一种赤链华游蛇来源抗菌多肽sac及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC及 应用。
【背景技术】
[0002] 近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类 健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用对耐药微生物尚未使用过 的新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。
[0003] 抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫系统的一种重要 分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简 单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被 认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过1500 多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC及其编码基因和应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] -种赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC，赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC由29个氨基酸 残基组成，为直链多肽，分子量3569. 5Da，等电点11. 59。
[0007] 所述抗菌多肽SAC氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述抗菌多肽SAC的前体的基因自5'端至3'端的碱基序列由SEQ ID NO. 2所示。 [0009] 所述SEQ ID NO. 2所示碱基序列应用于多肽重组表达，转基因动物、植物、植物部 分、动物细胞或植物细胞中。
[0010] 一种赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC的应用，所述赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC可 用于制备抗菌药物、抑制细菌生长药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体。
[0011] 所述赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC可用于制备抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细 菌或真菌的药物或组合物。
[0012] 本发明所具有的优点：
[0013] 本发明所述赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC具有分子量小、化学合成方法简单、抗 菌作用广谱高效、溶血活性低的有益特点，具有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
[0014] 下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于 此。
[0015] 实施例1
[0016] 赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC编码基因的克隆：
[0017] 1)赤链华游蛇肺总RNA提取：
[0018] ①取300mg赤链华游蛇肺组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管 中，加入1ml总RNA提取试剂（Trizol，美国Life tech公司产品），充分混匀，而后于4°C， 12000rpm 离心 lOmin。
[0019] ②离心取上清，加入0. 2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4°C， 12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
[0020] ③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4°C，12000rpm离心10分钟，收 集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为赤链华游蛇肺总RNA。
[0021] 2)赤链华游蛇肺cDNA文库构建：采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 构建。
[0022] (I) cDNA第一链合成（mRNA反转录）：
[0023] ①经DEPC处理（DEPC处理是在含0. 1 % (V/V) DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘 干）的离心管中加入1 μ 1赤链华游蛇肺总RNAU μ 1 3'端一链合成引物（3' In-Fusion SMARTer CDS Primer)和 2. 5 μ 1 经 DEPC 处理（DEPC 处理是将含 0· 1 % (V/V) DEPC 的水，放 置过夜，高压灭菌）的水使总体积达到4. 5 μ 1，混勾后短暂离心（2000rpm，30s)，离心后于 72°C保温3分钟；保温后再将离心管在42°C孵育2分钟。
[0024] ②在上述离心管中加入以下试剂（均为CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备），2. 0 μ I 5X 第一链缓 冲液、0·25μ1 IOOmM DTT、1.0yl IOmM dNTP Mix、L0yl SMARTer V Oligonucleotide、 0· 25 μ I RNase Inhibitor 和 I.0 μ I SMARTScribe Reverse Transcriptase 反转录 酶（所用试剂均为 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备），混合离心管中试剂并短暂离心（2000rpm，30s)，在 42°C保温90min，然后68°C保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。 从离心管取2 μ 1所合成的cDNA第一链备用。
[0025] (2)采用长末端聚合酶链式反应（LD-PCR)方法扩增第二链（所用试剂均为 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 建 库试剂盒中配备）
[0026] ①将 2 μ I cDNA 第一链（mRNA 反转录）、80 μ 1 去离子水、10 μ 1 10XAdvantage 2PCR 缓冲液、2 μ I 50 XdNTP 混合物、2 μ I 5'PCR 引物、2 μ I CDS 111/3'PCR 引物以及 2μ1 50XAdvantage 2Polymerase Mix(所用试剂均为 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备）在 95°C预热的 PCR 管中进行混合。
[0027] ②在 PCR 仪中按以下程序扩增：95°C，lmin ;18 个循环：95°C，15sec，65°C，30sec， 68°C，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链一 80°C保存。
[0028] (3)赤链华游蛇来源抗菌多肽SAC编码基因克隆筛选：
[0029] 根据蛇类抗菌肽编码基因中间保守区，人工设计合成正向引物进行PCR扩增，其 序列为 5' -GTCATGGRRTGCACAGGCTACT-3'，PCR 另一扩增引物为 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3' -PCR 引物，其序列 为 5' -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3'。PCR 反应在如下条件下进行：94°C 5min，94°C 30sec， 57°C 3〇sec和72°C lmin，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的