抗原性糖类的固定和应用以检测感染性微生物的制作方法

专利名称：抗原性糖类的固定和应用以检测感染性微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学和诊断领域，更具体地涉及当前和/或过去和/或无症状感染的诊断，或者暴露于格兰氏阴性细菌(如肠细菌(enterobacteriaceae)或军团杆菌(1egionella))的历史的诊断。甚至更具体地，本发明涉及对于存在不希望/不期望微生物的动物或动物产品的筛选。本发明进一步涉及一种筛选存在针对不希望/不期望微生物的抗体的样品的方法，并且优选地这样的方法在生物传感器的帮助下实施。本发明还涉及一种用于将多糖固定至固体表面的方法。此外，本发明提供了具有固定多糖的固体表面以及这样的表面的应用。

背景技术：
世界上充满了格兰氏阴性细菌，它们中的许多是肠细菌家族的成员。这个家族的成员存在于动物的胃肠道中，但是许多也是土壤和水中的游离生物。肠细菌家族的成员具有非常复杂的抗原结构。此外，它们包含多种抗原，称为K抗原、H抗原和O抗原。K抗原是酸性多糖胶囊(acidic polysaccharide capsule)。这种胶囊具有许多功能，包括规避来自所感染宿主免疫系统以及粘附至宿主的表皮。H抗原位于鞭毛上。
格兰氏阴性细菌的细胞壁的外部部分主要由脂多糖(LPS)构成。LPS由嵌入外膜中的脂质A、短烃核(糖核，carbohydrate core)以及可选地组成重复单元的多糖链构成。O-抗原位于该多糖上。脂质A是LPS的毒性组分。当细胞溶解时，LPS被释放，导致发热和补体消耗。其还干扰血凝固并且在高浓度下最终导致休克状态。
将更详细地讨论作为非限制实例的肠细菌的一个成员沙门氏菌。肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)属的大量亚种对于人类和动物是重要的致病菌。除了动物进入病态期外，动物可以是细菌的无症状载体。受污染动物可以是这些威胁公共健康(例如通过由这些动物生产的食物)的病原体的来源。由于许多风险承担者认为大量食源性沙门氏菌感染不可接受，所以必须采取措施以将这种病原体包含在食物链中。
沙门氏菌在人类食源性感染中作为致病微生物是很重要的，引起中度至严重的临床效应。在荷兰，所有鉴定的肠胃炎病例的5％是沙门氏菌病(Edel et al.，1993；Hoogenboom Verdegaal et al.，1994)。这种感染的平均发生率为处于危险中的每100,000人年有450例，这类似于其他工业化国家(Berends et al.，1998)。尽管直至2001年在肠道沙门氏菌组中鉴定了2480个血清型，但是仅少数涉及人类感染(Grimont et al.，2000)。代表＞75％的所有沙门氏菌的鼠伤寒沙门氏菌加肠炎沙门氏菌分离自在2002年送到在RIVM的德国国家沙门氏菌中心的人源(Van Pelt et al.，2003)。51％构成的这个百分数是通过与鸡肉产品(家禽15％；蛋类36％)接触所贡献的(VanPelt et al.，2003)。
有机体体液中的免疫球蛋白的检测(血清学)是一种建立动物和人类暴露于感染性试剂的历史的方式。针对沙门氏菌抗原的体液反应可以在感染后1周的小鸡中检测到并且持续至少10周，即使鸟不再是主动培养(culture-positive)的(Holt，2000)。沙门氏菌的抗原决定簇如上所述由菌体细胞(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原构成(Holt，2000)。抗原组成中的变化与不同沙门氏菌血清型相关。
通常，血清学比疾病引发有机体的培养型更快。潜在的沙门氏菌阳性属和群的快速和特异性检测很重要，以便在生产过程中采取充分的措施。因此，对来自生产食品的动物(报道存在人畜传染病病原体)的血清和血液样品中的抗体的检测很重要。然后，这样的信息(数据)用作输入(信息)，用于潜在病原体污染的动物的风险评估和合理消灭，以便能够提高食品安全性，而且改善职业危害因素以及减少病原体在环境中的传播。
对于侵入性沙门氏菌物种的检测，已经开发了大量血清学试验。在许多这样的方法中，凝集和ELISA已是最通常使用的(Barrow，2000)。凝集试验已成功地用于从家禽种群根除鸡瘟沙门氏菌。然而，该途径麻烦、费劳力并且不适合于根据现代标准的大规模筛选程序。因此，多个ELISA过程，被认为是相对廉价和快速的，已被开发用来检测家禽血清中的抗-肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌抗原反应(Barrow et al.，1996；Thorns et al.，1996；de Vries et al.，1998；Barrow，2000；Yamane et al.，2000)。
生物传感器的应用也预示着在这个分析领域很有用、廉价且快速。另外，这种技术在单次操作中能够检测任何生物分子类型的多个分析物。生物传感器定义为一种分析装置，其由(i)“传感”分析物的可再利用的固定化生物配体，和(ii)物理变换器，其将这种现象转化成电信号所构成。
表面等离子谐振(SPR)现象首先是在20世纪60年代早期识别的(Kretschmann and Raether，1968)并且第一个SPR生物传感器是在20世纪80年代引入的(Liedberg et al.，1983)。在第一台商购可获得的SPR-基生物传感器设备投放到市场上之前，花的时间直到20世纪80年代晚期和20世纪90年代早期。最初，作为用于从组合文库选择性和体外灵敏性筛选有前景的新药产品的辅助工具，这种类型的生物传感器引起了制药公司的兴趣。其已证实是用于典型方法如ELISA过程的有价值备选替换。此外，相比于终点确定，其提供了结合情形的实时检测。这种分析方法的优点也已由许多其他生命科学学科包括食品科学(Ivnitski et al.，1999；Medina 1997)所认识。迄今为止，仅少数关于SPR生物传感的出版物描述了致病性微生物的检测，例如使用固定化大肠杆菌O157:H7细胞来筛选抗大肠杆菌O157:H7抗体的性能(Medina et al.，1997)，并应用这些抗体来检测大肠杆菌O157:H7细胞(Fratamico et al.，1997)。在Jongerius-Gortemaker et al.，(2002)中，启动了一项对于SPR光学生物传感器检测血清和血液中的抗体的合适性的研究，表明了对于利用肠炎和鼠伤寒沙门氏菌血清型的入侵的体液反应。在该研究中，利用了固定化鞭毛抗原融合蛋白。在全面分析之后，推断这种系统的灵敏性和/或耐用性不够，尤其是对于例如在屠宰场的屠宰线的家禽的高通量筛选、以每小时几千只的速度加工动物是不够的。


