一种新型抗菌肽Hep-W及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物工程技术领域，特别是，涉及一种新型抗菌肽H印-W及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽是动物体内极为重要的先天免疫物质，是一种具有广谱抗菌、抗病毒甚至 抗寄生虫活性的阳离子短肽。关于抗菌肽的作用机制，目前普遍认可的是抗菌肽的膜攻击 学说，即通过正负电荷相吸原理作用于细菌细胞膜，引起膜通透性改变，或在细菌细胞膜上 形成跨膜的孔洞，最后导致细菌内容物外泄而死亡。由于其独特的作用机制，如果细菌要产 生耐药性，必须改变细胞膜结构，而这种结构的改变对细菌本身有着更大的生命威胁，因此 细菌产生耐药性的可能微乎其微。因此，抗菌肽自发现以来就被认为是传统抗生素的最佳 替代品，可广泛应用于医药卫生、农业生产、食品工业等领域。
[0003] 然而，天然抗菌肽并非完美无缺，大部分天然抗菌肽的抗菌活性不高，部分抗菌肽 在与细胞膜相互作用的过程中对真核细胞产生的细胞毒性也限制了抗菌肽在临床上的应 用。因此，在寻找活性更强，无溶血或细胞毒作用的抗菌肽的同时也开始致力于对原有的天 然抗菌肽进行结构改造或重新设计，抗菌肽分子设计是基于抗菌肽的结构与功能的关系， 通过一系列生物信息学方法，实现对天然抗菌肽的定向改造或全新设计，以获得更加符合 人们需要的抗菌肽类抗生素。
[0004] 来自猪体内的抗菌肽（Hepcidin)是一种富含半胱氨酸的小分子多肽，既具有 一定的抑菌活性，又具有调节机体铁代谢的功能，其潜在的医用价值成为近年来研宄的 一个热点。但通过化学合成或从组织中提取获得该抗菌肽的成本太高，得率低且工序繁 琐，因此，利用生物技术在体外获得大量抗菌肽成为当前的一个首选方法。巴斯德毕赤酵 母（Pichia pastoris)表达系统作为近几年新兴的外源蛋白表达系统，已表现出相当大 的潜力，弥补了原核系统的一些缺陷。有研宄表明直接从猪的肝脏中提取出天然抗菌肽 (If印cidin)基因，与pGAPZ a A载体相连后转入到毕赤酵母中，虽然抗菌肽目的基因导入 验证成功，可是却没有发现其抑菌活性。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型抗菌肽H印-W及其制 备方法和应用，在分析猪抗菌肽（Hepcidin)理化性质、空间结构的基础上，通过分子设计 对!fepcidin进行分子改建，获得了在抗菌活性及细胞毒性方面表现俱佳、且具有独特膜作 用机制的改建抗菌肽H印-W。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 一种新型抗菌肽H印-W，所述抗菌肽H印-W氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 [0008] 优选的，所述新型抗菌肽H印-W核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0009] -种新型抗菌肽Hep-W的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 1)新型抗菌肽Ifep-W基因的设计与合成：参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，对 猪成熟肽Hepcidin的基因进行改造，改造并合成新型抗菌肽Hep-W基因；
[0011] 2)新型抗菌肽H印-W表达载体的构建与鉴定；将新型抗菌肽H印-W基因序列与 pGAPZ a A相连接获得的表达载体pGAPZ a A-H印-W在感受细胞内表达，对表达后的表达载 体pGAPZ a A-Ifep-W进行PCR和双酶切鉴定，获得测序正确的表达载体；
[0012] 3)新型抗菌肽！fep-w真核表达载体的构建：将测序正确的表达载体 pGAPZ a A-H印-W转入毕赤巴斯德酵母，获得重组酵母菌，对重组酵母菌进行鉴定；
[0013] 4)新型抗菌肽!fep-w的获得：将鉴定正确的重组酵母菌培养后进行灭活、破碎并 纯化，即获得新型抗菌肽H印-W。
[0014] 进一步，所述步骤2)、3)中鉴定过程采用的引物对上下游引物序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4。
[0015] 进一步所述步骤3)种表达载体pGAPZ a A-Hep-W通过电转化法转入毕赤巴斯德酵 母。
[0016] 新型抗菌肽Hep-W作为畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗的应用。
[0017] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0018] 1、本发明中新型抗菌肽!fep-W在抗菌活性及细胞毒性方面表现俱佳、且具有独特 膜作用机制；
[0019] 2、本发明中抗菌肽!fep-w具有良好的抑菌活性及热稳定性，并且溶血性低，即使 是高浓度的杂合抗菌肽对红细胞也几乎没有破坏作用，安全性得到大大提高；
[0020] 3、本发明中抗菌肽H印-W对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性大大提高；
[0021] 4、本发明中抗菌肽H印-W制备方法简单，易纯化，成本低，利于大规模生产。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明中组成型表达载体pGAPZ a A-Hep-W的构建示意图；
[0023] 图2为本发明中组成型表达载体pGAPZ a A-Hep-W的鉴定电泳图；
[0024] 其中，M为DL5000 DNA Marker (宝生物工程（大连）有限公司），1-7为重组 pGAPZ a A-Ifep-W 质粒 PCR 产物。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0026] 实施例1
[0027] 新型抗菌肽H印-W的制备方法
[0028] 1)新型抗菌肽Hep-W基因的设计与合成
[0029] 根据GenBank中猪（Sus scrofa)Hepcidin成熟肽基因序列。保持了原猪Hepcidin 成熟肽的二硫键和扭曲β折叠结构，将第8位和18位的Ile替换为Trp，以增加芳香族氨 基酸Trp的含量设计而成，试图提高其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，最后设 计的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0030] 对设计新型抗菌肽H印-W氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成新型抗菌 肽H印-W基因序列（如SEQ ID N0:2所示），并在其N端引入Kex 2酶切位点，在C端引入 终止密码子。两端引入EcoR I和Xba I酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。另 设计合成一对引物，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上下游引物P1、P2核苷酸序列分 别如SEQ ID NO:3、4所示。
[0031] 2)新型抗菌肽H印-W表达载体的构建与鉴定
[0032] 将含新型抗菌肽H印-W基因的载体和酵母表达载体均用EcoR I和Xba I双酶切， 酶切产物经胶回收纯化后连接，连接反应采用IOuL的反应体系，连接酶反应缓冲液luL，T4 DNA连接酶1-5 U，载体DNA (IOOng)与外源DNA的摩尔比为1:3-10,16°C水浴连接过夜。然 后将连接产物导入感受态细胞中培养后进行PCR和双酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的重组 质粒送南京金斯瑞进行测序。
[0033] 3)重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
[0034] 将测序鉴定正确的重组质粒和空载体用限制性内切酶Bin I单酶切线性化后加入 毕赤巴斯德酵母Pichia pastoris X-33感受态细胞悬液