一种高效表达与制备外分泌型人源ca125的方法
【专利摘要】一种高效表达与制备外分泌型人源CA125的方法，该方法主要包括如下三个方面的内容：(1)利用基因合成技术合成CA125的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZαA?CA125，并进行质粒抽提；(2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型CA125重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；(3)优化硫酸铵分级沉淀,从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的CA125重组蛋白，在55％硫酸铵浓度下目的蛋白CA125几乎全部析出，本发明将纯化得到的分泌重组蛋白CA125用临床检测电化学发光法检测其生物活性，其值达802100U/mL。
【专利说明】
一种高效表达与制备外分泌型人源CA125的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种体外重组高效表达制备具有生物活性CA125的方法，具体涉及利用分泌型毕赤酵母表达系统表达具有生物活性的人源CA125重组蛋白的方法，属于生物医学分析技术领域。【背景技术】
[0002]肿瘤相关抗原CA125是一种细胞表面的高分子糖蛋白，为膜抗原，组织分布广泛， 在部分正常组织、良性病变和恶性肿瘤中均可产生。肿瘤相关抗原CA125作为最重要的肿瘤标志物，被广泛应用于妇科上皮性恶性肿瘤，特别是卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌的诊断和治疗，也成为多种妇科疾病的筛查、诊断、随访以及病情监测的重要指标。目前，CA125作为高特异性的卵巢肿瘤标志物已被广泛应用于卵巢癌的临床诊断、疗效观察和疾病监测。
[0003]巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。毕赤酵母表达系统主要有以下优点:1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，A0X1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性;3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产;4)在P.pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化;5) 糖基化程度低，与S.cerevisiae相比，P.pastoris不产生过度的糖基化。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种能够大规模制备具有生物活性且高纯度的高效表达与制备外分泌型人源CA125的方法。
[0005]本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种高效表达与制备外分泌型人源 CA125的方法，该方法主要包括如下三个方面的内容:
[0006](1)利用基因合成技术合成CA125的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZaA-CAl 25，并进行质粒抽提；
[0007](2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型CA125重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；
[0008](3)优化硫酸铵分级沉淀，从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的CA125重组蛋白，在55%硫酸铵浓度下目的蛋白CA125几乎全部析出，经电化学发光法检测其生物活性，且生物活性值达802100U/mL。
[0009]本发明进一步的技术方案是:所述三个方面的内容中，分别包含有如下具体步骤:
[0010]第(1)方面的内容中包括如下两个步骤:
[0011]a.利用基因合成技术，合成人源CA125序列；
[0012]b.设计带酶切位点的引物，通过PCR得到带有双酶切位点的CA125克隆质粒，并进行质粒提取；
[0013]第(2)方面的内容中包括如下五个步骤:
[0014]c.将b步骤中获得的质粒通过双酶切克隆到PpICZaA载体中，构建PpICZaA_CA125重组表达质粒，并进彳丁质粒抽提；
[0015]d.将c步骤中获得的质粒进行线性化后电转进入毕赤酵母GS115中，通过优化感受态细胞GS115浓度，获取高转染率，通过PCR鉴定挑取阳性克隆；
[0016]e.将d步骤中挑取的阳性克隆同时用甲醇进行小量诱导表达，通过对甲醇添加量、诱导时间和菌密度表达条件的优化，获得最佳诱导表达条件并获取最佳表达重组菌；
[0017]f.通过步骤e中实验得出，甲醇浓度为0.5%，诱导表达第3天的重组蛋白的分泌量最大;
[0018]g.通过前面实验的基础，再将表达体系扩大至2L，收集表达第3天的发酵上清液；
[0019]第(3)方面的内容中包括如下两个步骤:
[0020]h.将g步骤中获得的发酵液通过硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，设计不同硫酸铵浓度梯度获得沉淀蛋白；
[0021]1.将h步骤中获得的蛋白回溶后经透析，测其含量得出目的蛋白在55%硫酸铵浓度下几乎已全部析出。