发明内容
本发明的目的是提供一种具有改善的灵敏性和/或改善的耐用性的方法。这个目的已经通过开发具有固定化菌体(菌体抗体)或所谓的O-抗原的载体而达到。如所述的，O-抗原位于脂多糖上并且多糖的组成变化并与沙门氏菌(亚)种的血清变型一致。在其他之中，每一个血清型可以通过大量O-抗原进行描述并且通常利用数字进行编码，如O4、O6或O12。可以发现O-抗原在LPS的多糖部分上作为重复单元。多糖的长度也变化并且可以在零(粗糙LPS)和多于50个重复单元(光滑LPS)之间。
在肠道沙门氏菌家族中，可以区别不同的血清组；每个组包含至少一个特异性O-抗原。在小鸡和猪中重要的沙门氏菌血清变型以它们的O-抗原外形列于表1中。在丹麦、德国、希腊和荷兰，在屠宰场取样的所有沙门氏菌阳性猪中的39.5％确定为鼠伤寒沙门氏菌。依赖于国家，来自猪的其他重要分离物是德尔卑沙门菌(S.derby)(17.1％)、婴儿沙门菌(S.infantis)(8.0％)、巴拿马沙门菌(S.panama)(5.1％)、俄亥俄沙门菌(S.ohio)(4.9％)、伦敦沙门菌(S.london)(4.4％)、利文斯通沙门氏菌(S.livingstone)(3.1％)、魏尔肖沙门氏菌(S.virchow)(2.7％)、鸡副伤寒沙门氏菌(S.bredeny)(2.1％)、姆班达卡沙门菌(S.mbandaka)(1.1％)、勃兰登堡沙门菌(S.Brandenburg)(1.0％)、黄金海岸沙门菌(S.goldcoast)(0.8％)。
在小鸡的情形下，14％的小鸡在荷兰2002年的群水平上是沙门氏菌阳性。主要的血清变型是乙型副伤寒沙门氏菌变异株java(S.paratyphi B var.java)。在零售水平，在荷兰发现相当大的百分数(13.4％)。在14个欧盟成员国从雏鸡分离的最常见的沙门氏菌血清变型是乙型副伤寒沙门氏菌变异株java(24.7％)、肠炎沙门氏菌(13.6％)、婴儿沙门氏菌(8.0％)、魏尔肖沙门氏菌(6.7％)、利文斯通沙门氏菌(5.7％)、姆班达卡沙门氏菌(5.5％)、鼠伤寒沙门氏菌(5.3％)、波茨坦沙门氏菌(S.senftenberg)(5.0％)、哈达尔沙门氏菌(S.hadar)(3.7％)。乙型副伤寒沙门菌变异株java是主要的，但这完全可归功于荷兰。
表1一些沙门氏菌血清变型，认为是雏鸡和猪中的重要的人畜传染病试剂，以它们的O-抗原外形列出(Popoff，2001)
a由噬菌体转换决定的O抗原通过下划线表示 b可以存在或缺乏的O抗原在方括号中表示 c由噬菌体ε15[15]和噬菌体ε34[15，34]溶原化的。
在一个第一实施方式中，本发明提供了一种用于将多糖固定在载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂以及包含至少两个胺和/或酰胺基团的聚合物接触以获得多糖-聚合物复合物，以及使所述多糖-聚合物复合物偶联至所述载体。聚合物可以是包含至少两个胺和/或酰胺基团的任何聚合物。所述至少两个胺和/或酰胺基团优选使所述聚合物与所述多糖和所述载体发生交联。为了实现更有效的偶联，优选所述聚合物包含至少4个并且更优选至少7个胺或酰胺基团。聚合物包含至少10个结构单元。聚合物的结构单元共享能够伸长该聚合物的特征性反应性基团。优选的结构单元是氨基酸或其功能部分、衍生物和/或类似物。在一个优选的实施方式中，所述聚合物包含蛋白质。蛋白质包含至少一个多肽链，其包含至少10个氨基酸或其功能等价物。蛋白质至少包含具有游离的胺和/或酰胺基团的成分，诸如例如Asn(A)、Lys(K)、Arg(R)、Gln(Q)。在本发明的上下文中，蛋白质也可以是包含彼此共价或非共价连接的至少两个多肽链的多聚体。蛋白质可以包含修饰，如常用于生物系统的那些修饰，如翻译后糖基化。蛋白质也可以是人工修饰的或提供有另外的基团，只要其具有提及的可利用的胺和/或酰胺基团。
在一个优选的实施方式中，所述多糖来源于格兰氏阴性细菌。这样制备的载体的敏感性当脂多糖(O-抗原)在固定在载体上之前在包含至少两个胺和/或酰胺基团的聚合物(优选蛋白质)存在下被氧化时得到显著改善。尽管我们不希望受任何理论束缚，但是目前认为，由多糖氧化产生的醛基能够与蛋白质的氨基基团反应而形成取代的亚胺(希弗碱结合，Schiff-base binding)。在(活化的)载体(例如传感芯片)上注射之后，可利用的醛基团与酰肼反应形成腙(hydrazon)。随后的还原不仅使载体(例如，包含葡聚糖的载体)和多糖之间的共价结合稳定，而且使蛋白质和多糖之间的亚胺结合稳定。如将在实验部分中更详细解释的，不同沙门氏菌血清型的多糖(O抗原)已被固定在载体上。所制得的载体接着利用标准血清进行SPR分析。获得的血清学响应用作用于该方法成功的指示。当偶联反应在没有氧化步骤的情况下进行时，没有检测到或几乎没有检测到参考血清的显著响应。
优选地，多糖-蛋白质复合物与载体的固定化/偶联使得可以获得高敏感性和/或耐久性。而鞭毛抗原变性并丧失它们针对血清抗体的抗原性，同时传感芯片必须利用相对苛刻溶剂进行再生以用于下一个分析循环，发现菌体抗原针对这些再生溶剂相当稳定。事实上，认为固定的O抗原活性的丧失最初与固体表面降解相关，即逐渐丧失附着至金膜的葡聚糖层(抗原结合至其)。根据本发明的方法导致产生相比于现有技术的载体是更耐用(稳健)的载体。
优选地，本发明提供一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和蛋白质接触以获得多糖-蛋白质复合物，以及使所述多糖-蛋白质复合物偶联至所述载体，其中所述多糖来源于格兰氏阴性细菌，并且甚至更优选地，其中所述多糖来源于肠杆菌科。而甚至更优选地，所述多糖来源于是人类或兽医或植物病原体的格兰氏阴性细菌。这样的多糖的实例是来源于沙门氏菌(亚)种的多糖。其他实例是来源于大肠杆菌物种(例如大肠杆菌O157)和在表2中概况的细菌物种的多糖。
表2对人类和/或动物是致病性的含LPS的细菌的实例
如将在后文更详细解释的，包含固定化多糖(O-抗原)的载体在提到的含LPS细菌的诊断中特别有用。
术语“多糖”用来指包含两个或更多个连接(或键接)单糖单元的糖苷实体，并且在其他之中涵盖寡糖(2-10个残基)以及多糖(多于10个单糖)。连接(或键接)可以导致线性或支化多糖。在一个优选实施方式中，本发明提供了一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和蛋白质接触以获得多糖-蛋白质复合物，以及使所述多糖-蛋白质复合物偶联至所述载体，其中所述多糖是脂多糖(LPS)，即包含脂质A的多糖。对于本领域技术人员明显的是，所使用的(脂)多糖必须包含至少一个抗原结构和可用于/适合于在蛋白质和多糖之间提供键接的一个基团。对于后一项的更详细细节将在后文提供。因此，只要(脂)多糖包含抗原结构和适合于在蛋白质和多糖之间提供键接的基团，则本发明的固定方法可以用来获得灵敏和/或耐用载体。
LPS在细胞外部表达并且是细菌细胞壁的一部分。LPS的表达不是在直接遗传控制下，使得依据所附脂肪链，LPS是一个不同分子库，具有脂质A部分的不同组成。此外，细菌细胞可以合成不带有或带有短烃链的粗糙LPS，或者带有成熟烃链(存在多于50个表达其抗原性的重复单元)的光滑LPS。除了这种异质性，在单个分子LPS内，可以表达多个O-抗原实体，其被区别地编号。然而，O-抗原外形是按照对沙门氏菌血清组独特的定义。沙门氏菌的完全血清分型还包括H-抗原和Vi-抗原。
LPS可以通过各种各样的方法获得，并且实验部分更详细地描述用于此目的的根据Staub(1965)的三氯酸(trichloric acid)提取的应用(可选地，随后是乙醇提取和渗析)。适合的提取方法的其他实例由Wilkons(1996)描述，并且包括但并不限于利用二乙二醇、二甲基亚砜、NaCl-二乙醚(1∶2(v/v))、NaCl-丁-1-醇(1∶1(v/v))、含水EDTA、NaCl-柠檬酸钠、含水酚或含水酚-氯仿石油。
获得/使用的LPS批料(batch)的纯度认为不是极关键的。实验发现，LPS不必须是完全没有污染物的。特定偶联反应提供一定程度的选择性。此外，如在实验部分描述的，所使用/获得的LPS(优选LPS批料)在对于最佳响应必需的蛋白质的量方面被最优化。对于本领域技术人员很明显，LPS优选不包含很多的粗糙LPS。优选的LPS批料主要包括光滑LPS。
尽管我们不希望受限于任何理论，但目前认为，在LPS分子的核心中存在2-酮-3-脱氧-辛酸(KDO)和/或甘油-甘露庚糖(Hep)和/或GlcNAc对于共价偶联是需要的。
尽管大量不同的细菌通过术语格兰氏阴性细菌采用，但是认为来自所有这些细菌的LPS适合用于本申请要求保护的发明，只要该LPS包含至少一种具有非共轭或去共轭的相邻羟基的组分，优选地在LPS分子的核心区域中。在沙门氏菌中，最可能的候选组分是KDO和Hep以及GlcNAc残基。有或没有这样的KDO和/或Hep和/或GlcNAc基团是间接遗传地加以确定的。尽管对于构建物种、血清型或甚至菌株特异性单糖所需的遗传信息在相应的生物体中存在，但是其依赖于生长环境，所述LPS是否在核心区域包含醛-可转换单糖。
当然，还有其他可利用的LPS来源，如商购获得。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和蛋白质接触以获得多糖-蛋白质复合物，以及使所述多糖-蛋白质复合物偶联至所述载体，其中所述蛋白质是具有一定量的(伯)胺的蛋白质(例如血清蛋白质)。优选地，这些胺中的至少一部分不是空间受阻的和/或不参与非共价结合，如H-H桥或偶极-偶极相互作用和/或没有被质子化成胺阳离子。这样的蛋白质优选不具有或几乎不具有任何免疫原性，因而针对所使用的蛋白质的交叉反应性抗体被尽可能多地避免。合适蛋白质的实例是血红蛋白(Hb)、卵清蛋白(Ob)、肌红蛋白(Mb)和血清白蛋白(SA)。确定在固定化LPS(在Hb或Ob或Mb或SA存在下被氧化)上的不同标准血清的生物传感器响应。血清白蛋白、肌红蛋白和血红蛋白给出最有前景的结果。在一个优选的实施方式中，蛋白质是血红蛋白或肌红蛋白。
必需的蛋白质是商购获得的或通过在合适表达系统中的(过表达)或者通过从合适来源分离而获得。血红蛋白例如已经通过从血液分离而获得。优选地，所使用的蛋白质批料尽可能纯，从而尽可能多地防止(规避)交叉反应。然而，实验发现，在没有危及所获得的载体的灵敏度和/或耐用性的情况下，少量的污染是允许的。
在其他之中，(脂)多糖对蛋白质的比率依赖于所使用的蛋白质。利用Hb的实验已表明，在15％至50％(m/m)之间的浓度已导致满意的结果。当使用牛血清白蛋白时，使用低得多的比率(在0.7％至7％(m/m)之间)。一些实例对于利文斯通沙门氏菌LPS的最佳Hb浓度为约50％(m/m)，而对于肠炎沙门氏菌LPS，最佳Hb浓度为15％(m/m)。
分离的LPS制剂优选在由氧化剂促进的蛋白质存在下进行氧化。在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和蛋白质接触以获得多糖-蛋白质复合物，以及使所述多糖-蛋白质复合物偶联至所述载体，其中，所述氧化剂能够氧化邻二醇。甚至更优选地，氧化剂优选至少在受控条件下氧化邻二醇。邻二醇的氧化是优选的，因为这保证了含邻二醇的多糖偶联至基质。在本发明的一个优选实施方式中，待偶联至基质的多糖包含待被结合对的一个成员识别的抗原。为了成为可识别的，优选该抗原至少在被偶联至载体的大多数多糖中是保持未改变的。这需要在为获得有效偶联至基质所需的氧化水平和抗原对于与结合对的成员相关联的可利用性之间的一个平衡。后者要求抗原至少在足以在诊断装置中可利用的量上基本保持未受氧化所影响。根据本发明的邻二醇的氧化保证足够的可识别形式抗原的可利用性，同时允许多糖有效偶联至载体。在一个优选实施方式中，所述氧化剂包含偏高碘酸(钠)盐。其他高碘酸盐如高碘酸钾或它们的其他盐也是本发明适合的高碘酸盐。高碘酸盐氧化非常适合于实现根据本发明的邻二醇的优先氧化。在本发明多糖中的主要邻二醇的氧化通常通过利用高碘酸盐浓度为1至10mM的所述高碘酸盐孵育所述多糖而实现的。反应的其他参数影响主要进行的反应的速度和类型。一个实例是孵育时间。当采用非常短的孵育时间时，可使用高于10mM的高碘酸盐。高碘酸盐优选氧化邻二醇，特别是多糖侧链中更易进行反应的邻二醇。因此，只要选择所谓的“温和”反应条件，则优选地将氧化邻二醇。当选择的条件也允许其他氧化反应更频繁地发生(例如因为邻二醇底物耗尽)时，多糖中存在的抗原将会受到显著影响。因此，对于本发明来说，当使用提到的优选浓度时，并且当至少20％，优选至少50％，更优选至少70％，最优选约90％的抗原在氧化后是完整的时，高碘酸盐氧化说成是温和的。抗原的可利用性或完整性优选借助于使用标准抗体的ELISA测定进行检测。同样，我们不希望受限于任何理论，但目前认为高碘酸盐将引起特别是在烃部分(如在例如甘露糖中)上的邻二醇之间的键的氧化性破裂，生成醛官能团。这个反应通常在黑暗中，使用(优选)新鲜制备的1-100mM在0.1M乙酸钠中的偏高碘酸钠，在pH范围为4.5至5.5之间的缓冲液中进行。优选地，该反应在1至10mM偏高碘酸盐浓度下进行。在上述范围内的蛋白质存在下进行氧化。二-醛化合物，如在LPS的多糖链中的氧化单糖组分，可以与蛋白质中的任何氨基反应并可以形成导致取代亚胺的希夫碱键接(Schiff-base linkage)。当邻羟基中的一个或两个以共价糖键接缩合时，羟基功能丧失并且没有氧化发生。这是在许多支化和/或线性连接的寡糖和多糖中的情形。在沙门氏菌LPS的情况下，内核心结构在大多数情况下带有可氧化的Gal、GlcNAc、Hep和/或KDO，但非还原性Hep和KDO组分是最易氧化的，尤其是在浓度低于6mM偏高碘酸盐的非常温和的氧化条件下。因为核心区域是来自不同肠杆菌科的LPS的相当保守的部分，所以肠杆菌科的成员的(脂)多糖可以应用于本发明的方法。
高碘酸盐也将氧化如果存在的某些氨基乙醇衍生物，如骨胶原中的羟赖氨酸残基，以及蛋氨酸(至其亚砜)和某些硫醇(通常至二硫化物)。另外，肽和蛋白质的N-末端丝氨酸和苏氨酸残基可以通过高碘酸盐选择性地氧化成醛基。然而，这些反应通常以比邻二醇的氧化更低的速率发生，并且这样的基团的存在基本上不干扰根据本发明的方法。
本发明还提供一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和蛋白质接触以获得多糖-蛋白质复合物，以及将所述多糖-蛋白质复合物偶联至所述载体，进一步包括以下步骤，其导致结束/停止氧化过程，例如通过所述多糖-蛋白质复合物的脱盐。这是例如在NAP-5柱子帮助下完成的。然而，本领域技术人员注意到，存在具有相同效果的许多其他方法，例如添加还原剂或易于可氧化的分子如甘油。优选地，停止氧化的方式是同时完成缓冲液改变，例如HPLC、FPLC、渗析、离子交换、凝胶电泳或超滤。
为了存储目的，在加入蛋白质之后，蒸发的试样量的生产也在实验部分中进行描述。这导致存在可再生产材料的大量原料。
因此，本发明进一步包括获得的中间体(中间产物)，即，存在蛋白质氧化多糖的制剂，可选地进行脱盐和可选地进行蒸发。
优选地，使用的载体是由惰性、非疏水性材料制成，并且LPS-蛋白质复合物与所述载体的结合是共价的。甚至更优选地，这样的载体具有低蛋白质结合或低生物分子结合。实例是玻璃或硅土的载体，或者是非疏水性塑料的载体。在一个优选的实施方式中，所述载体为微球体或珠子形式。对于本领域技术人员来说，可利用多种类型的微球体或珠子。在一个优选实施方式中，所述微球体或珠子包含聚苯乙烯。微球体或珠子是特别优选的，因为它们可以利用本发明的方法提供有(具有)不同抗原。具有不同抗原的微球体或珠子相应地可以利用不同颜色进行编码(例如，(内部)荧光标记)。不同颜色标记的珠子或微球体的存在有利于鉴定不同的珠子或微球体。优选地，不同颜色的珠子或微球体已经经由本发明的一种方法提供有不同抗原。然而，已经提供有不同抗原的珠子或微球体也可以通过使用具有不同大小的珠子或微球体加以鉴定。在优选的实施方式之一中，珠子或微球体的鉴定是经由大小和(内部)荧光标记的组合完成的。优选地，使用(高级)流式细胞仪。测试样品中针对一种抗原的抗体的存在可以利用提到的微球体或珠子的集合(collection)来进行。现在，抗体与特定类型抗原的结合可以容易地通过结合的微球体或珠子的颜色码加以检测。抗体的结合可以以各种方式进行检测。例如，含结合抗体的微球体或珠子可以从样品提取并利用对于该抗体的恒定区具有特异性的其他抗体加以检测。另一方面，样品可以直接进行分析，即在没有其他操作下，通过标记结合的抗体，同时检测抗体的颜色和微球体或珠子的颜色。用于同时检测两种或更多种颜色的各种方法对于本领域技术人员来说是可利用的。在本发明中，一种颜色定义为可被检测的任何类型的电磁辐射，其可以是例如通过光反射显示的典型颜色，到作为荧光或磷光的结果发射的光。
因此，本发明进一步提供一种至少两个微球体或珠子的集合，其中所述至少两个微球体或珠子中的至少两个的每一个包含本发明的不同抗原。在一个优选实施方式中，所述抗原包含沙门氏菌的O-抗原。在一个特别优选的实施方式中，所述抗原利用本发明的一种方法连接至所述微球体或珠子载体。因此优选地，所述微球体或珠子的至少一个包含连接至包含待检测抗原的多糖的多糖涂层，彼此经由包含至少两个胺和/或酰胺基团的聚合物，优选是本发明的蛋白质连接，其中所述键接聚合物(蛋白质)连接至包含所述抗原的所述多糖，经由在所述聚合物上的胺和/或酰胺基团以及在所述包含所述抗原的多糖上的高碘酸盐氧化的邻二醇。
如上所述，本发明提供了用于同时检测多种、不同抗体的装置。然而，也可以使用一种类型的已经提供有一种类型抗原的载体，即一种类型的微球体或一种类型的珠子(通过本发明方法获得)也是有用的，例如在一种特定血清变型的诊断中。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和蛋白质接触以获得多糖-蛋白质复合物，以及使所述多糖-蛋白质复合物偶联至所述载体，进一步包括活化所述载体的表面。在一个甚至更优选的实施方式中，所述载体包括用金涂覆的玻璃表面，并且甚至更优选地，所述载体利用羧基供体加以改性。表面可以被活化。在该表面上需要羧酸(COOH)基团(进一步称为羧基)。优选地，这些COOH基团是由分子的稳定均匀(或同源)层提供，而该分子可能已被修饰用于这个目的。这些表面可以以(但不限于)附着至例如金、聚苯乙烯或硅树脂表面的羧酸改性多糖、烷烃或烯烃如聚乙烯存在。优选地，载体包含充当羧基供体的多糖。更优选地，其中所述多糖改性载体的羧甲基化葡聚糖层，优选地包括葡聚糖层是利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化的。该活化之后优选是具有碳酰肼的制剂(preparation)。在下一步中，将多糖-蛋白质复合物加入到活化的葡聚糖层。反应性醛官能团(functionality)自发地与酰肼反应生成腙，其然后被还原以使共价键稳定。
在常规使用之前，轭合芯片的LPS结合抗-肠道菌(例如沙门氏菌)抗体的性能利用参考多克隆凝集血清来评价。
如将在本文实验部分中更详细解释的，获得的(脂)多糖-蛋白质复合物与载体的结合可以经由COOH以及经由NH2基团或经由COOH和NH2基团的组合进行。在一个优选的实施方式中，在本发明方法中使用的载体包含功能地可用于结合的COOH和/或NH2基团。在又一个优选实施方式中，COOH载体(例如COOH珠子)用于小鸡血清的测试或筛选。在一个进一步优选的实施方式中，NH2载体(例如NH2珠子)用于猪血清的分析。
取决于所问的分析/诊断问题，决定是否使用一种或例如至少两种显示(represent)不同血清组的糖类(碳水化合物，carbohydrate)，优选4种显示不同血清组的糖类。在有兴趣知道存在哪一种特定血清组的情形下，使用多种(其量对于所问的特定问题和所使用的设备而不同)显示不同血清组的糖类，并且如果仅希望知道例如动物是否被特定血清组感染或已被感染，则显示单个血清组的糖类可以在蛋白质存在下进行氧化并固定到载体上。至少两种显示不同血清组的糖类的使用导致产生这样的载体，其可以在多血清组分析中使用。更优选地，使用至少三种并且甚至更优选地至少多于三种(例如四种或五种)不同多糖。这些多糖可以在存在一种类型的蛋白质或存在不同类型的蛋白质下被氧化。技术人员能够形成任何可检测的组合。例如，为了能够检测超过90％的所有沙门氏菌感染，应显示小鸡中的血清组B、C和D以及猪中的血清组B、C、D和E。
如果兴趣在于某种类型的细菌是否存在(或曾经存在)的问题，则使用一种类型的显示血清组的糖类是极其有用的。如果希望确定动物是否由任何格兰氏阴性菌(例如肠道菌)感染(或曾经感染)，则使用多种显示不同血清组的糖类例如是有用的。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和蛋白质接触以获得多糖-蛋白质复合物，以及使所述多糖-蛋白质复合物偶联至所述载体，其中所述载体是生物传感器芯片。这样的生物传感器芯片可商购获得(例如由Biacore生产)，因此没有提供进一步的信息。
在另一个实施方式中，本发明提供一种通过根据上述方法获得的载体或者一种在其表面上包含固定化多糖-蛋白质复合物的载体。在本发明的一个实施方式中，本发明的载体包括经由还原性胺化连接至其他多糖涂层的多糖涂层，其中所述其他多糖涂层包含通过氧化所述其他多糖-蛋白质复合物上的邻二醇而偶联至所述其他多糖涂层的蛋白质。在一个优选实施方式中，实现所述还原性胺化。在一个优选实施方式中，本发明提供一种载体，其包含偶联至多糖的多糖涂层。
在又一个实施方式中，本发明提供包括根据本发明的载体的生物传感器。该载体是否是通过根据本发明的方法获得可以例如通过从所述载体提取多糖并确定是否存在共价连接的蛋白质而加以确定。如上所述，载体也可以包含可能组合不同类型蛋白质的不同的固定化多糖(例如O-抗原)。然而，在不同多糖的氧化中也可以使用一种类型的蛋白质。
是否采用本发明的载体和/或芯片可以例如在可能组合有蛋白水解消化的MALDI-MS的帮助下加以确定。这样的分析提供相对于所使用的蛋白质和多糖的信息。在酸性水解的帮助下，多糖-蛋白质复合物从载体释放。然后，这样的获得的混合物在蛋白水解之前和之后进行LC-MS/MS分析。获得的复合物也可以进行单糖分析，例如在甲醇分解和/或Smith降解之后的GC-MS，从其确定使用了哪一种类型的LPS。此外，该信息用来确定KDO、Hep或其他糖是否已被氧化。
本发明的载体可以用在不同检测系统中，例如光的、热的、声的、测量电流的、磁的或化学的系统，并且本发明的载体可以用于任何生物分子相互作用测定(BIA)或任何亲和性测定(AA)。作为一个非限制性实例，更详细地描述了经由表面等离子体谐振的光学检测的应用。
本发明提供了一种表面等离子体谐振检测系统，包括如上所述的生物传感器。传感器芯片中的金层形成对于表面等离子体谐振(SPR)所需的物理条件。SPR的原理将在Biacore仪器的上下文中进行描述。它们整合了SPR现象以“实时”监测生物分子相互作用。在两种不同折射率的透明介质如玻璃和水之间的界面处，来自更高折射率一侧的光被部分反射和部分折射。高于入射光的某一临界角，没有光折射穿过该界面，并且在金属膜-液体界面处发生全内反射(TIR)。这是光穿过光学密实介质如玻璃的地方，并在与光学较不密实介质如缓冲液的界面处穿过该介质而反射回。尽管入射光被全反射，但是电磁场成分，称为消散波(衰减波，evanescent wave)，穿过在一个波长级别(近似于一个波长)的距离进入光学较不密实的介质中。消散波在玻璃棱镜(高折射率)和缓冲液层(低折射率)之间的界面处产生。如果高折射率和低折射率的介质之间的界面涂覆有薄金属膜(光波长的一部分)，则消散波的传播将与金属层上的电子相互作用。金属在它们的表面处包含电子云，其可与以某些角度的入射光耦合。这些电子也称为等离子体，并且消散波穿过金属层引起等离子体谐振，形成称为表面等离子体的量子力学波。因此，当表面等离子体谐振发生时，来自入射光的能量丧失到金属膜，导致反射光强度降低。该谐振现象仅以精确限定的入射光角度发生。该角度取决于靠近金属膜表面的介质的折射率。因此，缓冲溶液的折射率的变化(例如，溶质表面浓度增大)，至距离金属膜表面大约300nm的距离将改变谐振角度。这种谐振角度的连续监测允许量化靠近金属膜表面的缓冲溶液的折射率的变化。在“实时”Biacore中，金属膜性质、波长、和玻璃(更密实介质)的折射率都保持恒定，作为结果，SPR可以用来监测紧紧邻近金属(金)层的含水层的折射率。在Biacore系统中，芯片是由玻璃构成的，具有4个通道，并且相关金层用化学修饰以促进配体如抗体或抗原的固定化的葡聚糖层覆盖。由于分析物与在传感器芯片上的固定化抗体的结合而发生的量上(in mass)的任何变化将引起SPR角度的变化，这被“实时”监测并作为传感图谱加以量化。大约1kRU(1000RU)的量变化对应于1ng/mm2的表面蛋白质浓度的量变化。对于蛋白质的表面结合的典型响应为0.1-20kRU级别。
不需要利用荧光或放射活性标签来标记分子-以避免标记可能损害活性的可能性，并且此外对于标记所需的任何困难或贵重化学品也不是必然的。
除了上述生物传感器外，提供了合适载体的两种其他的、非限制性实例。
合适载体的一个实例是ImmuSpeedTM芯片，其可商购获得(例如有DiagnoSwiss生产)。这样的芯片包括蚀刻入聚合物基质中的平行通道(用于获得这些种类的芯片的一种方法在EP 1255690B1中提供)。如果需要，表面首先处理以在其表面处引入-COOH基团。所使用的聚合物之一是聚酰亚胺，其可以被处理以便引入-COOH基团。对于在聚酰亚胺表面上引入-COOH基团的一个非限制性实例是通过利用含有氢氧化钠NaOH的水溶液处理所述表面(水解)。在这种碱水解之后，除去NaOH并通过例如使用每一个均由2s泵送和15s捕获(停止，arrest)构成的循环，使0.25M乙酸以10μL/min的流速在5min流过芯片的通道而羧基质子化。芯片表面然后用10μL/min的PBS漂洗，通过2-s流动和10-s停止的循环持续5min。当已经引入-COOH基团时，多糖-聚合物复合物如前所述被(共价)结合。简而言之，含羧基的聚合物表面利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺改性。这种活化随后是使含碳酰肼(carbohydrazine)的溶液通过该表面上方。在下一步中，将多糖-蛋白质复合物添加到活化的聚合物表面。反应性醛官能团与酰肼反应成腙，其然后被还原以使共价键稳定。
通过利用多糖-聚合物复合物与载体的共价结合，获得的芯片可以使用多次(优选多余1000次)，其中通过在其使用后再生制备的芯片。通常，免疫芯片仅单次使用(即，它们在使用后被丢弃)。因此，本发明显示出，通过降低废物量的免疫芯片的改进应用。
以上给出的描述导致产生多糖-聚合物复合物与包含聚酰亚胺的载体的共价结合。尽管共价结合对于表面再生和自动化目的是优选的，但是获得的蛋白质-LPS复合物的稳定涂层也通过在该复合物中存在所述蛋白质而获得。尽管不是有限的系列，但是包含标准有机材料如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯、醋酸纤维素或聚酰亚胺的固体载体可以开发用于蛋白质-LPS复合物的涂层。
我们已经利用非共价结合至聚酰亚胺表面的多糖-聚合物复合物进行了实验，并且获得的载体可再生至少4次。
相对于更早描述的Biacore生物传感器，ImmuSpeedTM的优点之一在于，在相同时间可以测试的血清组的量可以增大至例如5个(例如B、C1、C2、D和E)。
ImmuSpeedTM芯片的检测是基于电流计的。
如已经描述的，用于确定结合至本发明载体的抗体的量的一种方式是通过使用已被标记的第二抗体。碱性磷酸酶是合适标记，尤其是在灵敏度作为重要项目的情形下。在我们的情况下，灵敏度(即信噪比)是更重要的并且优选地β-半乳糖苷酶用作标记。使用β-半乳糖苷酶标记的第二抗体的优点在于，其在pH 7更稳定并且更便宜。合适底物是对氨基苯基-β-D-半乳糖苷。
根据本发明利用ImmuSpeedTM芯片的实例在实验部分提供。
因此，本发明提供一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和包含至少两个胺和/或酰胺基团的聚合物接触以获得多糖-聚合物复合物，以及使所述多糖-聚合物复合物偶联至所述载体，其中所述载体包括聚酰亚胺表面(或聚酰亚胺箔)。优选地，所述载体是ImmuSpeed芯片。在一个优选的实施方式中，聚酰亚胺表面(或箔)已经通过NaOH处理活化。本发明进一步包括通过所述方法获得或可获得的一种载体，即一种包括聚酰亚胺表面(或箔)的载体，其表面已被提供有多糖-聚合物复合物。所述多糖-聚合物复合物的结合可以是共价的以及是非共价的，取决于期望再生循环的量。
合适载体的第二个实例是胺反应性生物传感器(例如，由ForteBio提供且在WO2003/004160中详细描述的)。蛋白质通过上文已经描述的胺化学技术共价偶联到传感器表面上。简而言之，传感器表面上的羧基利用EDC/NHS改性以形成N-羟基琥珀酰亚胺酯；由此活化传感器表面。传感器然后与多糖-聚合物复合物(如本文所述制备的)接触。N-羟基琥珀酰亚胺酯与蛋白质表面上的胺反应而形成共价连接。任何未反应的NHS-酯被淬灭。感兴趣的蛋白质的相关性(例如针对沙门氏菌的抗体)现在以无标记、定量和实时方式通过使用偏振干涉仪(也称为生物层干涉仪)进行检测。生物层干涉仪使用非衍射性光学件以实时询问和解决在固体-溶液界面处的生物分子层的大小和密度。与在SPR生物传感中一样，有效折射率的变化，其由在固体-溶液界面处的薄膜形成(诸如分子与生物传感器尖部的结合)引起，导致传感反射光的改变。参考波(基准波，reference wave)的有效指数(有效折射率)保持未受影响，但传感波的相位将改变。波长漂移可以检测并与层厚度和密度相关联。在杂合之后层构象的改变也可以被评价，但这里，仅探测抗-沙门氏菌抗体的特异性结合。
在所研究的所谓Octect(FortéBio)的生物传感器构造中，具有光学涂层的单次使用的生物传感器制备成具有抗原，优选装置的外部。在一个微滴定板构造中，传感器表面即浸入至含试剂、用于固定化的抗原和清洗缓冲液的溶液中。光学表面(其是二维圆形结合层)将加载蛋白质-LPS抗原，其然后可以与来自周围溶液的抗体相互作用。在利用样品的机器的外部和/或内部的必要孵育之后，在八个生物传感器中获得的生物层厚度，使用生物层干涉仪作为检测系统在Octect仪器中同时进行评价。以这种方式，可以实现在20min内分析96个样品。这里应当指出，这种方法是非破坏性的，其中没有交叉污染(易处理的生物传感器)，因此，几乎全部样品体积可以使用分析另一分析物的另一系列易处理生物传感器，对于另一分析系列再现。
相对于更早描述的Biacore生物传感器，Octect的优点之一在于，在同一时间可以试验的血清组的量可以增大至例如5个(例如B、C1、C2、D和E)。
实验部分描述了利用这种载体的一个实例。
因此，本发明提供一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和包含至少两个胺和/或酰胺基团的聚合物接触以获得多糖-聚合物复合物，以及使所述多糖-聚合物复合物偶联至所述载体，其中所述载体包含胺反应性生物传感器。优选地，所述载体是Octet-样生物传感器。本发明进一步包括一种通过所述方法获得或可获得的载体，即一种包含已提供有多糖-聚合物复合物的胺反应性生物传感器的载体。
获得/描述的载体可以用于不同类型的分析，如细菌学(直接测定)或血清学(间接测定)。
血清学测定的一个实例是一种用于确定存在针对样品中的格兰氏阴性菌的抗原的抗体的方法，包括如上所述使所述样品与载体或生物传感器接触，以及确定该载体是否已结合任何抗体(图1)。这样的方法例如非常适合于确定针对O抗原的抗体的存在，因而间接确定感染是否存在或最近感染是否发生。这样的方法例如用于筛选屠宰动物的沙门氏菌或者用于在它们出口国外之前筛选动物的沙门氏菌。此外，该方法也应用于获自活(例如农场或动物园)动物的样品。
可用于这样的方法的样品的实例是组织样品、体液、分泌物或排泄物，并且更详细的样品是血液、血液来源样品、组织、肉汁、乳汁、蛋、眼的分泌液、唾液或粪便。如已经概括的，样品可以获自死亡的以及活的动物。
根据本发明的一种方法不限于某种免疫球蛋白(亚)型，而原则上可以是每一种(同种)型免疫球蛋白如(s)IgA1、(s)IgA2、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgY。此外，也可以是任何其他抗原-结合材料。优选地，这样的抗原-结合材料是感染(历史)的生物标记物。
这样的血清学测定例如是涉及一种显示特定血清组的糖类或涉及显示不同(即多种分析物)血清组的糖类，因而这样的方法例如用于确定有或没有某种沙门氏菌(亚)型。
细菌学测定的一个实例是一种用于确定样品中存在格兰氏阴性细菌的方法，包括使所述样品与预定量的针对所述细菌的抗原的抗体接触，以及确定没有利用如上所述的载体或生物传感器结合至所述细菌的抗体的量。
优选地，抗原是显示血清组的糖类。
该方法可选地进一步包括通过例如清洗或免疫磁分离程序、离心或过滤从接触后的样品移出未结合的抗体，以及预定量的抗体。
对于这种类型的分析，可以使用每一种类型的样品，如动物饲料、粪肥、羽毛、土壤、消费用水或污水、肉、橙汁、巧克力、皮肤、蔬菜等。动物样品可以获自活的动物以及死的动物。
在这种细菌学测定中，使用单个类型的抗体以及至少两种不同类型的抗体(针对不同抗原，例如显示两种不同血清组的糖类)的混合物。
优选地，这样的血清学和细菌学测定如此实施，以使与所述载体或所述生物传感器的结合是通过等离子体表面谐振或荧光微球体或珠子计数器确定的。
样品的来源如以上概括是不受限制的并且可以例如获自人类或动物。合适的动物的实例是(竞赛)马、猪、家禽(例如小鸡、火鸡、鹌鹑、鸭和鹅)、反刍动物(例如牛犊或母牛、山羊、绵羊)。动物可以是农场动物、动物园动物以及自由生活的动物。此外，来自这些动物的样品可以获自活的动物以及死的动物。
在又一个实施方式中，本发明提供了一种用于确定样品中存在格兰氏阴性细菌的方法，包括 -使所述样品与靶细菌特异性、细菌噬菌体接触并允许该细菌噬菌体感染所述样品； -移出未结合的和/或非侵入性细菌噬菌体，导致了细菌噬菌体感染的样品； -使该细菌噬菌体感染的样品接触对于所使用的细菌噬菌体敏感的指示有机体(indicator organism)； -在至少一个细菌噬菌体倍增周期期间进行孵育； -回收(recover)细菌噬菌体以获得含细菌噬菌体的样品； -利用如上所述的载体或生物传感器，分析所述含细菌噬菌体的样品。
大多数分析方法需要在特定介质中先前富集和生长以检测细菌，包括沙门氏菌。通常，相对于总的分析时间，样品制备是非常费时的。通常在例如沙门氏菌的存在可以确认之前需要花费3至5天。在很多情况下，对于分析来说，这个时间是不可接受的并且阻碍贸易并间接地威胁公众健康。
本发明这个部分的目的是开发一种用于确定存在微生物的快速(优选在24小时内)和/或成本有效和/或特异性和/或灵敏的诊断方法。为此，目标是开发探究属-和/或血清变型-特异性细菌噬菌体在它们的“受害者”细菌中倍增的能力的生物分子相互作用测定(BIA)。靶病原体特异性噬菌体数量的增大表明不仅存在靶有机体而且是对于所测试样品中靶细菌含量的(半)定量检测。
提出的BIA方法的示意性概述在图2中示出。特定样品例如使用兜包(Stomacher)均质化。液体样品通过剧烈摇晃混合。然后，分析物细胞通过任何合适方式提取或富集并且可以包括选择性生长、离心、过滤和/或免疫磁力分离(IMS)(的组合)。富集的细胞利用靶细菌特异性细菌噬菌体强化(fortify)，并在混合的同时孵育几分钟。在细菌噬菌体的倍增周期完成之前，清洗细胞以尽可能完全地除去任何未结合的和非侵入性细菌噬菌体。在细菌噬菌体的倍增周期之后，使样品与对于所使用细菌噬菌体敏感(易感)指示生物体接触，即在生命阶段对于细菌噬菌体穿透和胞内倍增敏感，优选地在最高可能浓度下(例如浓缩过夜的培养物)。细菌噬菌体-细菌悬液孵育至少一个细菌噬菌体倍增周期。噬菌体感染的悬液然后离心或过滤以沉淀/去除细胞物质以及回收倍增的细菌噬菌体。含细菌噬菌体的样品注射到LPS轭合的生物传感器芯片(根据本发明)上，以将这些颗粒保留在检测器中用于分析物-特异性生物传感器响应的再生。
为了获得尽可能多的时间，指示生物体可以在实验室作为连续培养物保持并且具有通常109CFU/ml的细胞密度。这样的悬液可以浓缩至1010CFU/ml，因为更高的细胞密度将增大提出的方法的灵敏度。
这种方法可以用来确定单个类型的血清变型，而且可以用来检测一个运行中的多个血清变型、不同细菌噬菌体的混合物，并且可能必须采用可能不同的指示细菌的混合物。
靶细菌特异性细菌噬菌体在现有技术中有描述，并且在实验部分中提供了实例，例如抗肠炎沙门氏菌细菌噬菌体。
噬菌体已描述为附着至LPS，包括在用于沙门氏菌检测的实验部分中描述的噬菌体。合适的载体/芯片是具有LPS或具有固定化细菌表面分子的载体/芯片(因而包括膜蛋白和其他生物分子或其组合)。细胞膜材料的LPS的使用将防止(circumvent)产生多克隆或单克隆抗体。如果噬菌体与细菌生物分子(LPS)的附着在BIA中不是满意的，则生物传感器芯片固定的抗-噬菌体抗体可能必须用于成功的BIA中以捕获来自探测样品的细菌噬菌体。
此外，本发明提供了一种具有适合用于任何所述应用中的组分的试剂盒。取决于消费者需求，这样的试剂盒包括通过根据本发明的方法获得的备用载体/芯片。当消费者希望制备载体本身时，该试剂盒将至少包括利用预定量蛋白质(例如血红蛋白或血清白蛋白)强化/富集的(脂)多糖、一定量的氧化剂(例如高碘酸盐)、合适的缓冲剂。可选地，这样的试剂盒包括用于脱盐的装置，例如脱盐柱。当消费者希望混合(脂)多糖和蛋白质本身时，这些组分连同说明书手册分开递送。可选地，这样的试剂盒可以另外包括阳性和/或阴性参考血清、样品稀释缓冲液和任何必需的说明书手册。
如上所述的方法特别适合用于在大规模基础上筛选样品。在早期(慢)设置之一中，96个样品在33分钟内检查。在具有相对较低生物传感器设备的大规模设置中，15,000个样品在3个月内筛选。这个数量已经显著很高了，但不幸地，屠宰场之一停止参与。
本发明将在以下说明书中更详细地加以解释，其不用于限制本发明。

具体实施例方式 实施例 实施例1 材料和方法 1.1材料 1.1.1化学品 胺偶联试剂盒，其由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和乙醇胺盐酸盐-氢氧化钠pH 8.5以及运行缓冲液(HBS-EP)(包含10mM HEPES，150mM氯化钠，3mM EDTA和0.005％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)购自Biacore AB(Uppsala，Sweden)所构成，其还提供备用10mM甘氨酸和50mM氢氧化钠。乙醇、乙二醇、氯化钠、氢氧化钠和三氯乙酸(TCA)购自Merck(Darmstadt，Germany)。羧甲基化-葡聚糖钠盐、氰基硼氢化钠和碳酰肼获自Fluka Chemie GmbH(Buchs，Switzerland)。CHAPS(+1)由Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)递送。乙酸钠三水合物和乙酸由J.T.Baker(Deventer，The Netherlands)提供。盐酸胍获自Calbiochem(San Diego，CA，U.S.A.)。猪血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)、小鸡卵蛋白(Ob；98％V级)、牛血清白蛋白(BSA；96％馏分V)、高碘酸钠、Tween-20、Tween-80和TritonX-100获自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO，U.S.A.)。水获自Milli Q水纯化系统(Millipore，Bedford，MA，U.S.A.)。
1.1.2材料 NAP-5柱(0.5ml；Sephadex G-25)购自Amersham Biosciences(Roosendaal，The Netherlands)并如生产商指示加以使用。CM5生物传感器芯片购自Biacore AB。具有1kDa截止值(cut-off value)的渗析袋(Spectra/Por)获自Spectrum Laboratories Inc.(RanchoDominguez，CA，U.S.A.)。
1.1.3抗沙门氏菌抗血清 使用以下沙门氏菌单价‘O’菌体lapine抗血清抗-O4，抗-O5，抗-O6，7，抗-O8，抗-O9，抗-O10，抗-O12，O Poly E(抗-O3，抗-O10，抗-O15，抗-O 19，抗-O34)。另外，也使用沙门氏菌多价‘O’菌体(PolyA-S)lapine抗血清(抗-O2，抗-O3，抗-O4，抗-O5，抗-O6，7，抗-O8，抗-O9，抗-O10，抗-O11，抗-O12，抗-O13，抗-O15，抗-O16，抗-O17，抗-O18，抗-O19，抗-O20，抗-O21，抗-O22，抗-O23，抗-O28，抗-O30，抗-O34，抗-O35，抗-O38，抗-O40，抗-O41)。血清购自Pro-Lab diagnostics(Salmonella Reference Section of the CentralVeterinary Laboratory，Weybridge，U.K.)。血清组特异性鼠抗-B(抗-O4，O5 en O27)，抗-C(抗-O7，O8)，抗-D(抗O9，Vi)和抗-E(抗-O3，O19)单克隆抗体购自SIFIN(Berlin，Germany’)。
血清在含1.0M氯化钠、1％(m/v)羧甲基化葡聚糖和0.05％(v/v)Tween 80的HBS-EP中以1∶20(v/v)稀释，只是抗-O5血清以1∶200(v/v)稀释，且抗-血清组特异性制剂在相同溶剂中以1∶100(v/v)稀释。
1.1.4参考禽鸟和猪血清 所有参考血清获自荷兰动物健康服务中心(Dutch AnimalHealth Service)(Deventer，The Netherlands)。获得禽鸟参考血清与肠炎沙门氏菌(血清组D1)、鼠伤寒沙门氏菌(血清组B)、鸡瘟/鸡沙门氏菌(血清组D1)和婴儿沙门氏菌(血清组C1)是反应性的，并进一步分别称为C-Se、C-St、C-Spg和C-Si。这些小鸡血清最初制备用于ELISA分析，作为阳性参考。另外，特定无病原体小鸡血清(进一步称为C-SPF)购买作为阴性对照样品。这些血清从冷冻干燥的材料通过加入由生产商指定体积的水进行重建。C-Se、C-Spg和C-Si在含1.0M氯化钠、1.0％(m/v)羧甲基化葡聚糖和0.05％(v/v)Tween 80的HBS-EP中以1∶200(v/v)稀释，而C-SPF和C-St在相同溶液中以1∶50(v/v)稀释。同样，来自用鼠伤寒沙门氏菌和利文斯通沙门氏菌(血清组C1)攻击的动物的猪血清分别称为P-St和P-S1。另外，在补体结合试验中用作对照的胸膜肺炎嗜血菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)血清型2-反应性猪血清被开发作为用于沙门氏菌生物传感器测定中的猪血清的阴性对照。猪血清在含1.0M氯化钠、1％(m/v)羧甲基化葡聚糖和0.05％(v/v)Tween80的HBS-EP中以1∶20(v/v)稀释作为终浓度。
1.1.5沙门氏菌原液(stock) 细菌黄金海岸沙门氏菌(Sg；血清组C2)、利文斯通沙门氏菌(S1)和火鸡沙门氏菌(Sm；血清组E1)获自内部收集，而肠炎沙门氏菌#23噬菌体型Pt4(Se)和鼠伤寒沙门氏菌X-193噬菌体型507(St)获自F.G.van Zijderveld(Animal Sciences Group，Lelystad，TheNetherlands)。细菌在营养肉汤#2(Oxoid，Basingstroke，U.K.)中过夜培养生长。沙门氏菌菌株的原液在形态学和生物化学上被确认为沙门氏菌，并且还通过在玻璃板上如表3指定的，细胞与特异性标准抗O-抗原抗血清(Pro-Lab diagnostics)的凝集反应证实存在正确的、预期的O-抗原。在加入具有甘油(Merck)的最初体积的一半之后，原液部分地在-80℃储存。
表3用于LPS生产的沙门氏菌血清变型的O-抗原证实。给出了用于通过凝集作用证实的抗血清的预期反应。

