钟。在将生物传感器转移到PBS后测量解离，并监测干 涉测量信号60分钟。用包含所有测试浓度的I : 1的结合球形拟合模型（binding global fit model)拟合所观察到的结合和解离率（I^bJPkd),计算平衡结合常数KD。动力学研宄 结果显示于以下表1I和图6中。
[0227] 表1I :鼠抗I3D-ImAb的生物化学表征概述
[0229] 两种克隆抗体hPD-1. 08A和hPD-1. 09A比使用该测定所测试的任何其它mAb都结 合得更紧密，且对于hPD-1. 08A和hPD-1. 09A所测定的心分别为24和22pM。与测试的其 它抗I3D-I抗体相比，亲和力增加是由于所测量的hPD-1. 08A和hPD-1. 09A解离率减慢而结 合率显著加快。
[0230] 配体阻断
[0231] 用流式细胞术研宄对配体结合的阻断。将表达人Η)-1的CHO细胞从贴壁培养瓶 中剥离，并在96-孔板中与各种浓度的抗ro-Ι抗体和恒定浓度^OOng/mL)的未标记的 hro-Ll/Fc或重组人ro-L2/Fc融合蛋白（二者都来自R&D Systems)混合。让混合物在冰 上平衡30分钟，用FACS缓冲液（含有1 % BCS和0. 1 %叠氮钠的PBS)洗涤3次，用FITC 标记的山羊抗人Fe在冰上再孵育15分钟。用FACS缓冲液再次洗涤细胞并用流式细胞术 分析。用Prism(GraphPad软件，San Diego, CA)用非线性回归分析数据并计算IC5tl值。
[0232] 计算得到的IC5tl数据概述于表1I中。测定抗体05A、06B和13A以证明与hPD-Ι结 合的K d在600pM和3nM之间。尽管这些抗体结合紧密，但其各自证明阻断hPD-Ll与hPD-1 结合的IC5Q> 10nM。市售抗ro-1抗体J116(eBiosciences)与PD-Ll的竞争结合性弱，其 计算的IC5tl超出本实验范围（> ιοοηΜ)。对照小鼠 IgGi并不与ro-Li竞争结合ro-i。与 此相反，高亲和力抗体hPD-1. 08A和hPD-1. 09A以低于InM的IC5tl值抑制H)-L1结合，而以 大约1-2ηΜ的IC5tl值阻断PD-L2结合（表1I)。先前的研宄报道PD-L2以相对于PD-Ll高 2-6 倍的高亲和力与 F1D-I 结合（Youngnak P.等，2003, Biochem. Biophys. Res. Commun. 307、 672-677)〇
[0233] 用同类竞争测定法（homogeneous competition assay)确证配体阻断，并用焚光 微量测定技术（fluoremetric microvolume assay technology，FMAT)检测。简言之，从 贴壁培养瓶剥离CH0. hPD-Ι，在96-孔板中与各种浓度的抗ro-Ι抗体和恒定浓度（600ng/ mL)的用焚光染料（AlexaFluor 647, Invitrogen)标记的 hPD-Ll/Fc 或 hPD_L2/Fc 融合蛋 白（二者都来自R&D Systems)混合。让混合物在37°C下平衡90分钟，用AB8200Cellular Detection Analyzer (细胞检测分析仪）（Applied Biosystems，Foster City，CA)读数。用 Prism(GraphPad软件，San Diego, CA)用非线性回归分析数据，计算1(：5(|值。图3显示表 明由抗体浓度测定的配体阻断大小的剂量反应实验结果。hro-Ll/Fc和hPD-L2/Fc二者与 CHO-hro-Ι细胞的结合可受到hPD-1. 08A、hPD-l. 09A和（程度更小的）J116以剂量依赖方 式完全抑制。计算的IC5tl数据概述于表1I中。用流式细胞术确证了所获得的结果，高亲和 力的抗体hPD-L 08A和hPD-L 09A以低于InM的IC5tl值抑制PD-Ll结合。
[0234] 物种间的交叉反应性
[0235] 为了评估物种间抗体的交叉反应性，通过PCR克隆小鼠和食蟹猴（cynomolgus macaque)的ro-Ι受体，并产生稳定转染的CH0-K1细胞。用CELISA测试抗体与食蟹猴受体 的结合情况。发现市售抗体Jl 16、hro-1. 08A和hPD-1. 09A以相等的亲和力与人及食蟹猴 ro-Ι结合，并以与人ro-Ι相似的效率阻断hPD-Ll/Fc和hPD-L2/Fc与食蟹猴ro-Ι结合。 这并不值得稀奇，因为发现食蟹猴ro-Ι的胞外部分的氨基酸序列与人ro