[0022]本发明将纯化得到的分泌重组蛋白CA125用临床检测电化学发光法检测其生物活性，其值达802100U/mL。
【附图说明】
[0023 ]图1是毕赤酵母表达系统的质粒Pp ICZaA的质粒图谱，
[0024]图2是重组表达质粒pPICZaA_CA125构建的PCR鉴定图，
[0025]图3是酵母GS115重组菌株的菌落PCR鉴定图，
[0026]图4是Western blot分析经硫酸钱沉淀后的CA125，
[0027]图5是硫酸铵浓缩后CA125活力测定。
[0028]图1中图谱的具体信息为:
[0029]5，A0X I启动子(5，A0X lpromoter reg1n):base 1-941
[0030]5，A0X I引物绑定位点(5’A0X lpriming site):base 855-875[0031 ].因子信号序列(-factor signal sequence):base 941-1207
[0032].因子引物绑定位点(-factoepriming site):base 1144-1164
[0033]多克隆位点(Multiplecloning site):base 1208-1276
[0034]c_myc抗原决定基(c_myc epitope):base 1275-1304
[0035]6XHis标签(Polyhistidine(6XHis)tag):base 1320-1337
[0036]3’Α0Π引物绑定位点(3’A0Xlpriming site):base 1423-1443Α0Π转录终止区域(AOXltranscript1n terminat1n reg1n):base 1341-1682
[0037]TEFl启动子(TEFlpromoter):base 1683-2093
[0038]EM7 启动子(EM7promoter): base 2095-2162
[0039]Sh ble开放阅读框架(Sh ble ORF):base 2163-2537
[0040]CYCl转录终止区(CYCltranscript1n terminat1n reg1n):base 2538-2855[0041 ]pUC复制起始位点(pUC origin):base 2866-3539(complementary strand)。
[0042]图4中的具体信息:
[0043]Lane 1:第3天发酵液
[0044]Lane 2:55%硫酸铵集份
[0045]Lane 3:75%硫酸铵集份
[0046]M:蛋白分子量marker。
【具体实施方式】
[0047]下面将结合具体实施例以及附图对本发明作详细介绍，本发明在实施中选用的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0048]本发明所述一种高效表达与制备外分泌型人源CA125的方法，该方法主要包括如下三个方面的内容:
[0049](I)利用基因合成技术合成CA125的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZaA-CAl 25，并进行质粒抽提；
[0050](2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型CA125重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；
[0051 ] (3)优化硫酸铵分级沉淀，从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的CA125重组蛋白，在55%硫酸铵浓度下目的蛋白CA125几乎全部析出，经电化学发光法检测其生物活性，值达802100U/mL。
[0052]本发明的要点是首先构建酵母表达的CA125重组表达质粒并转入到毕赤酵母GS115中，再通过甲醇诱导表达重组蛋白CA125，最后通过硫酸铵沉淀纯化表达的CA125;具体包括以下步骤:
[0053]a.利用基因合成技术，合成人源CA125序列；
[0054]b.设计带酶切位点的引物，通过PCR得到带有双酶切位点的CAl 25克隆质粒，并进行质粒提取；
[0055]c.将b步骤中获得的质粒通过双酶切克隆到PpICZaA载体中，构建PpICZaA_CA125重组表达质粒，并进彳丁质粒抽提；
[0056]d.将c步骤中获得的质粒进行线性化后电转进入毕赤酵母GS115中，通过优化感受态细胞GS115浓度，获取高转染率，通过PCR鉴定挑取阳性克隆；
[0057]e.将d步骤中挑取的阳性克隆同时用甲醇进行小量诱导表达，通过对甲醇添加量、诱导时间、菌密度等表达条件的优化，获得最佳诱导表达条件并获取最佳表达重组菌；
[0058]f.通过e步骤中的实验得出，甲醇浓度为0.5%，诱导表达第3天的重组蛋白的分泌量最大；
[0059]g.通过前面实验的基础，再将表达体系扩大至2L，收集表达第3天的发酵上清液；
[0060]h.将g步骤中获得的发酵液通过硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，设计不同硫酸铵浓度梯度获得沉淀蛋白；
[0061]1.将h步骤中获得的蛋白回溶后经透析，测其含量得出目的蛋白在55%硫酸铵浓度下几乎已全部析出。
[0062]实施例1
[0063]1.研究材料:重组质粒pReceiver_CA125由外包服务公司合成;表达载体pPICZaA均购自复能基因；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自大连宝生物公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂购自北京天根公司;ECL Western Blot检测试剂盒购自Millipore公司；一抗购自SC B1technology;二抗购自GE Healthcare。