aα-O4与用O4编码的抗原结构反应的抗体；以类似方式，指出了针对O5、O6，7、O9、O10和O12的抗体。
b对沙门氏菌血清变型特异性的O抗原在括号中指出。
1.2方法 1.2.1LPS的提取 沙门氏菌的过夜培养物通过从它们对应的原液100μl施加到120板的每一个上(包含脑心灌注琼脂(BHIa，Oxoid))而制备。无论什么时候生产新的原悬液，预期沙门氏菌血清变型的存在通过传统选择性生长、生物化学和免疫化学分类加以确认。细菌利用trigalski刮勺从板表面收获到每个琼脂板的1ml 9g/l NaCl(盐水)溶液中。每一个板用2ml盐水溶液清洗两次。细菌收集到六个离心管中。每个管在以10,000g和4℃离心15min之前补充100ml盐水并混合，并抛弃上清液。这个离心步骤通过每一次运行将细胞悬浮在75ml盐水清洗溶液/管中重复两次。在保持在冰上的同时，成球粒的细菌以体积比悬浮在水中，其是细菌重量的5倍。加入等体积的0.250M(Se)或0.500M(Sg，Sl，Sm和St)TCA以获得分别0.12M和0.25M的终浓度，接着在4℃连续搅拌3h。含脂多糖(LPS)的上清液然后以20,000g和4℃下30min获得。上清液的pH利用5M氢氧化钠调节至pH 6.5，并且当接近目标pH时利用0.10M氢氧化钠调节。含LPS的溶液的终体积在-18℃储存30min之前确定。该溶液利用两倍体积的来自-18℃储存地方的冷冻冷无水乙醇稀释，并在封闭、内嵌装置中利用循环冷乙二醇/水(1∶4，v/v)在没有搅拌的情况下，在-4℃持续孵育过夜。含LPS的小球在以20,000g和-4℃下离心30min之后获得。粒状材料悬浮在每克初始细菌团(在提取工艺开始时称重)的0.5ml体积水中。该悬液以规律间歇更新水，在1-kDa渗析袋相对于4℃水渗析两天。袋内容物以20,000g和4℃下离心30min，并将上清液冷冻干燥。冷冻干燥物称重以建立LPS的回收。LPS在水中重建以补足5mg/ml的终浓度。依赖于LPS的类型和批次(还参见部分1.2.2)，一体积的1mg/ml猪血红蛋白(Hb)加入到文中指定的浓度。每一个批次分成0.5mg LPS组分，其利用真空蒸发器干燥然后储存在5-8℃。
1.2.2最佳血红蛋白含量 将蛋白质加入到LPS制剂中，然后在对其进行化学改性和固定化至传感器芯片以获得高涂覆水平和高血清响应性抗原。每一个LPS批次中的最佳Hb含量通过比较以不同水平的Hb强化的固定化LPS的响应进行构建，使用一板阳性和阴性参考血清。
1.2.3LPS的氧化 一部分0.5mg血红蛋白强化的LPS溶解在500μl 100mM乙酸钠pH 5.5中。在加入20μl 50mM高碘酸钠之后，溶液在避光下在冰上孵育40min。淬灭LPS的氧化并通过使500μl反应混合物通过具有重力受控流动的NAP-5管而使该溶液脱盐。改性的LPS用1ml 10mM乙酸钠pH 4.0洗脱。在使用之前，管用3ml 10mM乙酸钠pH 4.0调节三次。
1.24LPS的固定化 为了将抗原固定到传感器芯片上，在由Biacore 3000控制软件(version 3.1.1；Biacore)控制的Biacore 3000仪器中以5μl/min流速实施以下处理。氧化的LPS的固定化通过执行在BIAapplicationsHandbook，version AB(1998)中描述的醛-偶联程序而实现。简短地，生物传感器芯片CM5的葡聚糖层利用可从胺偶联试剂盒获得EDC/NHS混合物的7-min脉冲活化。该活化之后立即注入5mM含水碳酰肼，也持续7min。
然后，过量反应性基团的失活利用1M乙醇胺持续7min的脉冲实现。在抗原固定化之前，LPS在乙酸钠pH 4.0中稀释，比例依赖于沙门氏菌血清变型(参见内容)并固定32min。然后，葡聚糖-基质和抗原之间的键接通过以2μl/min流速持续20min注入溶解在10mM乙酸钠pH4的100mM氰基硼氢化钠加以稳定。对于成功LPS固定化程序的指示的相对响应为对于含15％(m/m)蛋白质的62.5μg/ml LPS溶液为2kRU，而对于含50％(m/m)蛋白质的250μg/ml LPS溶液为9kRU。
1.2.5SPR生物传感器测定 光学SPR生物传感器测定在由如上所述的相同软件控制的Biacore 3000 SPR生物传感器平台上进行。在注入之前，血清在含1.0％(m/v)羧甲基化葡聚糖钠盐、1.0M氯化钠和0.05％(m/v)Tween80的HBS-EP缓冲液中以1∶50(v/v)比率或如文中指定的其他方式稀释。混合物在环境温度下孵育至少2min。猪血清以40μl/min注射2min，而鸟类血清根据指定的5μl/min或20μl/min注射2min。
芯片的再生以恢复传感器表面的抗原活性利用15-s脉冲的6mM甘氨酸pH 2实现，其含有6M盐酸胍、0.1％(m/v)CHAPS、以及0.1％(v/v)的各个Tween-20、Tween-80和Triton X-100。这之后是利用以0.05％(m/v)CHAPS(终浓度)富集的HBS-EP运行缓冲液以100μl/min持续12s的第二个再生步骤。
1.2.6单糖分析 三甲硅烷基化(甲基酯)甲基糖苷由聚糖样品通过甲醇分解(1.0M甲醇HCl，24h，85℃)而制备，接着再-N-乙酰基化和三甲硅烷基化，然后如[Kamerling JP，Vliegenthart JFG(1989)]所述通过气相色谱/质谱进行分析。定量分析通过在毛细EC-1柱(30m×0.32mm，Alltech)上的气相色谱进行，利用以4℃/min从140℃至240℃的温度程序以及火焰离子化检测操作的Chrompack CP 9002气相色谱。单糖衍生物的鉴定通过在装配有AT-1柱(30m×0.25mm，Alltech)的Fisons Instruments GC 8060/MD 800系统(Interscience)上的气相色谱/质谱加以确认。
结果 LPS分离 为了生产LPS，细菌细胞的收率和LPS的收率对于琼脂板培养物和肉汤中的沙门氏菌生长进行比较(表4)。由于实验室技术原因，决定从琼脂板收获细菌，而不是从培养瓶分离细胞。从Se、Sg、Sl、Sm和St分离LPS的结果分别概括在表5至9中。良好定义的LPS的标准化分离对于成功且有力的血清学测定是决定性的。为了确保测定性能，批次之间的差异应当保持最小。由于这个原因，生产了来自每一个Se、Sg、Sl、Sm和St提取的多批次LPS。LPS的回收很大程度上依赖于LPS提取期间混合物中的最终TCA浓度(参见表6和表8)，尽管这种关系对于从St提取LPS不是完全清楚(表9)。事实上，通过试验大范围的TCA浓度，对于每一种LPS类型不能确定精确的最佳TCA浓度。这里，最佳TCA将产生最高LPS量，并且给出最高特异性血清学响应和最低非特异性生物传感器响应。在这个研究中，作为对于从不同沙门氏菌血清型的LPS提取的“最佳”选择的TCA浓度是基于在渗析后的最终LPS收率，并且作为终浓度对于Se、Sg、Sl、Sm和St分别为0.12M、0.25M、0.25M、0.25M和0.25M。
表4从作为在容纳所谓营养肉汤#2(肉汤)的生物反应器中的悬浮液或在BHI琼脂板(琼脂)上生长的肠炎沙门氏菌细胞回收LPS。LPS利用指定的TCA终浓度进行分离。LPS相对于分离细胞的量的收率在最后一栏中指出。
*含TCA的混合物的pH是无关的； **一些材料在样品运行工艺期间损失。
表5在BHIa板上生长的肠炎沙门氏菌细胞的回收。LPS利用0.12M TCA终浓度(参见表4)进行分离。Rec回收的。

表6在BHIa板上生长的黄金海岸沙门氏菌细胞的回收。LPS利用指定的TCA终浓度进行提取。Rec回收的。

a提取混合物中的TCA终浓度。
b大约生产的1/3在运行期间损失。
表7在BHIa板上生长的利文斯通沙门氏菌细胞的回收。LPS利用0.250M TCA终浓度进行提取。Rec回收的。

表8在BHIa板上生长的火鸡沙门氏菌细胞的回收。LPS利用指定的TCA终浓度进行分离。Rec回收的。

a提取混合物中的TCA终浓度。
b批次Sm2003.1至2003.2组合到单个批次，称为Sm2003.1。
表9在BHIa板上生长的鼠伤寒沙门氏菌细胞的回收。LPS利用0.250M TCA终浓度进行分离。Rec回收的。

a提取混合物中的TCA终浓度。
b批次St2003.2至St2003.4b组合到单个批次，称为St2003.2。
分析分离的LPS制剂的单糖组成以显示对于来自不同沙门氏菌生长的LPS的分离和纯化程序的一致性。必须注意，分析是在备用于氧化的LPS制剂上进行的，因此用在确定用于测试的LPS批次的最佳水平下(参见以下)的Hb强化。用于这个目的，GC-FID和GC-MS分析在Hb-强化的LPS制剂的甲醇分解之后实施(表10至表14)。这些结果表明Hb对最终LPS制剂中的大量糖类(carbohydrate)没有贡献。BHIa的分析表明仅存在半乳糖(Gal)和葡萄糖(Glc)。这些单糖的含量为5.6μg/mg干BHIa。沙门氏菌LPS制剂的分析证实，依照它们的糖类结构，存在Gal、Glc、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、丙三氧基-甘露-庚糖(Hep)、2-酮-3-脱氧-辛酸(KDO)、甘露糖(Man)和鼠李糖(Rha；6-脱氧-甘露糖)。它们的相对出现率表示为相对于1.0Man(作为PS区域的一部分)或相对于3.0Hep(作为核心区域的一部分)的摩尔比。然而，应当注意，核心区域包含2或3个Hep残基。此外，GlcNAc可起源于如在Sl LPS的重复单元的GlcNAc，或者起源于葡糖胺(GlcN)，其作为用于附着脂质的骨架的脂质A部分中的二糖出现。Gal出现在核心区域，其在所有肠道沙门氏菌血清变型中是保守的以及在Se、Sg、St和Sm的PS区域中也是保守的。在这些情况下，Gal的摩尔比预期为超过1.0Man，除了Sg，其中每一个重复单元包含2Man残基。单糖分析不包括检测O-乙酰化的磷酰基-乙醇胺化或磷酸化的组分，也不包括检测阿比可糖(Abe；3，6-二脱氧-木六糖)或泰威糖(Tyv；3，6-二脱氧-阿拉伯糖)，其出现在多糖以及分离的LPS类型的核心区域中。
Se LPS分析表明，Gal、Man和Rha分别以摩尔比1.4、1.0和1.2出现在批次Se2003.1中，而这个比率在批次Se2003.4中分别为1.1、1.0和0.9(表5)。这个比率良好符合作为[Tyv-]Man-Rha-Gal的重复单元的组成，只是Rha比率在批次Se2003.1中显著太高。相比于批次Se2003.1的123μg，基于确定的单糖计算的糖类含量在批次Se2003.4中显著更高，即241μg。考虑到在脂质A中出现2个GlcN残基和在核心区域中出现单个GlcNAc残基以及在每一个重复单元中出现单个Man残基，重复单元的数量在批次Se2003.1和Se2003.4中估计分别为19和20。
氧化的Se2003.1的单糖分析清楚地表明与未氧化的相同批次的显著差异(表10)。与两个GlcN残基相反，预期非还原性、末端GlcNAc残基用于更大部分氧化。醛醇衍生物没有通过所采用的单糖分析进行检测，并且对应量的GlcNAc-醇没有确定。由于重复单元中的Gal和Man对于高碘酸盐氧化不是敏感的，所以在氧化的批次中Man的摩尔比被标准化成未氧化批次中的Man的摩尔比。应当注意，核心区域中的两个Gal残基对于氧化是敏感的，因而总Gal比率受到影响。Se LPS分子结构检查表明，除了末端GlcNAc和核心Gla外，末端KDOII-KDOIII二糖、以及轭合的HepI和末端HepIII也对高碘酸盐氧化敏感。事实上，这些单糖残基的摩尔比表明损失一个Hep残基和大约1.6KDO残基。应当注意，KDOII在该残基与磷酰基-乙醇胺基团轭合时可以不被完全氧化。
表10肠炎沙门氏菌LPS以及氧化的肠炎沙门氏菌LPS的单糖分析。LPS用15％(m/m)的Hb强化。摩尔比基于在核心和脂质A区域(称为CORE)存在的两个GlcN和一个GlcNAc残基(检测为三个GlcNAc残基)以及基于重复单元(称为UNIT)中的一个Man残基进行确定。标准化的GlcNAc和Man残基通过下划线标出。糖类含量在0.5mg LPS制剂中确定，只是单糖分析在125mg氧化的材料上进行。

a不包括Tyv残基的贡献； b分析的含LPS材料的量没有准确确定。
相比于Se LPS，Sg LPS的单糖分析表明，LPS结构较小，因为重复单元的数量显著更低(表11)。核心Gal对PS Gal的相对贡献因为该原因而更大，并且总摩尔比发现为1.5。以类似方式，Glc的摩尔比发现为1.3(批次Sg2003.2)和1.5(批次Sg2003.3)，而Rha的摩尔比与预期的结构相符。然而，批次Sg2003.2看起来包含更少的末端HepIII和末端KDOIII，并因此可以提供用于固定化至传感器芯片的更少可能性。
表11从用50％(m/m)的Hb强化的黄金海岸沙门氏菌分离的LPS的单糖分析。摩尔比基于在核心和脂质A区域(称为CORE)存在的两个GlcN和一个GlcNAc残基(检测为三个GlcNAc残基)以及基于重复单元(称为UNIT)中的两个Man残基进行确定。标准化的GlcNAc和Man残基通过下划线标出。糖类含量在0.5mgLPS制剂中确定。

a不包括Abe残基的贡献； 来自Sl LPS单糖分析结果(表12)的核心残基数的标准化受到PS的重复单元中出现的GlcNAc的阻碍。当Hep残基的数量设定在3.0时，KDO残基数量的不可接受的过量估计升高。因为此，Hep的数量设定在2.0，但可能需要修饰，以使KDO数量更接近3.0。由于每一个重复单元中的Man残基数是4，所以摩尔比校正为4.0Man残基。基于PS区域中的Man/GlcNAc的摩尔比4∶1，重复单元的数量基于剩余核心GlcNAc和脂质A GlcN残基进行计算。这种计算表明，Sl中的重复单元数也相对较小，即在批次S12003.1和批次S12003.2中分别为8和10个单元。
表12从用50％(m/m)的Hb强化的利文斯通沙门氏菌分离的LPS的单糖分析。摩尔比基于在核心(称为CORE)存在的两个Hep残基以及基于重复单元(称为UNIT)中的四个Man残基进行确定。标准化的GlcNAc和Man残基通过下划线标出。糖类含量在0.5mgLPS制剂中确定。n.d.没有检测。

表13火鸡沙门氏菌LPS的单糖分析。批次Sm2003.1和Sm2003.3利用50％(m/m)Hb强化。摩尔比基于在核心和脂质A区域(称为CORE)中存在的两个GlcN和一个GlcNAc残基(检测为三个GlcNAc残基)以及基于在重复单元(称为UNIT)中的一个Man残基加以确定。标准化GlcNAc和Man残基通过下划线表示。在0.5mg LPS制剂中确定糖类含量。

a不包括O-乙酰基的贡献，其可以附着于重复的Gal残基。
依照包含Man-Rha-Gal重复单元的分子结构，Sm LPS的单糖分析(表13)表现出与S1 LPS完全不同的组成。如上所述，对于Gal的摩尔比部分地通过核心区域中Gal残基的贡献而高于重复单元中预期的1.0。
同样，对于Glc、Man、Rha和Gal预期等摩尔比，因为这些残基在St LPS中形成重复单元(表14)。这里应当注意，阿比可糖(abequose)也是重复单元的一部分，但不在所采用的分析中。然而，批次St2003.2包含更少可氧化的Hep和KDO，这可能影响来自这种制剂的LPS的固定化效力。另一方面，批次St2003.2包含比批次St2003.1多得多的糖类，即在0.5mg LPS中分别相对154μg为249μg。
表14鼠伤寒沙门氏菌LPS的单糖分析。批次St2003.1和St2003.2分别用15％(m/m)和25％(m/m)的Hb强化。摩尔比基于在核心和脂质A区域(称为CORE)中存在的两个GlcN和一个GlcNAc残基(检测为三个GlcNAc残基)以及基于在重复单元(称为UNIT)中的一个Man残基加以确定。标准化GlcNAc和Man残基通过下划线表示。在0.5mg LPS制剂中确定糖类含量。

a不包括(O-乙酰基)Abe残基的贡献。
LPS的蛋白质支持固定化 出乎意料地，完整LPS通过其KDO-羧酸功能(官能团)较差地偶联至EDC/NHS-活化的羧甲基化葡聚糖，并且没有观察到参考血清的显著响应。为了改善LPS与传感器芯片的固定化，将LPS利用高碘酸钠氧化以在其糖类组分中生成反应性醛基，这将允许所述的醛偶联程序，即醛与酰肼官能团缩合成腙键接，之后还原成酰肼产物。在没有氧化下，LPS真正具有很小的固定至用碳酰肼涂覆的CM5芯片的表面的潜力(结果未示出)。
然而，氧化的LPS的偶联获得与参考血清失望的反应性，可能是抗原未充分固定化的结果。商购的从肠炎沙门氏菌苯酚提取的LPS(完整或去毒的(即脂质A的切割))当在氧化之后固定化时获得低的响应，即分别为187RU和167RU。然而，必须注意到，除了较差的偶联外，氧化可能已破坏了一部分的抗原结构，这可能获得较差的血清学响应。氧化的程度通过Se LPS的单糖分析进行考察(表10)。该分析表明，KDO、Hep和GlcNAc(其是核心区域的组分但不是PS部分中的重复抗原单元的组分)的相对量相比于未氧化的Se LPS显著减少。重要的是，PS的单糖残基部分以及由此的抗原结构明显地在所采用的温和氧化条件下保持完整。
表15在流过芯片表面上的参考抗血清的固定化和响应之后的生物传感器响应，其是在15％(m/m)猪Hb的存在下利用氧化和未氧化的Se或St LPS制备的。

a测试了针对指示的O抗原的抗血清。
表16在流过芯片表面上的参考抗血清的固定化和响应之后的生物传感器响应，其是在7％(m/m)指定蛋白的存在下利用氧化的St LPS(批次St2003.1)制备的。

a固定化水平； b将BSA加入到氧化且脱盐的LPS中； cLPS的固定化认为是对于进一步参考血清分析太低。
为了优化LPS的结合并由此改善来自血清的结合抗体的检测，然后在蛋白质存在下执行LPS的氧化以允许通过LPS的蛋白质性质的胺和醛官能团之间的希夫碱反应形成蛋白质-LPS复合物。事实上，商购获得的TCA提取的Se LPS，包含相当大量的细菌蛋白质，相比于在208RU的苯酚-提取的离子交换色谱纯化的Se LPS，获得在562 RU的改进的固定化。
LPS的氧化是必需的，因为包含未氧化的LPS和蛋白质的混合物表现出相对高的固定化水平但不显著的特异性响应(表15)。另外，蛋白质加入仅在LPS氧化之前是有益的，因为BSA加入到氧化且脱盐的St LPS获得可接受的固定化水平，但没有预期的血清学响应(表16)。以类似方式，Hb产生相对高的固定化水平，但没有血清学响应，如所预期的(结果未示出)。
为了方法改进的目的，对于进一步的考察，选择在恒温脊椎动物物种和血清学合适基质中存在的之间的初级和次级结构具有相对高的同源性程度的蛋白。为此，将小鸡卵白蛋白、猪血红蛋白、牛血清白蛋白或猪肌红蛋白强化(7％，m/m)的St LPS的性能进行比较(表16)。血红蛋白获得固定化水平的明显的最佳改进以及最佳预期的抗原-抗体反应性外形。在Hb存在下，尤其是O12、polyO A-S和C-St参考血清获得更好的响应。
该实验使用批次Se2005.1、Sg2005.1、S12005.1和St2005.1，在加入表17至20中指定水平的BSA、Hb和Mb下进行重复。这时，O4和O5结合至固定化的St LPS，如所预期的(表20)。概括在表16至20中的这些结果的评价表明，当同时考虑每种LPS类型的所有预期响应时，相比于BSA和Mb的加入，Hb的加入获得最高特异性的响应。此外，在大多数情况下，利用Hb作为支持性蛋白质出现的标准偏差比加入BSA和Mb的情况更有利。因此，选择血红蛋白用于进一步的实施。
观察到O poly A-S抗血清可能含有低的抗血清组C1和C2效价，如在测试固定化Sg LPS(表18)和Sl LPS(表19)的情况下发现相对较低响应。
表17在流过芯片表面上的参考抗血清的固定化和响应之后的生物传感器响应(响应单位，RU)，其是利用在15％(m/m)指定蛋白存在下氧化的Se LPS制备的。这些值校正用于C-SPF响应，其也列出。标准偏差在括号中指出(N＝5，除了小鸡和猪血清N＝4)。

a固定化水平。
表18在流过芯片表面上的参考抗血清的固定化和响应之后的生物传感器响应(响应单位，RU)，其是在50％(m/m)指定蛋白存在下利用氧化的Sg LPS制备的。这些值校正用于C-SPF响应，其也列出。标准偏差在括号中指出(N＝5，除了小鸡和猪血清N＝4)。

a固定化水平。
表19在流过芯片表面上的参考抗血清的固定化和响应之后的生物传感器响应(响应单位，RU)，其是在50％(m/m)指定蛋白存在下利用氧化的Sl LPS制备的。这些值校正用于C-SPF响应，其也列出。标准偏差在括号中指出(N＝5，除了小鸡和猪血清N＝4)。

a固定化水平。
表20在流过芯片表面上的参考抗血清的固定化和响应之后的生物传感器响应(响应单位，RU)，其是在15％(m/m)指定蛋白存在下利用氧化的St LPS制备的。这些值校正用于C-SPF响应，其也列出。标准偏差在括号中指出(N＝5，除了小鸡和猪血清N＝4)。

a固定化水平。
利用肠炎沙门氏菌LPS(批次Se2003.1)、黄金海岸沙门氏菌(批次Sg2003.2)、利文斯通沙门氏菌(批次S12003.1)、鼠伤寒沙门氏菌(批次St2003.1)和火鸡沙门氏菌(批次Sm2003.1)的聚集(凝集)血清的固定化水平和预期反应性表明了与在氧化之前加入的Hb的量相关(参见例如图3)。还发现，对于沙门氏菌血清变型特异性LPS类型，最佳Hb浓度也是生产批次依赖性的。
在利用一板标准和参考对照血清的预期抗原谱的最大响应的引导以及在来自禽鸟SPF参考血清的低响应的引导下，确定了用于每一种类型和每一个批次的LPS的最佳Hb浓度(表21)。在本文中，氧化的含血红蛋白LPS制剂进一步称为LPSox-Hb制剂。
应当注意，在任何实验中，固定化水平与血清学响应不相关，而是与加入的Hb量相关。
表21血红蛋白和LPS浓度对来源于肠炎沙门氏菌(Se)和鼠伤寒沙门氏菌(St)的LPS的最终固化水平的影响。

aHb相对于LPS的浓度； b在单独传感器通道上制备的。
在相对于LPS存在10％(m/m)或15％(m/m)Hb下，在氧化之前Se LPS和St LPS稀释的效果分别进行考察(表21)。这些结果没有清楚地表明在LPS浓度和偶联水平之间的相关性。
表22LPSox-Hb的固定化水平与O抗原抗血清和禽鸟对照血清的血清学响应之间的关系。预期的血清学响应的范围加上绿色阴影并且该范围内的值加下划线。对照血清在含HBS-EP的0.5M氯化钠和0.5％(m/v)羧甲基化葡聚糖中稀释。

LPS的稳定性和固定的耐用性 测试了LPS固定化的再现性和重复性以及参考血清的特异性响应。将Se、Sg、Sl和St LPS制剂在它们相应的最佳Hb浓度存在下进行氧化，脱盐，然后在4℃阴暗下储存在溶液中。在相同条件下，但考虑了通常在生物传感器表面处对于分子固定化观察到的变化，在储存两个月之后，氧化的LPS的固定化水平在Sl(5％RSD)和St(8％RSD)批次的情况下是相当的，或者在Se(13％RSD)和Sg(8％RSD)批次情况下趋于增大(表23至表26)。参考血清的响应也在制备的生物传感器芯片上进行探测。这些考查没有显示在固定化水平和特异性响应之间的关联性。例如，Se LPS和Sg LPS的固定化水平可能随着时间趋于增大；这种增大没有反映在血清抗体与固定化抗原的结合的响应中。相对标准偏差在12％和38％之间变化。当考虑到首先的3个测量日(第0天、第7天或第10天，以及第14天或第17天)，该变化显著从3.5％降到23％(结果未示出)。表27至30概括了在一个12个月期间内的多个时刻，该方法的重复性。在每一个分析时间点，新鲜的Hb-强化LPS的等分试样被氧化、固定和分析，由此反映多个步骤的变化的总和。
表23利用LPSox-Hb Se2003.1在第0天制备并储存在5-8℃下的凝集和参考抗血清的响应。LPS制剂在指定的天数氧化之后进行固定和测试。

表24利用LPSox-Hb Sg2003.2在第0天制备并储存在5-8℃下的凝集和参考抗血清的响应。LPS制剂在指定的天数氧化之后进行固定和测试。

表25利用LPSox-Hb S12003.1在第0天制备并储存在5-8℃下的凝集和参考抗血清的响应。LPS制剂在指定的天数氧化之后进行固定和测试。

表26利用LPSox-Hb St2003.1在第0天制备并储存在5-8℃下的凝集和参考抗血清的响应。LPS制剂在指定的天数氧化之后进行固定和测试。

表27在指定时间点(以月计)新氧化的Se LPS(批次Se2003.1)的响应。LPS分离自细菌细胞，用15％(m/m)Hb强化，干燥并储存在4-7℃下直至氧化、固定化和分析日。

a血清按1∶50(v/v)稀释； b血清按1∶100(v/v)稀释； cLPS按另一体积比稀释。
表28在指定时间点(以月计)新氧化的Sg LPS(批次Sg2003.2)的响应。LPS分离自细菌细胞，用50％(m/m)Hb强化，干燥并储存在4-7℃下直至氧化、固定化和分析日。

表29在指定时间点(以月计)新氧化的Sl LPS(批次S12003.1)的响应。LPS分离自细菌细胞，用50％(m/m)Hb强化，干燥并储存在4-7℃下直至氧化、固定化和分析日。

表30在指定时间点(以月计)新氧化的St LPS(批次St2003.1)的响应。LPS分离自细菌细胞，用15％(m/m)Hb强化，干燥并储存在4-7℃下直至氧化、固定化和分析日。

a血清按1∶100(v/v)稀释； b氧化后，含LPS的溶液稀释两次而不是稀释一次。
实施例2 用于检测反映肠炎沙门氏菌感染的蛋黄抗体的SPR生物传感器 引言 沙门氏菌是人类细菌性肠胃炎的主要病因之一(Fischer，2004；van Duynhoven et al.，2005)。在荷兰，在1994-1998之间，肠炎沙门氏菌亚属血清变型(Salmonella enterica serovar enteritidis)(S.e.)是最经常分离的血清变型(Pelt et al.1999)。在这种血清变型中，蛋和蛋产品是感染的最重要来源。尽管采取了多种控制措施，但是大约9％的荷兰下蛋母鸡群每年被感染。由于具有沙门氏菌的蛋污染对公共健康的持续的威胁，所以尽可能快地通过适当监督程序来检测种群感染是非常重要的。
目前荷兰下蛋母鸡的监控系统是基于血清学的(Bokkers，2002)。目的是减少S.e.和鼠伤寒沙门氏菌在下蛋母鸡部分中蔓延。然而，取样仅发生两次在下蛋期之前和结束时。因此，目前的监督程序不能检测在下蛋期过程中的所有鸡群感染，并且农场主不能“保证”它们的产品是来自无沙门氏菌的下蛋母鸡。
因此，监督程序应当进行改进。作为目前的血清学的替换，可以对蛋的抗体进行测试。蛋取样具有这样的优点，其可以在蛋包装植物上进行，以高的取样频率和大的样品尺寸。
之前已经开发并使用了用于检测蛋中的抗体的试验。现有试验经常基于酶联免疫吸附测定(ELISA)，使用沙门氏菌属的不同抗原成分(的组合)(参见例如Refs.Gast et al，2002 and 1997；Skov et al，2002；Holt et al，2000；Desmidt et al.，1996；Sachsenweger et al.，1994；Van Zijderveld et al.，1992)。最近，用于检测体液响应的生物传感器的可能合适性已得到认可(Bergwerff and van Knapen，2006，；Bergwerff and van Knapen，2003；Jongerius-Gortemaker，2002；Pyrohova et al.，2002；Vetcha et al.，2002；Li et al.，2002；Liu et al.，2001；Uttenthaler et al.1998)。生物传感器由“传感(感测，sense)”分析物的可再利用固定化生物配体和物理转换器(其将这种现象翻译成电子信号)构成(Jongerius-Gortemaker et al.，2002)。生物传感器的使用使得高通量分析具有可能，以及在单次运行中可以检测在感染性致病剂(或针对这些试剂的抗体)家族内的多个血清变型或血清组。这提供了改进监督程序的机会，因为更多样品可以在下蛋期期间以更高频率进行测试。
这个实例评价了基于肠炎沙门氏菌亚属血清变型，在蛋黄中表面等离子体谐振(SPR)生物传感器(biacore 3000)抗体检测试验的灵敏度、特异性和区分能力，并将该结果与利用用于通过生成并分析接收机运行特征(ROC)曲线的蛋-抗体检测的g，m鞭毛蛋白基商业ELISA试验试剂盒和LPS基商业ELISA试验试剂盒获得的结果进行比较。
2.材料和方法 2.1SPR传感器方法 我们使用了针对肠炎沙门氏菌的血清抗体的表面等离子体谐振生物传感器(biacore 3000 by Biacore AB，Uppsala，Sweden)检测方法，利用通过将本文描述的本发明应用于蛋黄的LPS抗原。在分离蛋黄和蛋白之后，将蛋黄在包含3mM EDTA、0.15M氯化钠、0.005％(v/v)表面活性剂P20(Biacore AB，Sweden)、以及另外的0.85M氯化钠(Merck，Darmstadt，Germany)、1％(m/v)羧甲基化葡聚糖(Fluka Chemie，Buchs，Germany)和0.05％(v/v)Tween 80(Merck，Germany)的10mM HEPES缓冲液pH 7.4中以1∶5(v/v)稀释。将其与玻璃珠混合，在环境温度下以15,000g离心25min；在0.45-μm滤器上(Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)过滤上清液。
第二个改变是清洗传感器芯片。在每一15个蛋黄样品系列的分析之后，注入含0.5％(w/v)十二烷基磺酸钠(Biacore AB，Sweden)的溶剂以除去沉积的蛋黄成分。
2.2参考血清和蛋黄 在各个试验中使用血清作为参考，因为良好限定的参考蛋黄的样品原液不可获得。来源于用a)肠炎沙门氏菌、b)鼠伤寒沙门氏菌、c)婴儿沙门氏菌或d)鸡瘟沙门氏菌感染的小鸡的冻干限定SPF和参考血清获自Animal Health Service Ltd.(Deventer，Netherlands)。这些血清制备自集合的血清或血清库。在使用之前，冻干血清在1ml Milli-Q中重建。另外地，使用单克隆小鼠抗-沙门氏菌抗体抗-(血清)组B、抗-血清组C、抗血清组D和抗血清组E(Sifin，Berlin，Germany)。
使用内部对照蛋黄来建立生物传感器测定的分析灵敏度和可重复性。它们由无特异性病原体(SPF)蛋黄样品(Animal HealthService Ltd.，Netherlands)和来自实验2高度免疫响应性排卵前滤泡样品构成(参见下文部分2.4)。
2.3ELISA 样品利用夹心酶免疫分析技术进行测定。使用了两种可商购的S.e.抗体检测试剂盒；Flockscreen S.e.Guildhay(Guildford，England)以及FlockChek S.e.IDEXX(Westbrook，Maine，USA)。样品根据公司程序步骤进行分析。
Guildhay S.e.间接ELISA基于LPS作为抗原。微滴定板的孔用LPS涂覆，一次加入样品的1∶500稀释液。试验结果根据以下公式表示为S/P比值
S/P比值利用以下标准进行解释蛋黄S/P≤0.08＝免疫-阴性；0.08＜S/P＜0.25＝免疫-可疑；S/P≥0.25＝免疫-阳性。
IDEXX S.e.竞争性ELISA基于g，m鞭毛蛋白抗原。微滴定板的孔用g，m鞭毛蛋白抗原涂覆，一次加入样品的1∶2稀释液。结果表示为如下的S/N比值
S/N比值使用以下标准进行解释蛋黄S/N≥0.75＝免疫-阴性；0.75＜S/N＜0.59＝免疫-可疑；S/N≤0.59＝免疫-阳性。
2.4实验 在该研究中使用的蛋样品来源于两个感染实验。
实验1将15只一周龄下蛋母鸡(Isa Brown)在负压高效空气微粒过滤(HEPA)分离器中进行图养，其中分离器的体积为1.3m3并配有1.1m2的金属丝地板，并采用12h光至12h黑暗的光周期规律。分离器以大约30m3/h的速率通风。在生长期期间，从垫层(被褥)没有培养沙门氏菌。小鸡提供有非医疗饲料以及随意的水。依照荷兰关于实验动物的规定，由荷兰动物卫生服务有限公司的研究动物实验委员会批准之后，对它们进行圈养、处理和治疗。利用肠炎沙门氏菌CL344(Animal Health Service Ltd.，Deventer，TheNetherlands)，在实验的第20周中，所有母鸡以1x108CFU/只口服一次进行接种。在接种之前和之后，在每天的基础上收集蛋，但没有单个地进行标记和没有标记日期。将蛋储存在环境温度下达四周接着储存在4℃。实验在第22周结束并产生147个“阳性”样品和71个“阴性”样品。
实验2该实验由Van Eerden et al.(2005，in prep)等详细描述。简而言之，将128只15周龄下蛋母鸡(Lohmann Brown，16只鸡，8倍重复)分成两组(每组8只鸡)并在两种气候小室，用作分离器，在相同房间中，以9h光和15h黑暗光周期规律单个地进行圈养。在生长期直至接种的期间，从粪便没有培养(或发现)沙门氏菌。它们提供有非医疗饲料和随意的水。该动物实验根据Wageningen大学的动物实验规程的指导执行并以参考号2003219由伦理委员会批准。64只母鸡(16只，4倍重复)中的每一只在实验开始之后一周以1x108CFU萘啶酸抗性S.e(ASG，Lelystad，the Netherlands)口服一次进行接种。另外64只认为是未感染的对照。在接种后第21天和第28天收集蛋。12次，来自一种气候小室的蛋在壳破碎后收集并集合(参见以下部分2.5)。集合的蛋样品中的4个取自“未感染”气候小室。除了集合的蛋样品的收集外，10个蛋样品取自10只单独的鸡，其中7只是未感染的。蛋黄和蛋清混合并储存在-20℃下。该实验在接种后4周结束。然后从8只未感染鸡个体和5只感染个体收集排卵前滤泡。
2.5蛋样品的制备 来自实验1的蛋以以下方式进行制备。为了有利于无菌制备，将蛋壳用70％(v/v)乙醇水溶液消毒。接着，将蛋破碎，并在无菌培养皿中收集蛋黄。使用无菌一次性注射器收集1ml体积的蛋黄并分成200μl的小部分。每一个部分用适于SPR生物传感器或ELISA分析的缓冲液进行稀释，然后储存在-20℃下。
同样，集合的蛋黄和蛋清以及获自实验2的排卵前滤泡进行划分，稀释并储存在-20℃下。
2.6SPR生物传感器方法的评价 2.6.1分析灵敏度和特异性 为了建立分析的检测限，通过SPR生物传感器一式三份地分析八个1∶2(v/v)高度免疫响应性蛋黄样品和SPF阴性对照样品系列稀释液。利用SPSS(SPSS for Windows，Standard Version，1999)进行方差分析(ANOVA)以评价在注入系列稀释的对照样品之后获得的SPR生物传感器响应的差异。
参考血清用来增强(spike)SPF蛋黄以测试SPR生物传感器测定的特异性。为此，将蛋黄用1)肠炎沙门氏菌(血清组D)、2)婴儿沙门氏菌(血清组C)、3)鸡白痢沙门氏菌(血清组D)、和4)鼠伤寒沙门氏菌(血清组B)反应性抗血清增强。这些样品按它们的体积以1∶100(1、2和3)或以1∶50(4)比率进行稀释。进一步的特异性测试通过用1∶100(v/v)稀释的与沙门氏菌血清组B、C、D和E反应性的小鼠单克隆抗体增强SPF蛋黄实施。
2.6.2可重复性 SPR生物传感器测定的可重复性通过在单日和连续三日(三份(in triplo))上运行高度免疫响应性蛋黄样品和SPF阴性对照蛋黄样品两次而进行评价。平均值、标准偏差(SD)和方差的百分比系数(％CV)值在Excel 2000(Microsoft software package)中进行计算。
2.6.3ROC曲线 接收机运行特征(ROC)曲线利用来自SPR生物传感器和ELISA分析的结果产生以评价每一个测定的性能(Zweig andCampbell，1993)。利用SPSS，每一个测定的总准确性根据曲线下方的积分面积(AUC)进行计算，对应的标准误差(SE)和真实AUC的零假设概率为0.5。通过使用非参数性ROC分析(Metz et al.，1998)，将针对S.e.的抗体的SPR生物传感器测定检测的准确性与两个ELISA的准确性进行比较。黄金标准(gold standard)是实验组的感染状态。
2.6.4诊断灵敏度和特异性 在ROC曲线中，真实正比率(灵敏度)对于参数的不同截止点以错误正比率(100-特异性)的函数绘图。ROC曲线上的每一个点代表对应于特定决定阈值的灵敏度/特异性对。因此，在对于SPR生物传感器测定和两个ELISA的最高诊断特异性处的最大诊断灵敏度利用SPSS进行计算。对于使用来自实验1的样品的SPR生物传感器试验，还计算了在最高诊断灵敏度以及最佳组合诊断灵敏度和特异性的最大诊断特异性。
3.结果 3.1分析灵敏度和特异性 高度免疫响应性蛋黄样品的1∶640(v/v)稀释液在50RU是测试的最高稀释度，其显著不同于阴性对照(P＜0.001)。
利用肠炎沙门氏菌(1∶100，145RU)、鸡白痢沙门氏菌(1∶100，1012RU)或鼠伤寒沙门氏菌(1∶50，58RU)阳性血清增强的SPF蛋黄的试验信号高于53RU的最优化截止值(参见以下部分3.4.1)并且认为是阳性的，如同利用小鼠抗-沙门氏菌组D(1∶100，130RU)强化的SPF蛋黄。发现未增强的SPF蛋黄是阴性的，即平均响应为30RU。利用婴儿沙门氏菌(1∶100，24RU)阳性血清和针对沙门氏菌血清组B(1∶100，27RU)、C(1∶100，16RU)和E(1∶100，15RU)的小鼠抗血清强化的蛋黄也低于该截止值。
3.2可重复性 在单日内的变化系数对于高度免疫响应性蛋黄样品为1％，而对于阴性样品为13％。来自在三天期间的每天之间的变化系数对于阳性样品为2％，而对于阴性样品为17％。
3.3阈值确定 3.3.1ROC分析 ROC分析在分别来自实验1的未感染和感染小鸡的71个和135个蛋黄样品的测定结果上实施(不是所有试验都在来自感染小鸡的12个样品上进行)。
ROC曲线下方的积分面积对于SPR生物传感器测定为0.892(SE 0.024，P＜0.001)；对于IDEXX ELISA为0.432(SE 0.039，P＝0.103)而对于Guildhay ELISA为0.430(SE 0.039，P＝0.096)(表31)。ROC曲线示于图4中。对于SPR生物传感器测定的积分面积(AUC)、以及由此的总准确性显著大于IDEXX(Z＝11.5，P＜0.001)和Guildhay ELISA(Z＝10.5，P＜0.001)。
还对于来自实验2的未感染小鸡的4个组合的蛋清和蛋黄样品以及15个蛋黄样品、以及感染小鸡的8个组合的蛋清和蛋黄样品以及8个蛋黄样品进行ROC分析。ROC曲线下方的积分面积对于SPR生物传感器测定为0.811(SE 0.082，P＝0.002)、对于IDEXXELISA为0.615(SE 0.098，P＝0.098)而对于Guildhay ELISA为0.870(SE 0.064，P＜0.001)(表32和图5)。SPR生物传感器测定的AUC显著(Z＝1.9，P＝0.055)大于IDEXX ELISA，但与GuildhayELISA(Z＝-1.0，P＝0.322)没有差异。
3.4性能评估 3.4.1诊断灵敏度和特异性评估 对于从实验1获得的样品的结果，来自未感染种群的样品给出范围在6至50RU的生物传感器响应。来自感染种群的样品的响应范围在11至3584RU。在52RU的截止值处，135个样品中的24个认为是免疫阴性的。
对于SPR生物传感器测定试验，52RU的截止值产生100％的最高可能诊断特异性估值(其中95％精确置信区间(CI)95-100％)以及82％的诊断灵敏度估值(95％CI76-98％)。10RU的截止值产生100％的最高可能诊断灵敏度估值(95％精确CI97-100％)以及1％的特异性估值(95％CI0-4％)。42RU的截止值产生最佳组合的诊断灵敏度和特异性分别是84％(95％CI77-90％)和99％(95％CI96-100％)。
在OD550nm 0.11的截止值处，IDEXX ELISA具有100％的诊断特异性和1％的灵敏度(95％CI0-3％)。来自未感染种群的样品的OD550nm的范围为0.174至1.377，即超过在0.11的截止值。在阳性种群中，147个样品中的145个在所选截止值处必须认为是免疫阴性的，即对应的OD550nm的范围为0.042至1.572。Guildhay ELISA在OD650nm 0.12的截止值处具有100％的诊断特异性和16％的灵敏度(95％CI10-22％)。没有来自未感染种群的样品表现出超过0.12(0.051至0.093)的OD650nm值。在阳性种群的情况下，147个样品中的124个必须认为是免疫阴性的。这些样品的OD650nm范围为0.048至1.471。
在实验2的情况下，542RU的截止值对于SPR生物传感器测定试验产生100％的最高可能诊断特异性估值(95％精确CI82-100％)和63％的诊断灵敏度估值(95％CI39-86％)。来自未感染种群的样品的RU值的范围为101-448。感染种群的值范围为117-3012，并且16个样品中的6个具有阴性试验结果。在OD550nm0.49的截止值处，IDEXX ELISA具有100％的诊断特异性和19％的灵敏度(95％CI0-38％)。没有来自未感染种群的样品的OD550nm值低于0.49。这些值的范围为0.537-1.621。在阳性种群中，16个样品中的13个在所选截止值处具有阴性试验结果。这些值的范围为0.134-1.630。Guildhay ELISA在OD650nm 0.14的截止值处具有100％的诊断特异性和67％的灵敏度(95％CI43-91％)。没有来自未感染种群的样品的OD650nm值高于0.14。这些值的范围为0.072-0.140。在阳性种群中，15个样品中的5个具有阴性试验结果(一个样品不能进行测试)。这些值的范围为0.086-2.144。
4.讨论 这个研究的目的是量化对于蛋中S.e.抗体检查的SPR生物传感器的试验特性。结果表明，对于来自实验1的样品，SPR生物传感器测定比两种可商购的ELISA显著更好地实施。SPR生物传感器的组合的最佳诊断灵敏度和特异性分别为84％(77-90％)和99％(96-100％)。g，m鞭毛蛋白基IDEXX ELISA和LPS基GuildhayELISA都不能够使用这种试验面板以较高组合诊断灵敏度和特异性来检测S.e.感染。这个研究表明，SPR生物传感器测定能够成为用于通过蛋中的抗体检测而监测下蛋母鸡群的肠炎沙门氏菌亚属血清变型感染的新型且强大的工具。
SPR生物传感器测定提供了以快速和可靠方式检测感染的可能性。试验的高质量以及蛋收集的技术和动物康乐优点(welfareadvantages)是探究其用于筛选种群中的应用的良好理由。另外，采用的来自Biacore的SPR生物传感器的构造允许在相同传感器芯片上的单个传感器通道或相分离的传感器通道中，在单次运行中同时检测针对多种沙门氏菌血清变型的抗体(结果未示出)。这意义重大，因为众所周知的是，血清变型在国家和时间上都是不同的(参见例如Refs.Guerin et al.，2005；van Duijnkeren et al.，2002)。
试验评价利用来自两个实验(没有特别为了这种试验评价而实施，可能影响试验性能)的蛋进行。“阳性”蛋可以在体液响应在暴露小鸡中形成的时间点收集。分析这些“未成熟”蛋并且它们的假阴性结果干扰这些测定的评价。如果有可能直到感染后2周排除蛋，每一个试验ELISA或SPR生物传感器的诊断灵敏度将被提高。
血清中的抗体检测比在蛋中更敏感，因为蛋中的抗体出现比在血清中出现晚一周(Gast and Beard，1991；Sunwoo et al.，1996；Skovet al.，2002)。然而，用于蛋中抗体的试验的群灵敏度可以通过取更多样品而改进，这在使用蛋时更容易。
生物传感器性能(performance)(AUC 0.892)与两种商业ELISA(IDEXX AUC 0.432，Guildhay AUC 0.430)相比较。据我们所知，IDEXX ELISA对于蛋不是有效的，但相比于其他试验，存在关于试验性能的定量数据Van Zijderveld et al.(1992)评价了用于诊断实验性感染小鸡中的S.e.感染的4种不同ELISA。对于来自在利用S.e.感染后13至40天之间下的蛋的127个蛋黄，它们报道了100％的特异性和95％的灵敏度。以我们的评价，IDEXX试验没有如在1992评价中那样好地实施。一个解释可以是不同样品选择，因为我们的样品来源于在接种后2和4周停止的感染实验，具有很少的形成体液响应的时间。
沙门氏菌血清组B和D的成员中共享的O-抗原已知限制使用脂多糖抗原检测S.e.的特异性(de Vries et al.，1998；Baay and Huis in‘t Veld，1993；Hassan et al.，1990)。这由我们的结果所证实测定不能在利用肠炎血清变型、火鸡血清变型和鼠伤寒血清变型(共享O9和O12)的感染之间进行区分。由于这三种人畜传染病血清变型(鼠伤寒沙门氏菌加上肠炎沙门氏菌)代表了通过在1998-2003(Fischer et al.，2004)之间参与Enter-net监督网络的国家参照实验室所鉴定的80％的分离物，该发现对于人类种群具有有限的临床相关性。该确定确实在利用小鼠抗-沙门氏菌组B(1∶100，27RU)和D(1∶100，130RU)增强的SPF蛋黄之间进行了区分。这不是令人惊奇的，因为肠炎沙门氏菌的LPS具有作为菌体抗原的O1、O9和O12，同时该组特异性试验试剂包含以下单克隆抗体抗沙门氏菌组B抗-O4、O5、O27；抗沙门氏菌组D抗-O9。
来自实验2的截止值显著更高于来自实验1的截止值，可能是部分因为我们的样品由蛋清和蛋黄构成而不是仅由蛋黄构成。
对于不同的应用，不同截止值可以是最佳的。相对成本或误差的不期望性(假阳性/假阴性分类)以及感染和未感染母鸡的预期相对比例在确定截止值中是重要的参数，其影响测定的诊断值。我们建议了使假阳性结果数量最小的截止值，原因是如果要在下蛋母鸡种群(假定相对较低的S.e.流行度)的监督程序中使用该测定，则需要进行频繁取样以及测试。
SPR生物传感器技术已成功地检测了蛋抗体，以确定小鸡中的实验性感染。在未来的筛选程序中，SPR生物传感器有可能能够在相同时间检测不同的分析物。
表31来源于实验1的样品结果的ROC分析，通过SPR生物传感器、IDEXX和Guildhay ELISA进行分析。