[0064]2.工作流程:
[0065](I)以原核表达重组质粒pReceiVer-CA125为模板，设计含限制性内切酶EcoRI和KpnI识别位点的PCR引物，PCR扩增带双酶切识别位点的CA125目的基因片段，再将毕赤酵母表达载体PPICZaA(结构见图1)和CA125PCR扩增基因片段同时用EcoRI和KpnI双酶切后经T4DNA连接酶连接，得到重组表达质粒pPICZaA-CAl 25。
[0066](2)制备E.Coli BL21(DE3)的感受态细胞，转化重组表达质粒pPICZaA-CAl25，取10uL涂布在含zeocin抗性的低盐LB即LLB平板上，37°C培养箱培养过夜。挑取4个单克隆进行菌落PCR鉴定，用I %琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在2700bp左右的位置有特异性条带，表明重组表达质粒构建成功，如图2所示。选取其中一个单克隆置于ISmIy^zeocin LLB培养基中培养过夜，再用小提中量质粒提取试剂盒抽提重组表达质粒。
[0067](3)在将重组质粒转化到毕赤酵母GS115中之前，先将(3)中提取获得的重组质粒用限制性内切酶EcoRI进行单酶切线性化、乙醇纯化，制备新鲜的毕赤酵母GSl 15感受态细胞，通过电转化将重组质粒转入GS115中，并均匀地将其涂布在含zeocin的YH)平板中。待长出单克隆后，挑取18个单克隆进行PCR鉴定，用I %琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在2700bp左右的位置有特异性条带，表明重组表达质粒构建成功，如图3所示。
[0068](4)挑取(3)中鉴定为阳性单克隆的4株重组菌株接种于1mL BMGY培养基中。30°C震荡培养至OD6QQ达2?6，2500r/min离心5min，弃上清，用20mL BMMY培养基重悬细胞，30°C振荡培养甲醇(0.5%)诱导蛋白表达。诱导开始后每隔2411取样，样品经800(^/1^11离心Imin，将上清和细胞沉淀分离并放置在4°C。同时，补加无菌的100 %甲醇至终浓度为0.5 %以维持诱导。
[0069](5)发酵液经8000r/min离心30min。将发酵上清液用硫酸铵分级沉淀(30%、55%和75% )进行纯化，并通过Western blot分析纯化结果。结果Western blot检测到10kDa处有CAl 25特异性免疫反应条带，表明重组CAl 25蛋白表达成功如图4所示。
[0070](6)将(5)中的经硫酸铵沉淀后获得的CA125和硫酸铵沉淀前的CA125用罗氏E601电化学发光免疫分析仪测定其活力，结果表明成功表达的重组CA125具有生物活性如图5所不O
【主权项】
1.一种高效表达与制备外分泌型人源CA125的方法，其特征在于该方法主要包括如下 三个方面的内容:(1)利用基因合成技术合成CA125的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建 酵母重组表达质粒PpICZaA-CAl 25，并进行质粒抽提；(2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型CA125重组蛋白，并通过优化表达时 间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；(3)优化硫酸铵分级沉淀，从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的CA125重组蛋 白，在55%硫酸铵浓度下目的蛋白CA125几乎全部析出，经电化学发光法检测其生物活性， 其生物活性值达802100U/mL。2.根据权利要求1所述的高效表达与制备外分泌型人源CA125的方法，其特征在于所述 三个方面的内容中，分别包含有如下具体步骤:第(1)方面的内容中包括如下两个步骤:a.利用基因合成技术，合成人源CA125序列；b.设计带酶切位点的引物，通过PCR得到带有双酶切位点的CA125克隆质粒，并进行质 粒提取；第(2)方面的内容中包括如下五个步骤:c.将b步骤中获得的质粒通过双酶切克隆到PpICZaA载体中，构建PpICZaA_CA125重组 表达质粒，并进行质粒抽提；d.将c步骤中获得的质粒进行线性化后电转进入毕赤酵母GS115中，通过优化感受态细 胞GS115浓度，获取高转染率，通过PCR鉴定挑取阳性克隆；e.将d步骤中挑取的阳性克隆同时用甲醇进行小量诱导表达，通过对甲醇添加量、诱导 时间和菌密度表达条件的优化，获得最佳诱导表达条件并获取最佳表达重组菌；f.通过步骤e中实验得出，甲醇浓度为0.5%，诱导表达第3天的重组蛋白的分泌量最 大；g.通过前面实验的基础，再将表达体系扩大至2L，收集表达第3天的发酵上清液；第(3)方面的内容中包括如下两个步骤:h.将g步骤中获得的发酵液通过硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，设计不同硫酸铵浓度梯度 获得沉淀蛋白；I.将h步骤中获得的蛋白回溶后经透析，测其含量得出目的蛋白在55%硫酸铵浓度下 几乎全部析出。
【文档编号】C12R1/84GK105950647SQ201610321064
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】欧文斌, 孟凡国, 刘丽, 严子琴, 李海龙
【申请人】浙江理工大学, 浙江清华长三角研究院