aFisher精确试验 表32来源于实验2的样品结果的ROC分析，通过SPR生物传感器、IDEXX和Guildhay ELISA进行分析。
aFisher精确试验 实施例3 通过使用LPS涂覆的珠子监测细菌噬菌体感染的弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)的直接检测 引言 弯曲杆菌是发达国家中最常见的食物传播病原体，引起了特征为水泻和/或血性腹泻的肠胃炎。弯曲杆菌与Guillain-Barré(GBS)，Reiter’s和溶血性尿毒(HUS)症以及反应性关节炎相关(FSAI，2002；Lake et al.，2003；Tauxe，2000)。在近20年中，弯曲杆菌的感染率在许多发达国家中仍是增长的，可能由于检测和报告上的改进。在美国，每年报道了弯曲菌病(campylobacteriosis)的2,400,000病例，相应于美国人口的大约1％(Tauxe，2000)。
野生鸟类和家养动物是弯曲杆菌的储库并将细菌放入到环境中。家禽是人类弯曲杆菌感染的重要载体。事实上，分离自小鸡的菌株也能够分离自病人(Coker，2000)。
流行病学研究表明，家禽肉的消费和处理应认为是人类感染空肠弯曲杆菌(C.jejuni)或结肠弯曲杆菌(C.coli)的主要危险(FSAI，2002)。在美国、新西兰和欧洲，最恒定的危险因素是使用或接触生或未煮熟的家禽，占所有弯曲菌病所有病例的10％至50％(Tauxe，2000)。空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和红嘴鸥弯曲杆菌(C.Lari)代表约90％的人类弯曲菌病(Stern and Line，2000)。认为弯曲杆菌的感染剂量低，范围为500-10,000个细胞(FSAI，2002)。
弯曲杆菌是革兰氏阴性菌，弯曲，S-形，或螺旋状杆菌，在几点之一处具有一个或两个鞭毛且高度能动(Christensen et al.，2001)。弯曲杆菌在30.5℃和45℃之间生长，最佳温度为42℃。最佳生长在10％二氧化碳、5-6％氧气和85％氮气下建立(FSAI，2002)。
用于确定弯曲杆菌的传统表型方法花费4至5天并涉及预富集，之后是从选择性琼脂分离以及通过生物化学试验确认。由于食物项目的易腐坏性质和用于更快地分析食物产品所要求的速度，对于成本有效的弯曲杆菌检测需要敏感和特异性的方法。
免疫磁分离(IMS)程序由Waller and Ogata(2000)，Che et al.(2001)，Yu et al.(2001)使用以在没有预富集细胞培养物步骤的情况下从家禽肉浓缩空肠弯曲杆菌。当利用原子力显微镜和荧光显微镜检测时，这种方法能够在家禽肉中恢复104个菌落形成单位(cfu)/g(Yu et al.，2001)。IMS能够有效地减少弯曲杆菌的预富集时间，并且可以克服来自食物源的抑制剂如PCR抑制剂的问题(Benoitand Donahue，2003)。IMS的使用因此可以加速分析物的富集。这个实例描述了使用弯曲杆菌特异性细菌噬菌体，即附着至或感染活弯曲杆菌细菌的小病毒有机体的下游检测方法。它们的附着或感染依赖于细菌生命周期的阶段。弯曲杆菌的结合或感染即可以在细菌的稳定期、对数期或停滞期发生，并且也依赖于噬菌体物种。该细菌的感染通常导致大量的细菌噬菌体的拷贝。因此，记录这种噬菌体的增长被用作分析仪器以跟踪原样品中弯曲杆菌的存在。
这个研究的目的是证实细菌噬菌体作为用于检测动物产品如粪便和(家禽)肉中的弯曲杆菌的特异性和灵敏分析工具的应用。
材料和方法 实验设置 在均质化之后，例如通过兜包过滤促进之后，使用IMS来纯化和浓缩来自污染样品如肉和粪便的弯曲杆菌。在第二步中，IMS分离的细菌利用细菌噬菌体的恰当菌株进行孵育。未附着细菌噬菌体使用相同IMS程序步骤从细胞分离物洗掉。然后将感染和/或细菌携带噬菌体的IMS固定化弯曲杆菌引入到处于稳定期的参考弯曲杆菌的新鲜且纯的培养物中。该细胞培养物用作外来宿主以促进细菌噬菌体的倍增。在短培养以允许细菌到达它们的对数期之后，通过离心收获细菌噬菌体。含细菌噬菌体的上清液利用LPS涂覆的荧光珠子进行孵育。这里，珠子是如利用分离自用作宿主有机体的弯曲杆菌的LPS的实施例中所述的进行涂覆。结合至荧光珠子的细菌噬菌体的存在将以两种方式进行测试。在加入并利用用荧光标签标记的抗-细菌噬菌体抗体孵育之后，荧光的量将对应于细菌噬菌体的浓度，并间接地对应于原样品中弯曲杆菌的浓度。在一种可替换方法中，含抗-LPS抗体的荧光标签将与细菌噬菌体竞争结合部位。因此，相比于无弯曲杆菌样品，记录的荧光的降低表明弯曲杆菌阳性样品。
该试验在不同基质包括来自猪和小鸡的粪便、皮肤和肉中对于空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和红嘴鸥弯曲杆菌的选择性和灵敏度方面是有效的。紧密相关的有机体，如弓形杆菌物种将用来测试该方法的特异性。
细菌和病毒株以及培养条件 空肠弯曲杆菌(ATCC 33291)和结肠弯曲杆菌(ATCC 33559)从微生物学获得(St.Cloud，USA)。细菌在大豆胰蛋白胨肉汤(TSB)中在42℃生长24h(Oxoid，CM 129，Hampshire，England)，在微量需氧氛围下，这利用气体包装(BBL，Becton Dickinson，Sparks，USA)产生。然后将弯曲杆菌铺到炭-头孢哌酮-脱氧胆酸盐琼脂(Charcoal-Cefoperazone-Deoxycholate Agar)(mCCDA)(弯曲杆菌无血选择性琼脂基质[Oxoid，CM 739]，具有CCDA选择性补充[Oxoid，SR155]，头孢哌酮32μg/ml以及两性霉素B 10μg/ml)上，并在42℃、微需氧氛围下孵育24至48h。然后将一个纯弯曲杆菌菌落转移到大豆胰蛋白胨琼脂(TSA)(Oxoid，CM131)上，并将在42℃、微需氧氛围下孵育24至48h，然后放入4℃冰箱直至使用。
弯曲杆菌-感染性细菌噬菌体NTCC12669、NTCC12670、NTCC12671、NTCC12672、NTCC12673、NTCC12674、NTCC12675、NTCC12676、NTCC12677、NTCC12678、NTCC12679、NTCC12680、NTCC12681、NTCC12682、NTCC12683、NTCC12684获自国家典型培养保藏中心(英国伦敦)。
样品分离 储存在4℃下的纯弯曲杆菌培养物在TSB中传代培养，并在42℃、微需氧氛围下孵育24h。这是细菌噬菌体指数生长的主体。
将量为25g的场地小鸡上等肉悬浮在由兜包袋(stomacher bag)容纳的225ml的Preston肉汤(营养肉汤2号[Oxoid，CM 67]，5％(v/v)溶解马血[Oxoid，SR48]，弯曲杆菌生长补充物[Oxoid，SR232]和改性Preston弯曲杆菌选择性补充物[Oxoid，SR204])中。Preston肉汤介质依照生产商指示进行制备。容纳样品的兜包袋在兜包中充分均质化90s(Interscience，St.Nom，France)。整个悬浮液然后在42℃、微需氧氛围下孵育恰当时间以允许弯曲杆菌生长。
免疫磁分离 在利用Preston肉汤富集之后，容纳样品的兜包袋放入到IMS机器(PathatrixTM，Microscience，Cambridgeshire，UK)的孵育罐中。然后将该设备依照生产商指示进行操作。简短地，将50μl抗-弯曲杆菌磁性珠子(Microscience)加入到样品中，然后在37℃循环30min。释放磁固定化的珠子，用100ml预热缓冲蛋白胨水(蛋白胨；Becton Dickinson)10mg/ml、氯化钠(Merck，Darmstadt，Germany)5mg/ml、磷酸氢二钠二水合物(Merck)4.5mg/ml、磷酸二氢钾(Merck)1.5mg/ml，调节至pH 7.2)清洗，然后再次吸到磁石上。除去洗液，留下200ul悬液用于选择性生长和细菌噬菌体分析。
细菌噬菌体的检测 携带弯曲杆菌的IMS珠子与小体积的细菌特异性细菌噬菌体接触。在短暂孵育以允许噬菌体特异性附着至靶细菌表面之后，清洗IMS珠子并取样以设定最终分析程序中的参考点。剩余的悬液与新鲜弯曲杆菌物种的悬液混合以作为生长细菌噬菌体的宿主。在42℃孵育之后，离心悬液并对上清液补充一定体积的弯曲杆菌LPS涂覆的荧光珠子。然后噬菌体的倍增在加入荧光标记的抗细菌噬菌体抗体或荧光标记的抗弯曲杆菌抗体之后进行评估。在孵育15min之后，珠子使用例如BioPlex装置(Bio-Rad)进行分析以筛选作为特异性结合反应的结果的固定到珠子上的荧光。
实施例4 使用荧光珠子对猪血清和来自小鸡的肉汁的抗沙门氏菌抗体的检测 引言 微生物包括广泛的各种各样的细菌、霉菌(真菌)、寄生虫和病毒。致病性微生物吸引了作为污染食物和水的消费者的公众注意，其导致在家庭或在社会爆发。因此，媒体和政治家在增长的消费者意识中起到了它们的作用并且新的立法在制定或已在实施。
对于致病性微生物，特别吸引注意的是大量人畜传染性疾病，即可从动物传播到人类的微生物，原因如下1)人类的大多数食物以及水传播疾病实质上是人畜传染病；2)许多人畜传染剂通过环境具有它们的传播途径；以及3)食物/水以及环境的污染还被(生物)恐怖主义者利用以获得对社会的最大影响。
微生物学病害可以在收获前、生产、加工、运输、修理、家用储存或肉加工期间的任何点处进入食物链。从它们引入到饲料或食物开始，可出现高度复杂的环境，其中微生物可以躲避检测和失活。有效的国际分布系统和在消费优选中的快速变化可促进病原体通过大种群快速渗透，大大地缩短了公共健康机构可利用的反应时间。
权威机构和食物生产商都承认，快速、多功能和选择性(诊断)测定对于环境、原料(饲料)和食物监控是需要的，以充分地应对食物链中的污染环节。大部分开发的监控技术涉及使用亲和性测定技术，包括生物传感器平台。
原则上，微生物存在的检测可以以两种方式实施直接或间接地。在直接测定中，有机体本身通常利用与(亚)种和/或菌株特异性抗原结构反应的抗体进行检测。这种免疫化学分析依照通过在选择性生长介质中培养的耗时样品制备。在寄生虫感染的情况下，这是不可能的并且直接检测涉及样品的显微镜检查。在间接测定中，微生物的存在通过检测感染宿主的免疫学响应的体液(免疫球蛋白)或细胞(例如细胞因子)产物来表明的。在大多数研究中，良好限定的抗原用来捕获任何体液中的宿主免疫球蛋白(血清学)。然后，观察到的结合表明，病原体的侵入性感染的特性。
间接和直接病原体检测的优点和缺点很清楚i)个体不总是免疫学地响应于感染；即低或高免疫响应者之间有差异；ii)体液响应延迟多天或甚至几周，可能留下未注意到的最近感染；iii)其中致病性有机体没有被检测到的地方，可发现血清抗体，因为其在某些(非取样的)组织中排斥或收回本身；iv)血清学考察非常快并对高通量提供比直接检测更好的概率；以及v)血清或血浆的血清学分析预测了比直接抗原分析(即典型选择性细菌培养)更好的种群或群体的沙门氏菌感染状态。
事实上，血清学优于直接方式，以及在大多数情况下的组织寄生虫的非敏感性检测(其仅可通过组织化学或消化技术以及显微镜实施)。在样品收集和制备中的显著差异也很明显尽管细菌、真菌和病毒必须从基质进行培养以有利于它们在富集溶液中进行检测，但是血液相对容易收集和制备用于分析。然而，这里应当注意，抗体不仅可以从血液、血浆或血清回收，而且可以从肌肉(肉汁)、乳汁、初乳、脑脊髓液以及蛋回收。尤其是，蛋、肉汁和/或乳汁的取样比血液、血浆、血清或脑脊髓液的取样更容易并且更成本有效。
因此，基于含抗体的生物学材料的血清学分析的诊断方法在所谓的动物对数屠宰中是支持的。在这种创新加工方法中，基于连续和广泛监控农场水平(动物是否允许进入无沙门氏菌或沙门氏菌污染的加工基本设施(infrastructure))而作出基于证据且可靠的决定。
在沙门氏菌属的抗原结构的成分之中，菌体抗原作为跟踪动物在这种有机体侵入性感染时的免疫响应的仪器是很重要的。菌体抗原位于脂多糖(LPS)的多糖部分上，其是细菌细胞壁的组成组分。演绎出利用仔细选择的LPS对体液响应的检测、感染性沙门氏菌血清组的同一性。
在丹麦、德国、希腊和荷兰，在屠宰场取样的所有沙门氏菌阳性猪的39.5％确定为鼠伤寒沙门氏菌。取决于国家，来自猪的其他重要分离物是德尔卑沙门氏菌(17.1％)、婴儿沙门氏菌(8.0％)、巴拿马沙门氏菌(5.1％)、俄亥俄沙门氏菌(4.9％)、伦敦沙门氏菌(4.4％)、利文斯通沙门氏菌(3.1％)、魏尔肖沙门氏菌(2.7％)、鸡副伤寒沙门氏菌(2.1％)、姆班达卡沙门氏菌(1.1％)、勃兰登堡沙门氏菌(1.0％)、黄金海岸沙门氏菌(0.8％)。
在小鸡的情况下，14％的小鸡在荷兰在200年在种群水平是沙门氏菌阳性的。在该情况下主要的血清变型是乙型副伤寒沙门氏菌变异株java。在荷兰发现相当大百分比(13.4％)的零售水平。在14个欧盟国家中，分离自烤子鸡(broilers)的最常见沙门氏菌血清变型是乙型副伤寒沙门氏菌变异株java(24.7％)、肠炎沙门氏菌(13.6％)、婴儿沙门氏菌(8.0％)、魏尔肖沙门氏菌(6.7％)、利文斯通沙门氏菌(5.7％)、姆班达卡沙门氏菌(5.5％)、鼠伤寒沙门氏菌(5.3％)、森夫屯堡沙门氏菌(S.senftenberg)(5.0％)、哈达尔沙门氏菌(3.7％)。乙型副伤寒沙门氏菌变异株java是主要的，但这完全归属于荷兰。
在生产食物的小鸡和猪中，流行出现的沙门氏菌血清组因此属于组B、C和D，以及在猪的情况下还包括组E。
在这个研究中，新的分析亲和性测定平台被开发用于猪和小鸡中的沙门氏菌感染的间接检测。来自Luminex分析的这种技术平台内部编码珠子，其可在单个试验中用不同抗原涂覆。仅当珠子的荧光和结合分析物经过检测器时，才记录响应。这种方法应用于检测血清和肉滴中的抗-沙门氏菌抗体。
材料和方法 化学品 胺偶联试剂盒，由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和乙醇胺盐酸盐-氢氧化钠pH8.5构成，获自Biacore AB(Uppsala，Sweden)。乙醇和三氯乙酸(TCA)购自Merck(Darmstadt，Germany)。氰基硼氢化钠和碳酰肼获自Fluka Chemie GmbH(Buchs，Switzerland)。猪血红蛋白(Hb)获自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO，U.S.A.)。水获自MilliQ水纯化系统(Millipore，Bedford，MA，U.S.A.)。
材料 NAP-5柱(0.5ml；Sephadex G-25)购自Amersham Biosciences并如生产商所述使用。CM5生物传感器芯片购自Biacore AB。具有1kDa截止值的渗析袋(Spectra/Por)获自Spectrum Laboratories Inc.(Rancho Dominguez，CA，U.S.A.)。Alexa532来自Molecular Probes(Leiden，The Netherlands)。羊抗-猪IgG(H+L)从JacksonImmunoresearch(West Grove，PA，USA)订购。这种抗体利用标准标记程序步骤与Alexa532轭合。
抗-沙门氏菌抗血清 针对O4、O5、O61、O7、O8、O9、O10的沙门氏菌单价“O”菌体单克隆抗血清购自Sifin(Berlin，Germany)。抗体溶液在50mMPBS中稀释至它们的工作浓度。
参考禽鸟和猪血清 参见实施例1，部分1.1.4。
方法 LPS的提取 参见实施例1，部分1.2.1。
LPS的氧化 参见实施例1，部分1.2.3。
LPS的固定化 为了将氧化的LPS抗原固定到珠子上，在珠子表面的羧基利用可从胺偶联试剂盒获得的EDC/NHS混合物在回转振荡器(gyrorocker)上激活20min。在离心并去除上清液后，活化之后是与5mM含水碳酰肼反应20min。具有改性表面的珠子再次成粒并且上部液体在加入1M乙醇胺之前抛弃，并孵育20min。在另一以14,000g离心步骤5min之后，加入溶解在乙酸钠pH 4.0中的氧化LPS以允许固定化90min。在去除通过离心获得的上清液之后，珠子-表面和抗原之间的键接利用溶解在10mM乙酸钠(pH 4)的100mM氰基硼氢化钠加以稳定。
BioPlex测定 在珠子计数装置升温之后，这种BioPlex(BioRad，Veenendaal，The Netherlands)根据生产商指示利用BioPlex校正试剂盒(BioRad)进行校准。样品在微滴定板的孔中的50mM PBS中稀释，然后补充50μL 5000珠子/mL LPS-涂覆的珠子。抗原-抗体结合在以200rpm运行的微滴定板摇晃器上进行30min。然后加入在50mM PBS中稀释8倍的用Alexa532荧光标签标记的10μL羊抗-猪IgG(H+L)，并且在摇晃器上持续孵育15min。然后对于珠子它们的荧光外形在BioPlex机器上分析30s。
结果和讨论 荧光珠子制备用于来自不同特定沙门氏菌血清变型源代表血清组B、C和D(与来自小鸡和猪的食物中的人畜传染病相关)的LPS涂覆。应当注意，血清组E，其与猪产品相关，在这里没有进行研究。在每一种类型的LPS固定化至单个珠子(其是内部编码的)之后，涂层的成功利用可商购的针对菌体抗原O4，O5，O7，O8和O9的单克隆抗血清加以评估。然而，尽管抗-O5给出6398单位的响应，抗-O9给出145单位的响应，但是未匹配抗原-抗体的背景信号在所有情况下都低于91单位(图6)。以类似方式，抗-O4和抗-O7分别给出305单位和174单位的响应(图7)。这些在可商购抗血清制剂之间的响应差异非常良好地与利用表面等离子体谐振(SPR)生物传感器观察到的结果一致并且反映抗体效价的差异。
以类似方式，在不同天数氧化的相同LPS批次的活性利用类似面板的商业抗血清进行测试(图8)。相比于其他氧化批次，范围在57％和148％之间的响应容易进行改进。
分析肉滴即从肌肉组织在冷冻和解冻循环之后获得的汁和来自小鸡的血清的不同制剂(图9)。记录的活性如预期的。来自无沙门氏菌小鸡的肉滴、血清以及肉滴和血清的混合物给出低丰度荧光轭合的珠子。相反，抗鸡白痢沙门氏菌和抗鸡沙门氏杆菌(S.gallinarum)应给出在血清组B和D上的响应，因为它包含抗原O1和O12，其用于肉滴和血清。婴儿沙门氏菌包含抗原O6，其由C1和C2共享。实际上，这种活性在肉滴和血清中观察到。
除小鸡血清之外，制备的猪血清也进行测试(图10)。来自无沙门氏菌猪的血清给出的MFI响应的范围为110单位(血清组C2)至137单位(血清组B)，并且接近仅用缓冲液孵育的珠子的响应，即从94单位(血清组D)至129单位(血清组C2)。如所预期的，有效信号在血清用抗鼠伤寒沙门氏菌和利文斯通沙门氏菌抗血清增强时记录，即分别为在血清组B上的969单位和在血清组C1上的207单位。强化的血清不与给出在104MFI单位和131MFI单位之间的响应的非对应抗原反应。
实施例4A 利用ImmuSpeedTM检测家禽血清和肉汁中的抗沙门氏菌抗体 如所描述的，身体来源的生物学材料，包括血液、肉滴、血清、血浆、乳汁等中的抗体的分析可以利用各种技术实施，以确定猪和小鸡中的沙门氏菌感染。这里，采用一种平台，其由DiagnoSwiss(Monthey，Switzerland)开发并存在于一次性芯片，该芯片上组合了用于检测目的的储罐、微流体系统和微电极。
单个芯片由8个平行通道构成。单个通道包含具有集成电极的区域。正是在芯片的每个通道的这个区域中，可以利用变化数量的抗原形成斑点。这里，血清组代表B、C1、C2、D和E以这样的方式固定以使芯片可以再用于在相同芯片上的重复分析。以这种方式，8个样品可以每8min或更快地同时进行分析。
该检测基于电活化产物的生成，其通过集成微电极进行监控。为此，在芯片上孵育生物样品之后，在芯片上引入第二抗体。该第二抗体用酶例如β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶(HRP)或(碱性)磷酸酶加以标记。电失活基质在这种酶活性存在时转化并且当施加适当电势时将诱导电化学反应，其被记录。
材料和方法 化学品和材料 水获自Milli Q水纯化系统(Millipore，Bedford，MA，U.S.A.)。对氨基苯基-磷酸盐(C6H6NO4PNa2.H2O)来自Universal Sensors Inc.(Kinsale-Sandycove；Ireland)。羊抗-猪IgG(H+L)和驴抗-小鸡IgG(H+L)从Jackson Immunoresearch(West Grove，PA，USA)订购。这些抗体轭合有碱性磷酸酶。“溶液B”从Agilent(Santa Clara，CA，USA)订购。氧化的和蛋白质强化的沙门氏菌LPS代表血清组B、C1、C2和D获自上述实验。
参考禽鸟和猪样品 参见实施例1，部分1.1.4。
肉滴来源于肌肉组织，其起源于其中两只小鸡(动物编号1236和1429)实验性地利用肠炎沙门氏菌攻击的实验。阴性样品来自没有感染的对照小鸡。肌肉组织冷冻并解冻，并且剩余的液体收集作为肉滴样品。
方法 LPS的固定化 氧化的蛋白质-LPS抗原(0.5mg/mL)在pH 4的PBS中以1∶4(v/v)稀释。LPS涂覆到ImmuSpeedTM芯片(标记的Loop9-Var1；DiagnoSwiss，Monthey，Switzerland)上，其构造具有8个通道。这里，单个通道涂覆有单种LPS抗原。涂覆完成如下。为了活化传感器通道，将芯片用乙醇(其由芯片的储罐容纳)以10μL/min流速预润湿。储罐倒空，用30μl磷酸盐缓冲液pH 4填充，并且通道用该溶液冲洗。每个储罐倒空，然后用用于涂覆的氧化沙门氏菌LPS-蛋白质复合物溶液填充。流速设定为10μl/min并且涂覆通过采用所谓的循环完成，即在每2s之后，停止流动30s。这种涂覆程序执行8min。在倒空储罐之后，加入30μl封闭剂，其由在0.2M Tris马来酸盐(Tris maleate)pH 6.2中的5％胎牛血清(FCS)构成，并以相同方式流过表面。最后，储罐和通道利用含0.1％(m/v)BSA和0.05％(m/v)Tween20的PBS以10μl/min通过2-s流动和10-s停止的循环进行清洗。
ImmuSpeedTM测定 在其升温之后，ImmuSpeedTM装置(DiagnoSwiss，Monthey，Switzerland)根据生产商指示进行校准。将样品如文中指出的在10mM Tris/HCl pH 7中以1∶100至1∶1000(v/v)进行稀释。将30μL体积的稀释样品用吸液管吸入到空芯片储罐中。样品流过通道，设定流速10μL/min，使用5个循环，其每一个由2s流动和15s停止构成以用于最佳免疫反应。储罐倒空，并且储罐和通道利用含0.1％(m/v)BSA和0.05％(m/v)Tween20的PBS以10μL/min流速清洗5个循环。单个循环由2s流动然后15s不流动构成。接着，储罐倒空并用碱性磷酸酶标记的30μL羊抗-猪IgG(H+L)或30μL驴抗-小鸡IgG(H+L)填充，取决于靶向的分析物。这些抗体如所指出的在用1％(v/v)FCS强化的Tris 100mM pH 7中以1∶150至1∶1500(v/v)进行稀释。将该溶液以10μL/min的流速引入芯片中并通过具有在2s流动之后15s间歇间隔的15个循环孵育4.25min。在如上所述清洗储罐和通道之后，将2mM PAPP以10μL/min利用10s流动和15s停止流动的2个循环引入，以引发电活化产物的生成。这种产物通过集成电极进行监控，其设定为250mV以进行电化学反应，以及通过设定以10μL/min的30个循环。
为了促进一系列新的重复性分析，表面利用所谓的溶液B在5个循环(以10μL/min的2s流动，10s流动停止)中再生，随后是利用含0.1％(m/v)BSA和0.05％(m/v)Tween-20的PBS在5个循环(以10μL/min的2s流动，10s流动停止)中的清洗步骤。
结果与讨论 在第一种设置中，ImmuSpeedTM芯片用LPS血清组D在通道1至4上涂覆，而通道5至8保持没有改变。收集自小鸡的LPS D-阳性肉滴(其用肠炎沙门氏菌攻击)与通道1、2、5和6接触(图44)。电活化产物的生成随时间出现并且是小鸡肉滴中存在抗沙门氏菌抗体的指示。如所预期的，方波响应(steep response)在通道1和2中形成，其中通道1和2注入了与沙门氏菌血清组D LPS反应性的肉滴，而没有用LPS涂覆的沙门氏菌阴性样品和通道仅形成低的背景响应。在再生后利用相同芯片的重复性分析表明高度相当的结果。
新的芯片通过分别在通道1、2和3上涂覆两个系列LPS血清组B、C1、D以及分别在通道5、6和7上进行制备。通道4和8保持未涂覆。以如上所述的类似方式，小鸡和猪血清分析表明测定的区分能力，因为血清正确地识别为沙门氏菌阳性和沙门氏菌阴性样品。如所预期的，血清组D阳性样品在LPS B通道上给出微小反应。而且在这种情况下，来自重复分析的结果表明低的差异度。
实施例4B 利用干涉测量基0ctetTM生物传感器检测家禽血清和肉汁中的抗-沙门氏菌抗体 给出了生物传感器技术的另一个实例，其可以用来分析各种生物学材料中的抗体，由于有机体暴露于沙门氏菌属之后的体液响应而在这些基质中表达。在这种情况下，感兴趣的平台是由FortéBio(Menlo Park，CA，USA)生产的OctetTM。这种仪器的检测系统是基于光学干涉测量的，并在感测波与生物层表面(其上可结合抗-沙门氏菌抗体)相互作用时测量电磁辐射(光)的相变，条件是传感器表面加载有沙门氏菌特异性LPS抗原。在由此评价生物层的密度之前，易处理的单次使用的生物传感器必须构造具有LPS血清组抗原B、C1、C2、D和E并利用样品进行孵育。
材料和方法 化学品和材料 水获自Milli Q水纯化系统(Millipore，Bedford，MA，U.S.A.)。胺偶联试剂盒，由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和乙醇胺盐酸盐-氢氧化钠pH 8.5构成，获自Biacore AB(Uppsala，Sweden)。氰基硼氢化钠和碳酰肼获自Fluka Chemie GmbH(Buchs，Switzerland)。氧化的和蛋白质修饰的沙门氏菌LPS代表血清组B、C1、C2和D获自上述实验。一次性胺反应性生物传感器装置获自FortéBio，预期其表面有羧基。
参考血清 参见实施例1，部分1.1.4。这些血清在OctetTM生物传感器分析之前在PBS pH 7中以1∶500(v/v)稀释。针对沙门氏菌O5抗原(血清组B)的单克隆抗血清购自Sifin(Berlin，Germany)。
方法 LPS的固定化和OctetTM生物传感器分析 OctetTM样品提供到标准96-孔微滴定板中用于固定化反应和样品分析。为了在检测装置外部固定抗原，微滴定板通过用以下溶液填充8个孔列中的每一个而制备第1排)PBS pH 7；第2排)EDC/NHS；第3排)碳酰肼；第4排)乙醇胺盐酸盐-氢氧化钠pH8.5；第5排)PBS pH 7；第6排)氧化的蛋白质-LPS抗原(0.5mg/mL)；第7排)氰基硼氢化物；第8排)PBS pH 7；第9排)样品；第10排)1M含0.1％(m/v)的各CHAPS、Tween-20、Tween-80和Triton-100的脲；第11排)PBS pH 7；以及第12排)样品。LPS抗原作为血清组B、C1、C2和D用吸液管吸入到第6排的前4个孔和再4个孔。生物传感器恰当地置于8x12构架框中。后续孵育在以45rpm的水平轨道摇床上的机器外部执行生物传感器在PBS(第1排)中润湿2min，表面用EDC/NHS(第2排)活化5min并用碳酰肼(第3排)活化10min，接着将剩余的活性组(第4排)封闭10min，用PBS(第5排)清洗，抗原(第6排)固定化90min并利用氰基硼氢化物(第7排)使形成的键稳定90min，最后是利用PBS(第8排)的清洗步骤5min。
在该仪器中，后续步骤自动执行，在这种情况下，溶液通过摇晃微滴定板进行均质化同时发生孵育。生物传感器在接触样品(第9排)5min之前浸入PBS溶液3min。依赖于实验，生物传感器利用第10排中的溶液再生1min并制备用于通过将传感器浸入PBS(第11排)3min的下一次分析。然后样品(第12排)在所述的检测之前再次接触5min。再生和样品的分析重复三次。
结果与讨论 由于生物传感器条件必须对这种特定沙门氏菌试验进行优化，如在任何测定的研究和开发阶段，所以用来制备用于样品分析的生物传感器的多个步骤在机器外手动进行。明显地，包括LPS抗原的固定化的这些条件是满意的，因为在生物传感器与参考血清(reference sera)接触的分析后获得特异性响应。
作为一个实例，对于鸡白痢沙门菌-鸡肠球菌(Salmonellapullorum-galinarum)(血清组D1)是阳性的小鸡血清分析以及阴性小鸡SPF血清分析在图45中给出。在这种情况下使用的生物传感器利用血清组B LPS固定，并且尽管鸡白痢沙门菌-鸡肠球菌属于血清组D，但是其包含抗原O12，其也在血清组B中发现。因此，可以预期观察到的信号。该分析还显示了在利用间歇再生的单个生物传感器上相当的三个重复性分析。
制备新的血清组B LPS抗原活性生物传感器以测定单克隆抗-O5抗体(图46)。如预期的，该抗体与固定的LPS反应，而阴性血清没有给出或甚至给出阴性响应。在不同生物传感器处获得显著不同强度的信号同时探测相同的样品。
总之，利用生物传感器-固定化蛋白质-LPS复合物，血清抗体的生物层干涉仪分析成功地区分沙门氏菌阳性和沙门氏菌阴性样品。如所预期的，血清组D阳性样品在LPS B生物传感器上给出微小的反应。
实施例5 利用SPR生物传感器确定外来禽鸟物种中的抗-沙门氏菌抗体 研究目的 这个研究的目的是探究基于固定化选择的沙门氏菌LPS用于间接检测食品生产动物中的沙门氏菌感染所开发的SPR生物传感器技术是否也能够在外来动物物种中检测这样的感染。
材料 来自巨嘴鸟(tocotoucans)(鞭絺妥空鸟，Rhamphastos toco)和尖尾榛鸡(尖尾松鸡，Tympanuchus phasianellus)的血浆，其用不同噬菌体型的鼠伤寒沙门氏菌感染，由Dr.W.Schaftenaar and Ing.M.de Boer友好提供(荷兰鹿特丹动物园兽医部，VeterinaryDepartment，Rotterdam Zoo，The Netherlands)。这些动物的病史如下。
在1994年3月24日从巨嘴鸟的粪便取样，分离出鼠伤寒沙门氏菌噬菌体型292。在1994年6月28日，从同一鸟的另一粪便样品分离出鼠伤寒沙门氏菌噬菌体型352。1994年8月24日，从这个动物收集血浆用于这个研究的SPR分析。
在1997年10月28日从患病尖尾榛鸡收集血液。从该血液制备的血浆用于这个研究的分析。这个动物在第二天死亡。从该死亡鸟分离出鼠伤寒沙门氏菌噬菌体型507。
方法 如前所述操作包含传感芯片的SPR生物传感器(Biacore3000)，其中该传感芯片用来自肠炎沙门氏菌、利文斯通沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的LPS涂覆。血浆样品如对于在实施例1和2中的血清所述进行稀释并加以分析。
结果与讨论 本发明首先开发用于食物链中的应用，以确保动物来源的食物相对于沙门氏菌污染的安全性。然而，可应用的领域利用从两种外来禽鸟物种，即巨嘴鸟(R.toco)和尖尾榛鸡(T.phasianellus)的血浆进行试验，该血浆如由典型(经典，classic)微生物诊断学所披露的，用鼠伤寒沙门氏菌进行感染(与M.de Boer，Blildorp Zoo，Rotterdam的个人交流)。
巨嘴鸟的粪便在血液取样之前五个月和两个月发现是阳性的，并且体液响应可在相对较长时间期内形成。事实上，生物传感器响应高(表33)。相比于来自SPF小鸡的空白血清和相比于标准抗血清(抗-血清组A至S)，与鼠伤寒沙门氏菌LPS的反应性显著高(4185响应单位(RU))。在肠炎沙门氏菌的通道上观察到响应(1220RU)，这对于来自完全利用鼠伤寒沙门氏菌高度感染的小鸡的血清也观察到并与在两个血清变型中存在菌体抗原O12相一致，并由此在血清组B和D中也观察到(参见表1和3)。出乎意料地，在黄金海岸沙门氏菌通道处也观察到相对高的响应。这里不能排除这种鸟同时或依次地被多种血清变型所感染，其中鼠伤寒沙门氏菌作为最后的感染，包括C2感染。
尖尾榛鸡的血浆与不同LPS类型不是非常反应活性的，但反应性在所有情形下均高于空白血清，并且在S1和St LPS上，高于参考抗血清(表33)。作为因感染而快速死亡的鸟，针对所选抗原的显著体液响应很可能没有充分形成并且通过生物传感器没有检测到。因此，应当注意，血清学不是非常适合于在个体水平上的诊断。如由Swanenburg证实的(Utrecht Thesis，Utrecht University，2000)，血清学尤其适合于在群体水平评价沙门氏菌地位。
表33从利用鼠伤寒沙门氏菌感染的巨嘴鸟和尖尾榛鸡收集的血浆分析的结果。这些结果以相对响应单位表示。样品分析三次。

a来自无特定病原体小鸡的血清，即空白血清； b与沙门氏菌血清组B反应的可商购的单克隆抗体。
实施例6 细菌噬菌体Felix O1(FO1)通过其结合至固定在SPR生物传感器芯片表面上的沙门氏菌LPS的检测 目的 为了确定细菌噬菌体FO1与固定至生物传感器表面的LPS的结合 方法 为了证实细菌噬菌体Felix O1(FO1，Félix d’Hérelle ReferenceCentre for Bacterial Viruses，Laval，Canada)与沙门氏菌LPS的结合，将该细菌噬菌体稀释到HBSEP中以获得一个浓度系列。这些样品在生物传感器上注射2min以允许结合至来自鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌和利文斯通沙门氏菌的LPS，其中每一个都独立地固定在传感芯片的单个流动通道上。
结果 结果概括在图11中。
尽管需要相对高浓度的细菌噬菌体以获得显著的响应，但是根据这个实验很明显，109PFU的FO1细菌噬菌体/mL以及更高结合至偶联于芯片表面的LPS。
实施例7 在细菌噬菌体FO1利用鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌和利文斯通沙门氏菌孵育后，通过其结合至固定在SPR生物传感器上的鼠伤寒沙门氏菌LPS检测细菌噬菌体FO1 目的 为了确定细菌噬菌体FO1与在HBSEP中的沙门氏菌属的活培养物的结合。
方法 将不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌、利文斯通沙门氏菌和空白介质的培养物与1.2x109PFU细菌噬菌体FO1混合5min。在孵育之后，将细菌旋掉，并将上清液利用包含来自鼠伤寒沙门氏菌的固定化LPS的生物传感器芯片在Biacore上进行分析。
结果 为了确定显著的响应，通过不包含沙门氏菌但包含1.2x109PFU细菌噬菌体的空白介质的平均读数，减去3倍标准偏差，建立截止值。应用该值表明，对于鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌、利文斯通沙门氏菌来说，沙门氏菌应分别以至少6x108CFU/mL、3x106CFU/mL、4x107CFU/mL和3x104CFU/mL的浓度存在，以给出显著的响应(图12)。
讨论 细菌噬菌体FO1至沙门氏菌属的吸附速率很可能依赖于该核心区域(FO1的结合部位)中的N-乙酰基葡萄糖胺的可接近性(Lindberg，1977；Lindberg and Holme，1969)。因此，在靶向沙门氏菌LPS的多糖区域中存在的长且大量O-侧链可损害FO1与分析物的结合。因此，可以预期，游离细菌噬菌体对于沙门氏菌菌株将具有可变化的结合能力，以及病毒的繁殖很大程度上取决于暴露的LPS的分子外形。
当将LPS-蛋白质复合物固定在用于诊断方法的固体载体表面时，如在本发明中所述的，可以形成配体的密实网络。在提供的Biacore分析中，复合物的密度以及蛋白质的阻碍在观察到的噬菌体与四种LPS类型的结合的差异中发挥了作用。
这里应当注意，如也已在本发明中讨论过的，预期了核心区域中的单糖组分的氧化，包括N-乙酰基葡萄糖胺的氧化。因此，用于细菌噬菌体的配体受影响并且这可能影响试验的灵敏度。
实施例8 细菌噬菌体FO1在沙门氏菌和非沙门氏菌菌株中的繁殖 目的 FO1的繁殖在沙门氏菌属中不是唯一，而也可能在非沙门氏菌菌株(3)中。启动这个研究以考察细菌噬菌体FO1增殖的选择性。为此，将大量重要的食物非沙门氏菌病原体暴露于FO1细菌噬菌体。
方法 在胰化蛋白胨大豆肉汤中生长七种非沙门氏菌菌株(单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、柠檬细菌(Citrobacter)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))以及七种沙门氏菌菌株(猪霍乱沙门氏菌、贝塔沙门氏菌(S.berta)、火鸡沙门氏菌、阿哥拉沙门氏菌(S.Agona)、鸡瘟沙门氏菌、魏尔肖沙门氏菌和肠炎沙门氏菌)(Oxoid CM129)。
在t＝0小时，将1.2x108PFU的FO1(终浓度1x106PFU/ml)加入到所有培养基。每一个小时抽取样品，并确定在λ＝600nm处吸收率(图13和14)、菌斑形成单位/ml(图15和16)以及在浓度和缓冲液变换之后，与固定在Biacore生物传感器的传感芯片表面上的固定化St-LPS的结合(图17)。
一些非沙门氏菌细菌，包括单核细胞增生利斯特氏菌、绿脓假单胞菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌在培养5小时中没有表现出生长(图13)。这些细菌明显没有由细菌噬菌体FO1负载或感染，因为细菌噬菌体的浓度没有随时间升高而是保持在1x106PFU/ml(图15)。
相反，所有沙门氏菌血清变型，除了魏尔肖沙门氏菌，在孵育5小时中生长(图14)。这种魏尔肖沙门氏菌菌株很可能由增生性细菌噬菌体完全溶解，因为显示出细菌噬菌体的浓度明显增加，从1x106PFU/ml增加到1x1010PFU/ml(图16)。以类似方式，贝塔沙门氏菌和火鸡沙门氏菌细菌显示出增高的细菌噬菌体浓度。然而，这些细菌，尤其是贝塔沙门氏菌显示出良好的生长(图14)。
在本发明的上下文中，繁殖的细菌噬菌体与传感器表面的结合是最感兴趣的。为此，在SPR生物传感器分析之前，浓缩在沙门氏菌中繁殖的细菌噬菌体，渗析并系列地稀释(图17)。出乎意料地，相当的细菌噬菌体浓度给出显著不同的生物传感器响应。最可能的噬菌体丧失，尤其是在浓缩和渗析步骤期间、在样品制备期间。然而，细菌噬菌体的制剂(其已显示繁殖(参考图16))给出比空白样品明显更高的响应，其中空白样品仅包含显著(staring)浓度的细菌噬菌体。
结论 这些实验表明，细菌噬菌体可以用作分析工具，用来检测样品中沙门氏菌的存在，以及固定至固体表面的沙门氏菌LPS可以用来探测细菌噬菌体增加(作为在短孵育期后病毒在宿主细菌中繁殖的结果)。
实施例9 沙门氏菌来源的LPS在荧光珠子上的固定化以及报告各种生物学样品中目前或过去沙门氏菌感染的抗体的检测 1、引言 在沙门氏菌属的抗原结构的成分中，菌体抗原作为追踪动物在这种微生物侵入性感染后的免疫响应的工具是很重要的。菌体抗原位于脂多糖(LPS)的多糖部分上，其中LPS是细菌细胞壁的一种构成组分。在从仔细选取的沙门氏菌血清型提取和分离LPS之后(参见SOP CHEMIE/A21)，含有抗原的LPS共价偶联至珠子，其由荧光材料的特定混合物内在地编码(内部编码)。探测技术平台之一来自Luminex，其可在单次试验中鉴定高达100个不同内在编码的珠子。珠子的单个物质(物种)可以用反映(reflect)不同血清组的LPS的混合物固定，或者珠子的不同物质可以各自用反映致病性微生物的单个特定血清组或血清变型的LPS固定。含LPS的珠子利用体源(body-derived)材料如血液、血浆、血清、肉滴/肉汁、蛋黄、乳汁等孵育，以能够进行抗-沙门氏菌抗体-抗原结合。在装置中利用荧光标记的抗-免疫球蛋白抗体的第二次孵育之后，检测特异性结合同时分析受激发珠子和标记抗体的发射波长。仅在珠子和抗体的荧光同时检测时，才记录特定珠子物质的响应。
这种SOP描述了用于LPS氧化、固定到珠子上的方法以及用来评估产生的质量的测定。
2、应用的范围和领域 为了分析生物学流体，如来自小鸡和猪的血清样品中存在抗-沙门氏菌抗体，其与O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10和O12菌体抗原反应，反映来自血清组B、C、D和E的沙门氏菌的历史或当前感染。
3、参照物(基准) 从沙门氏菌属提取和分离脂多糖；将沙门氏菌来源的LPS固定到生物传感器芯片(Biacore)上并检测报告当前或过去沙门氏菌感染的血清抗体。优化加入到用于固定和检测血清抗体的LPS的蛋白质；参见实施例1。
4、定义 c＝浓度，单位为％(m/v)、％(v/v)、mol/l或mmol/l，如指示的。
6、原理 LPS在蛋白质存在下通过高碘酸钠促进进行氧化。LPS-蛋白质溶液利用NAP-5柱脱盐。在利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)辅助下活化珠子表面处的羧酸基团之后，接着与碳酰肼反应，将脱盐的氧化LPS-蛋白质复合物固定至珠子的固体相。然后利用氰基硼氢化钠来稳定结合的LPS。在常规使用前，利用参考单克隆凝集血清面板来评估珠子轭合的LPS结合抗-沙门氏菌抗体的性能。
7、反应 7.1、糖类部分的氧化 高碘酸盐引起在(尤其是)例如在甘露糖中的糖部分上的相邻顺式-二醇之间的键的氧化性破坏，生成醛官能团，参见图18。这个反应通常利用新鲜制备的在0.1M乙酸钠中的10-100mM偏高碘酸钠，在黑暗中、在pH范围为4.5至5.5的缓冲液中进行。
注1图18中指示的轭合位置，以将所示单糖与在多糖中(例如在LPS中)的其他单糖残基连接起来，这里仅作为实例给出。R’和R分别表示糖链(或烃链)中的远端和近端位置。羟基氧化成醛可以在每一个含易受影响的邻二醇的单糖组分中的多糖链内自身重复。
注2当存在时，高碘酸盐也可以氧化某些β-氨基乙醇衍生物如骨胶原中的羟赖氨酸残基，以及蛋氨酸(至其亚砜)和某些硫醇(通常至二硫化物)。另外，肽和蛋白质的N-末端丝氨酸和苏氨酸残基可以通过高碘酸盐选择性地氧化成醛基。然而，这些反应通常以比邻二醇的氧化更慢的速度发生。
7.2、轭合至蛋白质 在蛋白质存在下进行氧化。二醛化合物，如这里在LPS的多糖链中的氧化单糖组分，可以与蛋白质中的任何氨基反应，并且可以形成导致产生取代亚胺的希夫碱键。参见图19。
注使取代亚胺稳定同时将该复合物附着至珠子表面，通过由碳酰肼促进的还原。这种类型的反应方案称为还原性胺化。
7.3、固定至荧光珠子 羧酸标记的珠子利用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。活化之后与碳酰肼反应。反应性醛官能团自发地与酰肼反应生成腙，其然后被还原以使共价键稳定。参见图20。
注图20中的蛋白质(R”)带有多个-NH2基团，因此能够与多个氧化LPS实体轭合。另一方面，在单个分子中，LPS中的多糖部分可以带有多个游离醛基。这些醛基可以由珠子上的酰肼层部分或完全捕获。净结果可以是共价连接于珠子表面的蛋白质-LPS的非常稳定的复合物网络。
8、试剂和材料 在完全的步骤中，仅使用认定为分析级的试剂和蒸馏水或等价纯度的蒸馏水，除非另有指明。提到的公司仅用于提供信息和鉴定，而不意味着推荐，除非如此陈述的。
8.1、化学品 8.1.1乙酸(J.T.Baker，Deventer，The Netherlands) 8.1.2胺偶联试剂盒(Biacore AB，Uppsala，Sweden)，由以下构成 8.1.2.1容纳115mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的小瓶 8.1.2.2容纳750mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的小瓶 8.1.2.3容纳10.5ml，c＝1mol/l的乙醇胺盐酸盐-氢氧化钠pH8.5的小瓶 8.1.3Bio-Plex校准试剂盒(Bio-Rad，Veenendaal，theNetherlands) 8.1.4碳酰肼，CN4H6O(Fluka Chemie GmbH，Buchs，Switzerland) 8.1.5羧甲基-葡聚糖钠盐(Fluka) 8.1.6磷酸二氢钾(KH2PO4)(Merck，Darmstadt，Germany) 8.1.7Proclin 150(Supleco，Bellefonte，PA，USA) 8.1.8单克隆抗沙门氏菌O-抗原 8.1.8.1.抗-O4(SIFIN，Berlin Germany) 8.1.8.2.抗-O5(SIFIN) 8.1.8.3.抗-O61(SIFIN) 8.1.8.4.抗-O7(SIFIN) 8.1.8.5.抗-O8(SIFIN) 8.1.8.6.抗-O9(SIFIN) 8.1.8.7.抗-O10(SIFIN) 8.1.9沙门氏菌LPS，通过TCA提取(SOP CHEMIE/A21)自身分离(in-house isolated)的LPS，制备自具有蛋白质的沙门氏菌血清肠炎变型(Se)、黄金海岸(Sg)、利文斯通(Sl)、火鸡(Sm)和鼠伤寒(St)(SOP CHEMIE/A23)。
8.1.10羊抗-小鼠Ig-PE(Chemicon，Boronia，Victoria，Australia) 8.1.11三水合乙酸钠(J.T.Baker，Phillipsburgh，NJ，USA) 8.1.12.氯化钠(Merck) 8.1.13.氰基硼氢化钠(NaCNBH3)(Fluka) 8.1.14.磷酸氢二钠(Na2HPO4)(Merck) 8.1.15.氢氧化钠，c＝50mmol/l(Biacore) 8.1.16.偏高碘酸钠(NaIO4)(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，theNetherlands) 8.1.17.水获自Milli Q水纯化系统 8.2.溶液 8.2.1.乙酸溶液，c＝0.1g/ml 8.2.2.乙酸盐缓冲液，c＝10mmol/l，pH 4.0 8.2.3.乙酸盐缓冲液，c＝1.0mol/l，pH 5.5 8.2.4.乙酸盐缓冲液，c＝100mmol/l，pH 5.5 8.2.5.碳酰肼溶液，c＝100mmol/l 8.2.6.碳酰肼溶液，c＝5mmol/l 8.2.7.EDC-溶液在10.0ml水中重建EDC(8.1.2.2.)。
8.2.7.1.在聚丙烯管中分馏这种溶液(8.2.7)的100-μl等分试样。储存在-18℃或更低温度下。该等分试样在两个月稳定。使用之前，解冻等分试样并温和搅拌它们以确保获得均匀溶液。
8.2.8.乙醇胺溶液在聚丙烯管中用滴管吸取200μlc＝1mol/l乙醇胺溶液(8.1.2.3)。
8.2.9.NHS-溶液在10.0ml水中重建NHS(8.1.2.1)。
8.2.9.1.在聚丙烯管中分馏这种溶液(8.2.9)的100-μl等分试样。储存在-18℃或更低温度下。
8.2.10.PBS(5.6)，c＝100mmol/l，pH 7.2 8.2.11.PBS，c＝10mmol/l，pH 7.2 8.2.12.抗-小鼠Ig-PE，预稀释通过将40μl抗-小鼠Ig-PE(0)与160μl PBS(8.2.11)混合而将荧光轭合物稀释5倍。
8.2.13.氰基硼氢化钠，c＝1.00mol/l 8.2.14.氰基硼氢化钠，c＝100mmol/l 8.2.15.氢氧化钠，c＝5mmol/l 8.2.16.偏高碘酸钠溶液，c＝100mmol/l. 8.2.17.“备用”偏高碘酸钠在1.4ml聚丙烯管中用滴管吸取100μl的偏高碘酸钠溶液，c＝100mmol/l(8.2.16)，并利用离心蒸发器干燥。
8.2.18.偏高碘酸钠溶液，c＝50mmol/l将“备用”偏高碘酸钠(8.2.17)溶解在200μl乙酸盐溶液中，c＝100mmol/l pH 5.5(8.2.4)。在正好要使用之前制备。
8.3.标准单克隆参考溶液 8.3.1.浓缩的单克隆沙门氏菌抗-O5(8.1.8.2)通过加入45μlPBS c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)将5μl抗-O5稀释10倍。
8.3.2.单克隆沙门氏菌抗-O5通过加入67.5μl PBS c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)而将7.5μl抗-O5(8.3.1)稀释10倍。
8.3.3.单克隆抗沙门氏菌O-抗原(8.1.8)在微滴定板(9.20)中利用67.5μl PBS(8.2.11)分别稀释7.5μl的各个单克隆(8.1.8.1、8.1.8.3、8.1.8.4、8.1.8.5、8.1.8.6、8.1.8.7)。
8.3.4.三倍稀释的单克隆抗体在相同微滴定板(8.3.3)的孔中，将25μl单克隆抗体溶液(8.3.2和8.3.3)加入到50μl PBS c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)中。
8.3.5.在抗-O4、抗-O6、抗-O7、抗-O8、抗-O9和抗-O10的情况下，在微滴定板的新孔中，重复步骤8.3.4两次以获得9倍和27倍稀释的抗体。在抗-O5的情况下，这些稀释因子分别是90倍和270倍。
8.3.6从最高溶液(8.3.5)取出25μl。
8.3.7抗体溶液现在备用。
注在抗-O5的情况下，最终稀释因子为100、300、900和2700倍，而在其他情况下，相比最初制剂(8.1.8)，抗体最终被稀释10、30、90和270倍。
8.4.辅助材料 8.4.1NAP-5柱(0.5ml，Sephadex G-25，Amersham Biosciences)。
8.4.2.COOH-珠子(5.6μm COOH微球体)编号24，25，26，27和28，以1.25x107个珠子/mL混合在0.01％含水硫柳汞中(BioRad)。
10.软件 BioPlex装置用Bio-Plex Manager软件4.1进行操作。
11.程序步骤 11.1.LPS溶液的氧化和脱盐 11.1.1.氧化 11.1.1.1.向干燥LPS(8.1.9；参见安全预防措施)中加入500μl乙酸盐缓冲液c＝100mmol/l，pH 5.5(8.2.4)。
11.1.1.2.涡旋该溶液(11.1.1.1)并声处理20min，并观察重建过程以使所有LPS溶解。
11.1.1.3.向该LPS溶液(11.1.1.2)中加入20μl高碘酸盐溶液c＝50mmol/l(8.2.18)。
11.1.1.4.涡旋该溶液(11.1.1.3) 11.1.1.5.避光情况下在冰上孵育40min。
11.1.1.6通过如在11.1.2中所述的使溶液(11.1.1.4)脱盐而淬灭氧化。
11.1.2.脱盐 11.1.2.1.将NAP-5柱(8.4.1)置于支架上。
11.1.2.2.通过使三个乙酸盐缓冲液c＝10mmol/l，pH 4.0(8.2.2)的3-ml部分在仅由重力产生的流动上的柱床上通过来调节柱子(11.1.2.1)。允许该缓冲液可以完全进入凝胶床。
11.1.2.3.在柱子上用滴管吸取0.5ml氧化的LPS溶液(11.1.1.5)。允许该样品可以完全进入凝胶床。不收集流过物(flow-through)。
11.1.2.4.利用1ml乙酸盐缓冲液c＝10mmol/l，pH 4.0(8.2.2)稀释氧化的LPS。在5-ml玻璃管中收集洗出液。
11.1.2.5.涡旋(9.21)该溶液(11.1.2.4)10s并加入2μL Proclin150(8.1.7)。
11.1.2.6.当不立即使用(11.1.2.5)时，在4℃至7℃储存样品。
11.1.2.7.在固定化之前，将可以用于不同基质和物种应用的含LPS溶液(11.1.2.5)如下表34和35所指明的加以稀释。
表34固定用于检测猪血清中针对沙门氏菌O-抗原的抗体的珠子所使用的LPS溶液的量 表35用于固定至用来检测小鸡血清中与沙门氏菌O-抗原反应的抗体的荧光珠子的LPS溶液的量 11.2.将LPS固定到珠子 11.2.1.将珠子(8.4.2)涡旋混合最少1min 11.2.2.将一部分300μL的珠子(11.2.1)转移到新容器中 11.2.3.以14,000g离心5min 11.2.4.利用200μl吸液管小心地从珠子移出上清液。
11.2.5.在小瓶中留下少量溶液(10μL)并在涡流上将珠子混合到剩余溶液中。
11.2.6.解冻两部分100μl EDC(8.2.7.1) 11.2.7.解冻两部分100μl NHS溶液(8.2.9.1)。
11.2.8混合180μl的EDC(11.2.6)和180μl的NHS(11.2.7)。
11.2.9.利用吸液管将300μL EDC/NHS混合物(11.2.8)转移到珠子(11.2.4)并严格(rigorously)悬浮。
11.2.10.促使回转摇杆上的反应20min。
11.2.11.以14,000g离心5min。
11.2.12.小心地从珠子移出上清液，在小球顶上留下少量体积(大约10μL)并使用涡流混合器悬浮珠子。
11.2.13.使用吸液管向珠子(11.2.12)加入300μL 5mM碳酰肼溶液(8.2.6)并严格悬浮。
11.2.14.促使回转摇杆上的反应20min。
11.2.15.以14,000g离心5min，从珠子除去上清液，在小球顶上留下少量体积(大约10μL)并使用涡流混合器悬浮珠子。
11.2.16.使用吸液管向珠子(11.2.15)加入300μL 1M乙醇胺溶液(8.2.8)并严格悬浮。
11.2.17.促使回转摇杆上的反应20min。
11.2.18.以14,000g离心5min，从珠子除去上清液，在小球顶上留下少量体积(大约10μL)并使用涡流混合器悬浮珠子。
11.2.19.使用吸液管加入300μL在乙酸钠c＝10mmol/l，pH 4.0(11.1.2.7)中的稀释氧化LPS并严格悬浮。
11.2.20.允许在回转摇杆上的反应90min。
11.2.21.以14,000g离心5min，从珠子除去上清液，在小球顶上留下少量体积(大约10μL)并使用涡流混合器悬浮珠子。
11.2.22.使用吸液管加入300μL氰基硼氢化物溶液c＝100mmol/l(8.2.14)并严格悬浮。
11.2.23.促使回转摇杆上的反应60min。
11.2.24.以14,000g离心5min，仔细从珠子除去上清液，在小球顶上留下少量体积(大约10μL)并使用涡流混合器悬浮珠子。
11.2.25.加入300μL PBS(8.2.11). 11.2.26.加入1μL Proclin 150(8.1.7)并混合悬浮液 11.2.27这些珠子备用于测试生物材料中的沙门氏菌抗体 11.2.28.计数LPS偶联的珠子 11.2.28.1.涡旋LPS偶联的珠子悬浮液(11.2.25)并转移1μL到新的1-mL管中 11.2.28.2.通过加入24μL PBS c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)进行稀释并混合。
11.2.28.3Bürker-Türk计数室的外部支架(载体)要用milliQ水(8.1.17)潮湿并且将盖玻片轻轻地从前方推到计数室上。
11.2.28.4用20μl珠子溶液(11.2.28.2)填充吸液管，在吸液管尖部逐渐地形成液滴。
11.2.28.5该液滴(11.2.28.4)要置于盖玻片和计数室之间。
11.2.28.6作为毛细管效应的结果，盖玻片和计数室(chamberbase)之间的缝隙被填满。在珠子溶液可以在小室部分的边缘处溢出之前，吸液管尖部必须移走。如果任何气泡是可见的或如果液体已经溢出边缘并进入凹槽中，则小室必须清洗并且必须重复供料。
11.2.28.7将填充后的计数室置于显微镜下并利用10x物镜放大图像。
11.2.28.8计数应从左上角处开始并沿着通过箭头所示的方向(图23，下图)。计数可以利用显微镜照射减少来增强。
11.2.28.9计数进入粗线区域(参见图24)的16个方格中的珠子数(图23，上图)。
11.2.28.10关于计数的备注 11.2.28.10.1对所有小室使用减少的显微镜照射。
11.2.28.10.2在大方格和组方格(group squares)中计数细胞的差必须不超过10个细胞。
11.2.28.10.3对所有细胞计数必须进行双重核查。在计数两个计数净值之后，底部计数净值以相同方式作为检查进行计数。当进行这种计数时，确保小室没有干透。这可通过仅在计数之前短时间内填充底室并在沉降时间之后计数而得到防止。
11.2.28.10.4对于两个计数净值的总数之间的差必须不超过10个细胞。然后计数的平均值用于计算公式或由相应的因子相乘。
11.2.28.11使计数得到的数值(11.2.28.9)乘以稀释因子(25x)除以计数面积(1mm2)(乘以小室深度)以计算每ml的珠子浓度。
11.3.抗-沙门氏菌抗体的检测 11.3.1.使BioPlex设备可操作，依照快速指导，通过一个30分钟激光升温步骤，接着是开始和利用恰当校准溶液(8.1.3)的校准程序。
11.3.2.利用PBS c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)混合并稀释LPS涂覆的珠子(11.2.26)，以使每一个珠子的浓度等于5000/ml。
11.3.3.将50μL珠子混合物(11.3.2)转移到已用稀释的单克隆抗-O抗原(8.3.7)填充的微滴定板中。
11.3.4.在微滴定板摇床上孵育30min。
11.3.5.加入10μL 5倍稀释的抗-小鼠Ig-PE(8.2.12)。
11.3.6.在微滴定板摇床上孵育15min。
11.3.7.注意载入样品孔及它们的含量。
11.3.8.将板放入BioPlex中，设定最大计数时间为120s并且每个LPS组计数至少50个珠子。
11.3.9.激活软件程序以计数珠子的荧光，其已捕获了(荧光)抗体。
对于过程步骤的示意图，参见图21。
沙门氏菌单克隆抗体的典型响应在表36中提供。
表36利用LPS涂覆的珠子孵育的参考血清的典型响应和提供信号的第二荧光抗体
实施例10 温和高碘酸盐氧化 抗-沙门氏菌抗体最终结合的成功，由此在动物中筛选侵入性感染的成功，严重依赖于LPS多糖部分的单糖组分的氧化，以及LPS核心区域的寡糖部分。从对于例如沙门氏菌的不同血清型所描述的结构可以推断，氧化可以导致抗原性结构的破坏，该抗原性结构尤其是LPS多糖部分的一部分。
而己糖醇的氧化快速地发生，吡喃糖苷，其主要存在于沙门氏菌LPS中，需要更高的高碘酸盐浓度以同时促进氧化。吡喃糖苷，其具有α-赤式-羟基，如在沙门氏菌属LPS中的阿拉伯糖、半乳糖或甘露糖构型中，比α-苏式-羟基，如在木糖(xylo)或葡糖(gluco)变体中更易于氧化。应当认识到，虽然环被打开并且形成用于附着例如蛋白质分子的醛基，但也形成α-羟基羰基化合物，如果仍然存在高碘酸盐其可以再次氧化。因此，是非轭合单糖(其因而不是寡糖或多糖的一部分)被高碘酸盐氧化而完全破坏成在足够高浓度氧化剂下的甲酸和甲醛。在相对较高浓度的高碘酸盐下，1，3-二酮以及二轴性二醇(di-axial diol)可以被氧化。
因此，多于仅形成醛基的破坏(分解)或氧化反应将导致不能检测生物材料样品中的感染，尽管与由存在含多胺的分子如蛋白质支持的固体相的有良好偶联反应。换句话说，需要温和的高碘酸盐反应以保持抗原结构完整，但仅足以使蛋白质和由此的固体相之间的偶联能够进行拮抗。
结果 来自Se、Sg、Sl和St的LPS使用一系列浓度的偏高碘酸钠在pH 5.5下氧化40min。氧化之后，将LPS偶联至生物传感器表面并监测固定化效率和抗原活性。
从图25很明显的是，越高氧化级别的来自肠炎沙门氏菌的LPS在生物传感器芯片处产生相应更高的涂覆水平。然而，尽管固定化水平更高，但是来自抗体探测的响应降低，如图26和27所示。对于这种类型的LPS，确定了最佳高碘酸盐浓度为1.8mM。
以类似方式，测试了来自黄金海岸沙门氏菌的LPS对于固定化和抗原活性的氧化效果(图28和29)。对于高碘酸钠在1.8mM发现相同的最佳浓度。对于利文斯通沙门氏菌获得类似的结果(图30和31)。这里也发现1.8mM偏高碘酸盐的最佳浓度。
实施例11 从沙门氏菌属提取脂多糖 0.引言 沙门氏菌是革兰氏阴性细菌，并且其外膜由各种抗原性结构构成，包括鞭毛、外膜蛋白质和脂多糖(LPS)。LPS的分子由所谓的脂质A部分(其嵌入到外膜的小叶中)、核心区域和多糖构成。核心区域由两种或三种庚糖以及8个碳原子的两个或三个残基(带负电荷的单糖KDO)组成。核心区域将脂质A键接至多糖，其也称为O-侧链。该O-侧链相对于其长度和菌株(张力，strains)之间的组成是高度可变的，而且在受沙门氏菌生长条件影响的菌株中。尽管变异，但在PS中编码的抗原结构对于某些沙门氏菌血清变型是独特的。实际上，抗原结构O3、O4、O6/7、O8、O9、O10和O12代表大约90％的已知在猪产品(尤其是在荷兰屠宰场)上出现的沙门氏菌血清变型。
为了检测作为农场动物暴露于沙门氏菌的指示的对O抗原的体液响应，LPS可以用来探测出现的抗体与这些生物分子的结合。为此，可提取LPS，其来自鼠伤寒沙门氏菌(O4、O5、O12)、肠炎沙门氏菌(O9、O12)、利文斯通沙门氏菌(O6/O7)、黄金海岸沙门氏菌(O6、O8)和火鸡沙门氏菌(O3、O10)。
自身(或内在)提取是首要的，因为仅来自有限数量的沙门氏菌血清变型的LPS可商购获得。此外，自身生产可以确保LPS类型的连续可利用性以用于成功抗体检测测定。用于该目的的这里描述的自身提取方法是基于由Staub描述的方案的，三氯乙酸(TCA)提取含1-10％蛋白质污染物的LPS。这种产品适合于将LPS共价固定至在生物传感器芯片的金金属表面上涂覆的羧甲基化葡聚糖层上(参见SOP CHEMIE/A22(实施例12))。这种固定有LPS的芯片，联合Biacore光学SPR生物传感器系统，可以用来跟踪血清中的沙门氏菌-LPS抗体，也称为血清学。
1.应用的范围和领域 这种方法描述了利用三氯乙酸从多种沙门氏菌血清变型提取LPS。提取的LPS适合于改性以促进其固定化到羧甲基化葡聚糖表面上。
2.参照 Staub，A.M.，Methods in Carbohydrate Chemistry，5，92(1965) SOP Chemie/A22沙门氏菌来源的LPS固定到生物传感器芯片(Biacore)上以及报告目前或过去沙门氏菌感染的血清抗体的检测(实施例12)。
SOP Chemie/A23蛋白质加入到用于血清抗体的固定化和检测的LPS的优化(实施例13)。
3.定义 c＝浓度，单位为％(m/v)、％(v/v)、mol/l或mmol/l，如所指明的。
5.原理 脂多糖(LPS)通过在三氯乙酸(TCA)辅助下提取沙门氏菌而生产。沙门氏菌在脑心浸渍琼脂板上培养，然后收集。在利用盐水溶液的多个清洗步骤和多个离心步骤之后，加入TCA。酸化的悬液在低温下孵育三小时以使来自细菌细胞的LPS溶解。离心悬液以除去细胞材料并中和pH。然后将LPS在低温下通过乙醇沉淀部分纯化和浓缩。最后，通过渗析除去盐和乙醇，并将残留的含LPS溶液中的剩余颗粒通过离心旋掉。上清液冷冻干燥并称重以确定生产的LPS的回收。
6.试剂和材料 在程序步骤期间，除非另有指明，仅使用认可的分析级试剂和仅使用蒸馏水或等同纯度的水。提到的公司仅用于提供信息和确定而不是暗示推荐，除非这样指明的。
6.1化学品 6.1.1亮绿琼脂(Brilliant Green Agar)(Oxoid，Basingstroke，England，CM329) 6.1.2脑心浸液(Oxoid，CM225) 6.1.3脑心浸液琼脂(Oxoid，CM375) 6.1.4乙醇，无水(Merck，Darmstad，Germany，1.00983.2500) 6.1.5甘油87％(Merck，1.04091.1000) 6.1.6营养肉汤2#(Oxoid，67) 6.1.7氯化钠(Merck，1.06404.1000) 6.1.8氢氧化钠(Merck，1.06498.1000) 6.1.9乙二醇(Merck，9621.2500)) 6.1.10三氯乙酸(Merck，1.00807.0250) 6.1.11获自Milli Q纯化系统的水(8.24) 6.2沙门氏菌凝集血清 6.2.1抗-O4(Pro-Lab diagnostics，Salmonella reference section ofthe Central Veterinary Laboratory，Weybridge，Great Britain) 6.2.2抗-O5(Pro-Lab diagnostics) 6.2.3抗-O6，7(Pro-Lab diagnostics) 6.2.4抗-O8(Pro-Lab diagnostics) 6.2.5抗-O9(Pro-Lab diagnostics) 6.2.6抗-O 12(Pro-Lab diagnostics) 6.2.7抗-O Poly A-S(对组A至S的抗血清)(Pro-Labdiagnostics) 6.2.8抗-O Poly E(对因子O3，O10，O15，O19，O 34的抗血清)(Pro-Lab diagnostics) 6.3细菌菌株 6.3.1肠炎沙门氏菌(#23，噬菌体型1菌株RIVM，TheNetherlands；90-16-706) 6.3.2黄金海岸沙门氏菌(Division’s working bank，UtrechtUniversity，The Netherlands) 6.3.3利文斯通沙门氏菌(Division’s working bank) 6.3.4火鸡沙门氏菌(Division’s working bank) 6.3.5鼠伤寒沙门氏菌X-193(ASG，Lelystad) 6.4试剂 6.4.1亮绿琼脂(BGA)板在1.01水(6.1.11)中悬浮52g的BGA(6.1.1)。煮沸以完全溶解介质。在培养皿中良好混合并用掉15ml的部分。
6.4.2脑心浸渍(BHI)肉汤将37g的BHI肉汤(6.1.2)溶解在1.0l水(6.1.11)中。良好混合，分到最终容器中并通过在121℃高压蒸气灭菌15min而消毒。
6.4.3脑心浸渍琼脂(BHIa)将47g BHI琼脂(6.1.3)悬浮在1.0l水(6.1.11)中。煮沸以完全溶解介质。在培养皿中良好混合并用掉15ml的部分。
6.4.4冷却溶液混合1.0l乙二醇(6.1.9)与3l水。
6.4.5冷乙醇将1l乙醇(6.1.4)储存在冰箱(-18℃)中。
6.4.6甘油87％灭菌121℃高压蒸气灭菌50ml甘油(6.1.5)15min。
6.4.7营养肉汤(NB)将25g NB(6.1.6)溶解在1.0l水(6.1.11)中。良好混合，分入100ml烧瓶中并通过121℃高压蒸气灭菌15min进行消毒。
6.4.8盐水(c＝0.9％(m/v))将9g氯化钠(NaCl)(6.1.7)溶解在1.0l水(6.1.11)中。使用之前，在冰箱中冷却盐水过夜。
6.4.9三氯乙酸(TCA)溶液，c＝0.25mol/l 6.4.10三氯乙酸(TCA)溶液，c＝0.50mol/l 6.4.11氢氧化钠(NaOH)溶液，c＝5.0mol/l 6.4.12氢氧化钠(NaOH)溶液，c＝0.10mol/l 8.程序步骤 8.1制备原培养物 8.1.1通过铺展一个菌落制备沙门氏菌(6.3)的分离物，或者在BGA板(6.4.1)上的接种环的含量。
8.1.2在37℃孵育该板(8.1.1)过夜。
8.1.3单个菌落利用接种环从该板(8.1.2)挑出，并悬浮在100mlNB(6.4.7)中。
8.1.4在37℃孵育过夜。
8.1.5将50ml甘油(6.4.5)加入到100ml培养的NB介质(8.1.4)中。
8.1.6将培养物/甘油混合物(8.1.5)等分成十一个14ml(12.5ml体积)和十二个1.5ml(1ml体积)无菌管。
8.1.71.5ml管之一标记为标准空白。该管的内含物将经由这里描述的方法(8.1)仅用于制备更多的1和12.5ml的等分试样。
8.1.8在-80℃(8.1.6)下快速冷冻等分试样并储存直至使用。
8.2通过凝集作用确定沙门氏菌分离物纯度 8.2.1用吸液管吸取25μl无菌盐水(6.4.8)到盖玻片上。
8.2.2将来自该板培养的沙门氏菌(8.1.2)的一个菌落悬浮在盐水(6.4.8)中。
8.2.3使用促进容器液滴系统加入一滴凝集血清(6.2) 8.2.4通过来回轻轻倾斜载玻片2min而混合血清和悬液。
8.2.5通过在背景前方观察凝集形成而确定凝集作用。
8.2.6通过对照表37的凝集结果而公开沙门氏菌菌株的同一性。
8.2.7当培养菌株的同一性不同于表37中的预期凝集作用时，可以推断所测试的培养物不是(排他地)由预期沙门氏菌血清型构成。在这样的情况下，必须制备新的原培养物。
8.3提取方法 8.3.1制备120BHI琼脂板(6.4.3)。
8.3.2解冻具有沙门氏菌原培养物(8.1.8)的12.5ml管。
8.3.3用压舌片将100μl原培养物(8.1.8)铺展到每个板(8.3.1)上。
8.3.4在37℃孵育过夜。
8.3.5用10l水(6.1.11)填充15l容器，并在冰箱中冷却至4-8℃直至进一步使用。
8.3.6称重6个空离心管并将它们记录在定性纸(quality sheet)上的重量(参见图32)。
8.3.7将milliQ(6.1.11)和TCA(6.4.9，6.4.10)容器放入制备的冰盐浴中。
8.3.8取20个板(8.3.4)，过夜孵育的板并将1ml的盐水加入到每一个板中。
8.3.9通过在琼脂上方轻刮(做圆周运动)Drigalski压舌片而收获细菌，在盐水中形成该细菌的悬液。
8.3.10将该悬液收集到6个预称重离心管(8.3.6)之一中。
8.3.11利用2ml盐水(6.4.8)溶液清洗每一个板(8.3.9)两次。
8.3.12合并悬液(8.3.11)与离心管(8.3.10)的内含物。
8.3.13对于剩余板(8.3.4)重复步骤8.3.8至8.3.125次。
8.3.14将100ml盐水(6.4.8)加入到每一个离心管中。
8.3.15称管(8.3.14)的皮重 8.3.16以10,000xg和4℃下离心15min。
8.3.17将上清液轻轻倒入废物容器中。
8.3.18将每一个细菌小球悬浮到10ml盐水(6.4.8)中直至形成平稳悬液。
8.3.19向每一个离心管加入75ml盐水(6.4.8)。
8.3.20重复步骤8.3.14至8.3.19一次。
8.3.21重复步骤8.3.15至8.3.17一次。
8.3.22称重具有细菌小球(8.3.21)的管并在定性纸片上记录重量结果(参见图32)。
8.3.23通过含有细胞的管(8.3.22)的重量减去空(管)(8.3.6)的重量而确定沉积细菌的质量(＝m)。
8.3.24通过重复用10ml吸液管引入和清洗，将细菌小球(8.3.22)利用x ml(对于x的确定，参见表38)的水(6.1.11)加以悬浮。
8.3.25将两个离心管中的悬液合并到一个管中。
8.3.26对于剩余离心管重复8.3.25。
8.3.27加入x ml的y M TCA(6.4.10)(对于数值x和y，参见表38)。
8.3.28在每一个悬液(8.3.27)中插入搅拌棒。
8.3.29在磁力搅拌器上在4℃搅拌悬液(8.3.28)3h。
8.3.30移走搅拌棒。
8.3.31以20,000xg和4℃下离心悬液30min。
8.3.32将离心管的上清液收集到500-ml大口杯中。
8.3.33利用5M NaOH(6.4.11)和0.10M NaOH(6.4.12)将上清液的pH调节至pH 6.5。
8.3.34确定pH调节后的上清液(8.3.33)的体积(v)。
8.3.35通过将填充后的烧瓶(8.3.34)放入-18℃冰箱30min而将上清液冷却至冰点。
8.3.36加入2*e ml(对于e的值，参见表38)冷冻乙醇(6.4.5)。
8.3.37在-4℃冷却该溶液过夜。
8.3.38将该溶液分配到6个离心管中。
8.3.39以20,000xg和-4℃离心该溶液30min。
8.3.40从渗析管切割3部分(每一部分长度为10cm)。
8.3.41用水(6.1.11)短暂清洗渗析管(8.3.40)并使它们在水(6.1.11)中保持潮湿直至进一步使用。
8.3.42在渗析管(8.3.41)的一端夹上膜夹具，留下1cm管子自由。
8.3.43将上清液(8.3.39)轻轻倒入废物瓶中。
8.3.44在吸液管的帮助下从离心管移出剩余的上清液。
8.3.45向每一个离心管(8.3.44)加入1ml水(6.1.11)。
8.3.46通过利用1-ml吸液管引入和洗出而悬浮小球。
8.3.47利用两个离心管的再悬浮小球(8.3.46)填充制备的渗析袋(8.3.42)之一。
8.3.48利用(z-1)/6ml(对于z的值，参见表38)水(6.1.11)清洗每一个管并将洗出物(wash)与渗析袋(8.3.47)中的内含物合并。
8.3.49在填充后的渗析管(8.3.48)的顶端夹上另一个夹具(6.10)，在溶液和夹具之间留下小气泡。
8.3.50对于剩余的离心管重复步骤8.3.42至8.3.49。
8.3.51将三个填充后的渗析管放入在4℃的预冷却水(8.3.5)中。
8.3.52在磁力搅拌器在4℃的连续温和搅拌条件下，将管(8.3.51)的内含物孵育渗析两天。
8.3.53更新渗析液至少两次，通过用7l新鲜预冷却水(6.1.11)交换所用的水。
8.3.54将渗析管中的内含物收集到50-ml容器中。
8.3.55将收集的体积(8.3.54)分到离心管中。
8.3.56以20,000xg在4℃离心该管30min。
8.3.57在分析天平上称重空的50-ml容器(7.8)(没有盖)并在定性纸上记录其重量(参见图32)。
8.3.58将上清液(8.3.56)收集到预称重容器(8.3.57)中。
8.3.59在-80℃冰箱(6.15)中冷冻上清液。
8.3.60冻干(6.15)该冷冻的上清液(8.3.59)直至观察到干燥白色结晶结构。
在分析天平上称重冻干的容纳LPS的容器(8.3.60)并在定性纸片上记录所得质量(参见图32)。
8.3.62计算LPS的收率(LPS(8.3.61)重量-容器(8.3.57)重量)/湿细胞(8.3.23)总质量*100％。
8.3.63将冻干LPS粉末储存在4℃的密闭容器中直至进一步的使用。
程序步骤的概述在图33中示出。
表37用于凝集读数的核对板以披露存在的细菌在沙门氏菌种和沙门氏菌血清变型方面的同一性
图例+＝聚集体形成，凝集阳性 -＝没有聚集体形成，凝集阴性 表38确定水(x)、TCA(x)、乙醇(e)的体积以及用于提取和沉淀的TCA浓度(y)，以及用于渗析步骤以从沙门氏菌分离和纯化LPS的水(z)的体积。字母备注m是指质量(9.3.23)，而v是指pH调节的上清液体积(9.3.34)。

n.e.y还没有建立。
实施例12 沙门氏菌来源的LPS固定到生物传感器芯片(Biacore)上以及报告目前或过去沙门氏菌感染的血清抗体的检测 1.引言 在仔细选择的LPS提取和分离(参见SOP CHEMIE/A21(实施例11))之后，含抗原的LPS共价偶联至生物传感器芯片表面，以监测血清学样品中抗-沙门氏菌抗体的存在，其中通过这些抗体结合至在芯片表面固定化的含抗原的LPS(参见SOP CHEMIE/A23(实施例13))。该SOP描述了用于氧化、固定LPS到生物传感芯片(BIACORE)上以及血清中抗体的分析的方法。
2.应用的范围和领域 为了分析来自小鸡的血清样品中与O4、5、6、7、8、9和12菌体抗原反应的抗沙门氏菌抗体的存在。
3.参考文献 Concentration Analysis Handbook，Version AA，December 2001，Biacore AB，Uppsala，Sweden； BIAapplications Handbook，version AB(reprinted 1998)，Biacorehttp://www.jp.amershambiosciences.com/tech_support/manual/pdf/dnapuri/52207400af.pdf. SOP Chemie/A21来自沙门氏菌属的脂多糖的提取(实施例11) SOP Chemie/A23蛋白质加入到用于血清抗体的固定化和检测的LPS的优化(实施例13)。
4.定义 c＝浓度，单位为％(m/v)、％(v/v)、mol/l或mmol/l，如所指明的。
6.原理 LPS在通过高碘酸钠促进的蛋白质存在下进行氧化。LPS-蛋白质溶液使用NAP-5柱子脱盐。在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳酰肼盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及碳酰肼帮助下，在活化生物传感器芯片上的羧甲基葡聚糖层之后，将LPS-蛋白质复合物固定到CM5-芯片上。然后结合的LPS利用氰基硼氢化钠稳定。在常规使用之前，生物传感器芯片轭合的LPS结合抗-沙门氏菌抗体的性能利用参考多克隆凝集血清面板进行评价。
7.反应 7.1糖类部分的氧化 参见实施例9。
7.2轭合至蛋白质 参见实施例9。
7.3固定化至传感器表面 参见实施例9。
8.试剂和材料 在整个程序步骤中，仅使用认可的分析级试剂以及仅使用蒸馏水或等同纯度的水，除非另有指明。提到的公司仅用于提供信息和鉴定，而不意味着推荐，除非如此指明。
8.1化学品 8.1.1乙酸(J.T.Baker，Deventer，The Netherlands) 8.1.2胺偶联试剂盒(Biacore AB，Uppsala，Sweden)，由以下构成 8.1.2.1容纳115mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的小瓶 8.1.2.2容纳750mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的小瓶 8.1.2.3容纳10.5ml，c＝1mol/l，乙醇胺盐酸盐-氢氧化钠pH 8.5的小瓶 8.1.3CHAPS(Plus one，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden) 8.1.4碳酰肼，CN4H6O(Fluka Chemie GmbH，Buchs，Switzerland) 8.1.5羧甲基葡聚糖钠盐(Fluka) 8.1.6甘氨酸，c＝10mmol/l pH 1.5(Biacore) 8.1.7盐酸胍(Calbiochem，San Diego，CA，USA) 8.1.8HBS-EP缓冲液(Biacore)，含有HEPES缓冲液，c＝10mmol/l，pH 7.4，氯化钠，c＝150mmol/l，EDTA，c＝3mmol/l和表面活性剂P20，c＝0.005％(v/v)。
8.1.9沙门氏菌抗属(anti group)特异性单克隆试验试剂 8.1.9.1抗沙门氏菌属B(gr.B)(SIFIN，Berlin，Germany)，含有mAb抗-O4，O5，O27 8.1.9.2抗沙门氏菌属C(SIFIN)，含有mAb抗-O7，O8 8.1.9.3抗沙门氏菌属D(SIFIN)，含有mAb抗-O9，Vi 8.1.9.4抗沙门氏菌属E(SIFIN)，含有mAb抗-O3，O19 8.1.10沙门氏菌单价“O”菌体抗血清 8.1.10.1抗-O4(Pro-Lab diagnostics，Salmonella reference sectionof the Central Veterinary Laboratory，Weybridge，Great Britain) 8.1.10.2抗-O5(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.3抗-O6，7(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.4抗-O8(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.5抗-O9(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.6抗-O10(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.7抗-O 12(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.8抗-O 19(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.9抗-O Poly E(O3，O10，O15，O19，O34；Pro-Labdiagnostics) 8.1.11沙门氏菌多价“O”菌体抗血清 8.1.11.1抗-O Poly A-S(O2，O3，O4，O5，O6，7，O8，O9，O10，O11，O12，O13，O15，O16，O17，O18，O19，O20，O21，O22，O23，O28，O30，O34，O35，O38，O40，O41；Pro-Lab diagnostics) 8.1.12具有蛋白质的沙门氏菌LPS，通过TCA提取自身分离的LPS(SOP CHEMIE/A21(Example 11))，制备自沙门氏菌肠炎血清变型(Se)、黄金海岸血清变型(Sg)、利文斯通血清变型(Sl)、火鸡血清变型(Sm)和鼠伤寒血清变型(St)(SOP CHEMIE/A23，实施例13) 8.1.12.10.5mg LPS的等分试样储存在+4℃或更低温度下。
8.1.13禽鸟参考血清 8.1.13.1SPF-CH，称为阴性对照血清的SPF血清(Animal HealthService Ltd.(GD)，Deventer，The Netherlands) 8.1.13.2EIA-SE，来自小鸡的肠炎沙门氏菌阳性对照血清，用于ELISA(GD) 8.1.13.3EIA-ST，来自小鸡的鼠伤寒沙门氏菌阳性对照血清，用于ELISA(GD) 8.1.13.4SPA-PG，来自小鸡的鸡瘟沙门氏菌阳性对照血清，用于ELISA(GD) 8.1.135CH-SI，来自小鸡的婴儿沙门氏菌阳性对照血清，用于ELISA(GD) 8.1.14三水合乙酸钠(J.T.Baker，Phillipsburgh，NJ，USA) 8.1.15氯化钠(Merck，Darmstadt，Germany) 8.1.16氰基硼氢化钠(NaCNBH3)(Fluka) 8.1.17氢氧化钠，c＝50mmol/l(Biacore) 8.1.18高碘酸钠(Sigma Chemical Comp.，St.Louis，MO，USA) 8.1.19Triton X-100(Sigma) 8.1.20Tween 20(Sigma) 8.1.21Tween 80(Sigma) 8.1.22水获自Milli Q水纯化系统(MilliQplus) 8.2溶液 8.2.1乙酸溶液，c＝0.1g/ml 8.2.2乙酸盐缓冲溶液，c＝10mmol/l，pH 4.0 8.2.3乙酸盐缓冲溶液，c＝1.0mol/l，pH 5.5 8.2.4乙酸盐缓冲溶液，c＝100mmol/l，pH 5.5 8.2.5碳酰肼溶液，c＝100mmol/l 8.2.6碳酰肼溶液，c＝5mmol/l 8.2.7CHAPS溶液，c＝0.05％(m/v)将0.02g(8.2.3)溶解在40ml HBS-EP(8.2.8)中。
8.2.8洗涤剂溶液，c＝0.3％(m/v)将0.3g的CHAPS(8.2.3)、0.3g Tween 20(8.2.21)、0.3g Tween 80(8.2.22)和0.3g Triton X-100(8.2.20)溶解在100ml水中。
8.2.9EDC-溶液在10.0ml水中重建EDC(8.1.2.2)。
8.2.9.1将溶液(8.3.9)的100μl馏分储存在-18℃或更低温度下的聚丙烯管(9.12)中。等分试样在两个月内稳定。
8.2.9.2在使用之前解冻冷冻等分试样并温和搅拌它们以确保均匀溶液。
8.2.10乙醇胺溶液用吸液管吸取200μl c＝1mol/l乙醇胺溶液(8.1.2.3)到聚丙烯管中。
8.2.1l胍溶液，c＝6mol/l将17.18g盐酸胍(8.2.7)溶解在10ml洗涤剂溶液(8.3.8)中，并利用甘氨酸缓冲溶液(8.2.6)将体积调节至30ml。
8.2.12NHS-溶液在10.0ml水中重建NHS(8.1.2.1)。
8.2.12.1将该溶液(8.3.12)的100-μl等分试样分馏到聚丙烯管(9.12)中。储存在-18℃或更低温度下。等分试样在两个月内是稳定的。
8.2.12.2在使用之前解冻冷冻的等分试样并温和搅拌它们以确保均匀溶液。
8.2.13样品稀释缓冲液将2g羧甲基-葡聚糖钠盐(8.2.5)、9.97g氯化钠(8.2.15)和0.1g Tween 80(8.2.22)溶解在200ml HBS-EP(8.2.8)中。
8.2.14氰基硼氢化钠，c＝1.00mol/l 8.2.15氰基硼氢化钠，c＝100mmol/l 8.2.16氢氧化钠，c＝5mmol/l 8.2.17高碘酸钠溶液，c＝100mmol/l 8.2.18“备用”高碘酸钠用吸液管吸取100μl高碘酸钠溶液，c＝100mmol/l(8.3.17)到1.4ml聚丙烯管中并利用离心蒸发器干燥。
8.2.19高碘酸钠溶液，c＝50mmol/l将“备用”高碘酸钠(8.3.18)溶解在200μl乙酸盐溶液，c＝100mmol/l pH 5.5(8.3.4)中。
8.3标准参考溶液 8.3.1沙门氏菌抗-O血清在微滴定板中将20μl每一种血清(8.2.10和8.2.11)稀释在380μl样品稀释缓冲液(8.3.13)中，除了抗-O5血清将2μl的这种血清(8.2.10.2)稀释在400μl样品稀释缓冲液(8.3.13)中。
8.3.2沙门氏菌抗-属特异性试验试剂将4μl的每一种血清(8.2.9.1，8.2.9.2，8.2.9.3和8.2.9.4)稀释在395μl样品稀释缓冲液(8.3.13)中。
8.3.3禽鸟参考缓冲液在微滴定板中，将6μl血清(8.2.13.1和8.2.13.3)稀释在295μl样品稀释缓冲液(8.3.13)中并将3μl血清(8.2.13.2和8.2.13.4)稀释在295μl样品稀释缓冲液(8.3.13)中。
8.3.4摇动。在要使用之前制备。
8.4辅助材料 8.4.1NAP-5柱子(0.5ml，Sephadex G-25，AmershamBiosciences)。
8.4.2CM5芯片(Biacore)。
10.软件 生物传感器设备用Biacore 3000控制软件4.1(1999-2003)操作。
11.程序步骤 11.1LPS溶液的氧化和脱盐 11.1.1氧化 11.1.1.1向LPS(8.2.12)加入500μl乙酸盐缓冲液pH 5.5(8.3.4)。
11.1.1.2充分涡旋直至小球溶解。
11.1.1.3声处理该溶液10分钟并调节溶液的清亮度。
11.1.1.4当清亮度不满意时，继续声处理直至获得清澈(恢复)的溶液。
11.1.1.5相LPS溶液(11.1.2.4)加入20μl高碘酸盐溶液(8.3.19)。
11.1.1.6涡旋溶液(11.1.2.5) 11.1.1.7在避光下在冰上孵育40min。
11.1.1.8通过如在11.1.3中所述的使溶液(11.1.2.6)脱盐而淬灭氧化。
11.1.2脱盐 11.1.2.1将NAP-5柱子(8.5.1)置于支架上。
11.1.2.2通过使乙酸盐缓冲液(8.3.2)的三个3-ml部分在仅由重力产生的流动上的柱床上通过来调节柱子(11.1.3.1)。允许该缓冲液可以完全进入凝胶床。
11.1.2.3用吸液管吸取0.5ml氧化的LPS溶液(11.1.2.8)到柱子上。允许样品完全进入凝胶床。
11.1.2.4利用1ml乙酸盐缓冲液(8.3.2)洗脱氧化的LPS。在5-ml玻璃管中收集洗出液。
11.1.2.5涡旋溶液(11.1.3.4)10s。
11.1.2.6当不是立即使用(11.1.3.5)时，将样品储存在4℃至7℃。
11.1.2.7在固定化之前，将含LPS的溶液如下表39所示进行稀释。
表39 11.2固定化 11.2.1制备 11.2.1.1解冻一部分的EDC(8.3.9.1) 11.2.1.2解冻一部分的NHS溶液(8.3.12.1)。
11.2.1.3将支架恒温器A(rack Thermo A)放入右侧支架位置(R2)和中间的试剂支架(RR)。
11.2.1.4要求引入CM5芯片(8.5.2)并用HBS-EP缓冲液(8.2.8)底涂(prime)。
11.2.1.5将EDC溶液(11.2.1.1)放入位置R2A1 11.2.1.6将NHS溶液(11.2.1.2)放入位置R2A2。
11.2.1.7将空的管(9.12)放入位置R2A3。
11.2.1.8将碳酰肼溶液(8.2.6)放入位置R2A4。
11.2.1.9将乙醇胺溶液(8.2.10)放入位置R2A5。
11.2.1.10将具有氧化的LPS(11.1.2.7)的溶液放入位置R2A6。
11.2.1.11将氰基硼氢化钠溶液(8.2.15)放入位置R2A7。
11.2.1.12将玻璃小瓶(9.10)中的6M胍溶液(8.2.11)放入位置RR2。
11.2.1.13将玻璃小瓶(9.10)中的CHAPS溶液(8.2.7)放入位置RR4。
11.2.2CM5芯片的固定化 11.2.3文件(参见图35)→新应用向导 11.2.3.1打开模板→搜索文件向导固定化(参见图36) 11.2.3.2填入记事本(参见图38) 11.2.3.3运行，下一个开始(next en start) 11.2.3.4注为了看到哪一个命令在向导中，进行编辑而不是运行 11.2.4保存感应图。结果文件以默认扩展名“.blr”保存。
11.2.5芯片备用于测试血清中的沙门氏菌抗体。
表40lps的典型固定化水平
11.3抗-沙门氏菌抗体的检测 11.3.1利用恰当CM5芯片使Biacore可操作。
11.3.2文件(参见图36)→新应用向导 11.3.2打开模板→搜索文件向导控制芯片固定化(参见图37) 11.3.2.2填入记事本(参见图38) 11.3.2.3运行，下一个开始 11.3.2.4注为了看到哪一个命令在向导中，进行编辑而不是运行 11.3.3保存感应图。结果文件以默认扩展名“.blr”保存。
用于LPS固定化的典型感应图示于图39中，而用于抗血清分析的典型感应图示于图40中。典型响应列于表41中。
表41沙门氏菌抗体血清的典型响应
实施例13 蛋白质加入到用于血清抗体固定化和检测的LPS的优化 0.引言 最近的研究表明，当在氧化之前将蛋白质加入到LPS时，可以形成固定至羧甲基化葡聚糖金层，并且在某些情况下得到改进。之后，也可以形成和改进血清学响应。最佳血清学响应依赖于加入LPS的蛋白质的百分数。
这种蛋白质效应可以通过加入血红蛋白而获得。血红蛋白是天然存在的蛋白质，其可以在所有温血脊椎动物中发现。因此，血清中的交叉反应性抗血红蛋白抗体没有预料到。
1.应用的范围和领域 这种方法描述了将一定量的血红蛋白加入到通过三氯酸提取生产的脂多糖(LPS)(参见SOP Chemie/A21脂多糖的提取和分离(实施例11))。最佳血红蛋白百分比限定为反应混合物获得高固定化水平连同阳性对照血清的最大血清学反应。此外，描述了用于传感器芯片上的固定化的LPS反应混合物(易于使用)的生产和储存。
2.参考文献 SOP Chemie/A21脂多糖的提取和分离(第3版；实施例11) SOP CHEMIE/A22沙门氏菌来源的LPS固定到生物传感器芯片(BIACORE)上以及报告目前或过去沙门氏菌感染的血清抗体的检测(第3版；实施例12) 4.原理 在SOP Chemie/A21(实施例11)中，描述了沙门氏菌属脂多糖(LPS)的生产。提取的LPS用作在Biacore 3000系统上实施的分析物分析的配体，以检测来源于猪和小鸡的血清中的抗-沙门氏菌抗体(参见SOP CHEMIE/A22(实施例12))。为了改善LPS的固定化，血红蛋白在氧化之前加入。为了生产大量材料原料以获得可再现的固定化水平、血清学数据和方法性能，将LPS用血红蛋白强化，分成等分试样并在4℃下储存之前干燥。为了固定芯片，将等分试样之一分批氧化并固定。
5.试剂和材料 5.1化学品 5.1.1乙酸(J.T.Baker，Deventer，The Netherlands) 5.1.2血红蛋白，猪(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，TheNetherlands) 5.1.3MilliQ水 5.1.4三水合乙酸钠(J.T.Baker，Phillipsburgh，NJ，USA) 5.2沙门氏菌凝集血清 5.2.1抗-O4(Pro-Lab diagnostics，Salmonella reference section ofthe Central Veterinary Laboratory，Weybridge，United Kingdom) 5.2.2抗-O5(Pro-Lab diagnostics) 5.2.3抗-O6，7(Pro-Lab diagnostics) 5.2.4抗-O8(Pro-Lab diagnostics) 5.2.5抗-O9(Pro-Lab diagnostics) 5.2.6抗-O10(Pro-Lab diagnostics) 5.2.7抗-O12(Pro-Lab diagnostics) 5.2.8抗-O19(Pro-Lab diagnostics) 5.2.9抗-O Poly A-S(组A至S的抗血清)(Pro-Lab diagnostics) 5.2.10抗-O Poly E(因子O3，O10，O15，O19，O34的抗血清)(Pro-Lab diagnostics) 5.3组特异性沙门氏菌抗血清 5.3.1Enteroclon抗沙门氏菌组B(Sifin，Berlin，Germany) 5.3.2Enteroclon抗沙门氏菌组C(Sifin) 5.3.3Enteroclon抗沙门氏菌组D(Sifin) 5.3.4Enteroclon抗沙门氏菌组E(Sifin) 5.4禽鸟参考血清 5.4.1SPF-CH，无特定病原(SPF)阴性对照血清(Animal HealthService Ltd.(GD)，Deventer，The Netherlands) 5.4.2EIA-SE，小鸡肠炎沙门氏菌阳性对照，用于ELISA(GD)。
5.4.3EIA-ST，小鸡鼠伤寒沙门氏菌阳性对照，用于ELISA(GD)。
5.4.4SPA-PG，小鸡鸡白痢沙门氏菌阳性对照，用于ELISA(GD)。
5.4.5CH-SI，小鸡婴儿沙门氏菌阳性对照，用于ELISA(GD)。
5.5猪参考血清 5.5.1Sw-Liv，ELISA(GD)中的猪利文斯通沙门氏菌阳性对照血清。
5.5.2SW-Typ，ELISA(GD)中的猪鼠伤寒沙门氏菌阳性对照血清。
5.5.3Sw-APP，ELISA(GD)中的猪胸膜肺炎防线杆菌(Actinobaccilus Pleuropneumoniae)阳性对照血清。
5.6脂多糖 如在SOP Chemie/A21(实施例11)中所述，提取、冻干和储存脂多糖(LPS)。
5.6.1肠炎沙门氏菌LPS 5.6.2黄金海岸沙门氏菌LPS 5.6.3利文斯通沙门氏菌LPS 5.6.4火鸡沙门氏菌LPS 5.6.5鼠伤寒沙门氏菌LPS 5.7试剂 5.7.1乙酸盐缓冲溶液，c＝10mmol/l，pH 4.0 5.7.2乙酸盐缓冲溶液，c＝1.0mol/l，pH 5.5 5.7.3血红蛋白原溶液，5mg/ml 5.8辅助材料 5.8.1CM5芯片(Biacore AB，Uppsala，Sweden). 7.程序步骤 7.1脂多糖原溶液的生产 7.1.1从冰箱收集生产的LPS(参见SOP Chemie/A21(实施例11))并使其适应室温。
7.1.2从定性数据纸找回管中生产的LPS(7.1.1)的重量(参见SOP Chemie/A21(实施例11))。
7.1.3使用公式1(9.1)计算要加入到LPS的mQ的体积。
7.1.4将计算得到的体积的mQ(7.1.3)加入LPS管(7.1.2)(终浓度LPS5mg/ml)。
7.1.5充分涡旋直至所有粉末溶解。
7.1.6声处理溶液10min并判断其清亮度。
7.1.7当清亮度(7.1.6)不满意时，持续声处理(6.6)直至获得清亮(恢复)的溶液。
7.2血红蛋白的加入 7.2.1制备4个(一个流动通道一个)在乙酸钠缓冲液中的LPS溶液(7.17)稀释液，其中在玻璃管(6.4)中如表42(8)所述具有可变的血红蛋白含量。
7.2.2加入到各个新制备的LPS提取批料中的反应性血红蛋白起始量的选择在表43(8)中给出。
7.2.3如表42(8)所述，利用mQ(5.1.3)填充到500μl总体积。
7.3氧化和脱盐(参见SOP Chemie/A22；chapter 10.1(实施例12)) 7.3.1从点10.1.1.2开始氧化。
7.4固定化(参见SOP Chemie/A22，chapter 10.2(实施例12)) 注固定利用4种不同相对量的血红蛋白(7.3)强化的氧化后的LPS到一个CM5芯片(5.8.1)上，使得每一个流动通道代表不同的相对量。
7.5抗沙门氏菌抗体的检测(参见SOP Chemie/A22，chapter 10.3(实施例12))。
7.6最佳血红蛋白百分比的确定 7.6.1计算每个流动通道的在(5.2)中列出的每一个凝集血清以及在(5.3)中列出的组特异性沙门氏菌抗血清的5个相对响应的平均值和标准偏差。
7.6.2生成一簇柱状图，其中在x-轴上是凝集和组特异性沙门氏菌抗血清的名称，而在y-轴上是对于所有不同相对量的血红蛋白(7.6.1)的相对响应单位(units)的平均值(参见一个实例图41)。
7.6.3计算每个流动通道的在(5.4)中列出的禽鸟参考对照血清以及在(5.5)中列出的猪参考血清的每一个的4个相对响应的平均值和标准偏差。
7.6.4生成一簇柱状图，其中在x-轴上是禽鸟对照和猪对照血清的名称，而在y-轴上是对于所有不同百分比的血红蛋白(7.6.3)的相对响应单位的平均值(参见一个实例图42)。
7.6.5通过对每一个x-轴柱使用标准偏差值，向两簇图(7.6.2，7.6.4)加入Y-误差棒(参见一个实例图41或42)。
7.6.6将所选阳性预期血清以及所有检测的相对血红蛋白量的阴性SPF小鸡血清的计算平均值(参见表44至46(8))复制到新表格(参见一个实例表47(8))。
7.6.7从预期阳性血清(7.6.6)的响应减去SPF小鸡血清(7.6.6)的响应(参见一个实例表48(8))。
7.6.8确定每个相对血红蛋白量的每个阳性血清的最高响应并赋予其一个值10(参见一个实例表49(8))。
7.6.9通过利用公式2a(9.2)，对剩余的流动通道计算相对值(参见一个实例表49(8))。
7.6.10计算每个血红蛋白百分比的所有相对值的总和(参见一个实例表49(8))。
7.6.11最佳血红蛋白百分比(用于4个百分比对比)通过在4个流动通道/血红蛋白百分比的最高总和分数而确定。
7.6.12当最佳相对血红蛋白量(7.6.11)是相比较的最高或最低血红蛋白量时，步骤7.2至7.6.11必须利用以下条件重复。
7.6.12.1在对于Sg、Sm和Sg的最低血红蛋白量(20％)是最佳的情况下，除了0％和10％的血红蛋白之外，重复20％和30％的量。
7.6.12.2在对于Se和St的最高相对血红蛋白量是最佳的情况下，除了40％和50％血红蛋白外，重复量20％和30％。
7.6.12.3在对于Sg、Sm和Sl的最高相对血红蛋白量是最佳的情况下，除了60％和70％血红蛋白外，重复百分比40％和50％。
7.6.13达到血红蛋白百分比的一个最佳值 7.6.13.1每4个相比较的相对血红蛋白量，当相对值(7.6.8)的总和具有最高值时。
7.6.13.2在其中最高值被检测的相比较血红蛋白的范围内，更高或更低水平的血红蛋白加入也被确定。
7.7血红蛋白加入的真空干燥的LPS原液的制备 7.7.1在确定最佳血红蛋白量之后，剩余的5mg/ml LPS溶液的体积通过由定性数据纸读取的，利用从初始空管重量减去管重量与LPS溶液(7.1.7)的总和进行计算(参见SOP Chemie/A21(实施例11))。
7.7.2使用公式3(9.3)计算剩余LPS的量。
7.7.3使用公式4(9.4)计算要加入LPS的血红蛋白的量。
7.7.4将计算量的血红蛋白(7.7.1)加入到剩余LPS溶液中以达到终浓度，其在7.6.13中确定。
7.7.5颠倒、涡旋和/或声处理溶液(7.7.4)直至血红蛋白完全溶解。
7.7.6将100μl分配到玻璃管中。
7.7.7在旋转真空干燥器(6.1)中干燥分配的溶液(7.7.6)(加热点1，15min，总运行时间60min)。
7.7.8塞住管并在4-7℃下储存直至进一步使用。
黄金海岸沙门氏菌LPS-血红蛋白复合物固定的CM5芯片的典型基线响应在图43中给出。
8.表 表42在氧化之前，血红蛋白(5.7.3)、乙酸钠缓冲液(5.7.2)和mQ(5.1.3)加入到LPS(7.2.1)。

表43加入LPS的相对血红蛋白起始量
表44结合至固定化沙门氏菌LPS的(稀释)凝集血清的预期结果
图例+＝血清与固定化LPS的阳性结合 -＝没有血清与固定化LPS的结合 +＝要用于最佳血红蛋白添加确定的所选血清 表45结合至固定化沙门氏菌LPS的(稀释)禽鸟参考血清的预期结果
图例+＝血清与固定化LPS的阳性结合 -＝没有血清与固定化LPS的结合 +/-＝要用于最佳血红蛋白添加确定的所选血清 表46结合至固定化沙门氏菌LPS的(稀释)猪参考血清的预期结果
图例+＝血清与固定化LPS的阳性结合 -＝没有血清与固定化LPS的结合 +/-＝要用于最佳血红蛋白添加确定的所选血清 表47在可变的血红蛋白加入情况下在黄金海岸沙门氏菌固定的LPS上的典型血清学响应(两个制备的CM5芯片的数据) 表48从对黄金海岸沙门氏菌固定化LPS(具有可变血红蛋白加入)的所选阳性血清学响应(表47的数据)减去CH-SPF的典型表格(两个制备的CM5芯片的数据)。
表49表48的相对值计分的典型表格(两个制备的CM5芯片的数据) 9.公式 9.1公式1 mQ体积的计算 v＝w/5 v＝mQ(5.1.3)的体积(ml) w＝LPS(7.1.2)的重量(mg)(参见SOP ChemieA21(实施例11)) 9.2公式2 阳性血清相对值的计算 Rv＝Mv/Mhv*10 Rv＝相对值 Mv＝平均值(7.6.1) Mhv＝平均最高值(7.6.8) 9.3公式3 剩余LPS量的计算 z＝w*0.005 z＝剩余LPS的量(mg) w＝剩余LPS溶液(7.7.1)的重量(mg) 9.4公式4 血红蛋白量的计算 h＝y*z*0.01 h＝血红蛋白的质量(mg) y＝最佳血红蛋白百分比(％)(7.6.13) z＝剩余LPS(9.3)的量(mg) 实施例14分离自LPS的多糖(PS)偶联至微球体以测试抗沙门氏菌血清抗体 材料和方法 -LPS的批料如实施例11(“从沙门氏菌属提取脂多糖”)所述获得。
-温和酸水解 原溶液 2％(v/v)乙酸 Milli Q品质水 S.t.、S.e.、S.g.、S.m.、S.1的LPS溶液 S.t.2005.1，没有氧化，没有Hb，5mg/ml S.1.2005.1，没有氧化，没有Hb，5mg/ml S.g.，没有氧化，没有Hb，5mg/ml S.e.2005.1，没有氧化，没有Hb，5mg/ml S.m.15-01-2007S.Bokn/BG，批次8-01-03，5mg/ml 温和水解的程序步骤 1.用吸液管吸取1500μl 5mg/ml LPS溶液到4-ml玻璃管。
2.加入1500μl 2％(v/v)乙酸原溶液。
3.在玻璃管塞中形成小穿孔。
4.在加热块中保持100℃3h。
5.在冰上骤冷。
6.以14,000g离心10min。
7.在分析天平上称重2-ml艾本德(eppendorf)小瓶。
8.将上清液转移到具有已知重量的艾本德小瓶中。
9.在分析天平上确定重量。
10.以14,000g离心10min。
11.将上清液转移到具有已知重量的新艾本德小瓶中。
12.称重具有小球(脂质A)的剩余艾本德小瓶。
13.将每一个小瓶中的脂质A和PS冻干48h(或直至达到干燥)。
14.在冻干之后，再次称重艾本德小瓶并确定脂质A和PS干重。
15.将PS溶解在水中至终浓度5mg/ml。
氧化 根据实施例9(“沙门氏菌来源的LPS固定到荧光珠子上以及报告各种生物样品中目前或过去的沙门氏菌感染的抗体的检测”)中给出的方案氧化PS。
氧化后的多糖与微球体的偶联 氧化后的PS的偶联根据在实施例9(“沙门氏菌来源的LPS固定到荧光珠子上以及报告各种生物样品中目前或过去的沙门氏菌感染的抗体的检测”)中给出的方案进行。
结果 阴性和阳性猪血清用来评价用常见脂多糖(LPS)或分离多肽(PS)涂覆的微球体的活性。





预期结合的阳性血清标有下划线。来自免疫动物的参考血清是如下反应性的 猪1和8沙门氏菌血清组B 猪3和9沙门氏菌血清组C1 猪4和10沙门氏菌血清组C2 猪5和11沙门氏菌血清组D 猪6和12沙门氏菌血清组E 猪7阴性参考 结果以信噪比表示，其中噪声定义为来自阴性血清的平均响应+三倍标准偏差。表中的结果表明利用偶联LPS(相比于偶联的PS)改进的参考血清的特定响应。
实施例15使用DMTMM的LPS的偶联 使用4-(4，6-二甲氧基[1，3，5]三吖嗪-2-基)-4-甲基-吗啉(DMTMM)的LPS的这种可替换偶联的三个程序如下，这些三个程序这里列于以下 程序1(使用COOH-珠子) COOH-DMTMM 1.在2.5mL水中溶解2.5mg各种LPS血清型B、C1、C2、D.或E。
2.将200μL 200mg/mL DMTMM加入水中。
3.在环境温度下在回转振荡器上孵育1h。
4.用5ml PBS平衡Sephadex G-25M PD10柱。
5.将改性的LPS转移到PD10柱。
6.用3.5ml PBS稀释LPS。
7.用吸液管吸取100μL微球体(BioPlex COOH-珠子，1.25x106个珠子/mL)到小瓶(处理以防止静电)中。
8.以13,000g旋转珠子5min。
9.将50μL DMTMM改性的LPS加入到微球体并涡旋混合。
10.在避光且在环境温度下的回转振荡器上孵育过夜。
11.以13,000g离心悬浮液5min。
12.抛弃上清液，加入100μL PBS，重复离心和移出液体。
13.将微球体储存在包含1％(v/v)马血清和0.01％(m/v)Proclin 150的100μL PBS(pH 7.2)中。
程序2(使用含酰肼的珠子) 作为一种替换，使用DMTMM，具有包含酰肼官能团的表面的微球体可以用来使LPS共价偶联至该表面。在这种情况下，原始COOH表面必须使用EDC/NHS和碳酰肼改性。在通过EDC/NHS组合的琥珀酰亚胺轭合之后，碳酰肼偶联至微球体，其然后是用于DMTMM-改性LPS附着的靶标。
1.将2.5mg的各个LPS血清型B、C1、C2、D或E溶解在2.5mL水中。
2.将200μL 200mg/mL DMTMM加入水中。
3.在环境温度下在回转振荡器上孵育1h。
4.利用5mL PBS平衡Sephadex G-25M PD10柱。
5.将修饰的LPS转移至柱子。
6.利用3.5mL PBS洗脱LPS。
7.吸取100μL微球体(BioPlex COOH-beads，1.25x106个珠子/mL)到小瓶(处理以防止静电)中。
8.以13,000g旋转珠子5min。
9.移出上清液并涡旋混合。
10.加入100μL EDC/NHS溶液(Biacore)并孵育20min。
11.以13,000g旋转颗粒5min。
12.移出上清液并涡旋剩下的悬液。
13.加入100μL碳酰肼并涡旋混合。
14.以13,000g旋转珠子5min，移出上清液并涡旋混合剩余的悬液。
15.将50μL DMTMM-改性的LPS加入到活化的微球体并涡旋混合。
16.在避光和环境温度下在回转振荡器上孵育过夜。
17.以13,000g离心悬液5min。
18.抛弃上清液，加入100μL PBS，重复离心并移出液体。
19.将微球体储存在包含1％(v/v)马血清和0.01％(m/v)Proclin 150的100μL PBS(pH 7.2)中。
程序3(使用包含酰肼的珠子和乙醇胺) 为了防止在血清诊断学中涉及在微球体上的未使用的(反应)活性琥珀酰亚胺部位，在碳酰肼孵育之后和加入DMTMM改性的LPS之前加入乙醇胺。
1.将2.5mg的各个LPS血清型B、C1、C2、D或E溶解在2.5mL水中。
2.将200μL 200mg/mL DMTMM加入水中。
3.在环境温度下在回转振荡器上孵育1h。
4.利用5mL PBS平衡Sephadex G-25M PD10柱。
5.将修饰的LPS转移至柱子。
6.利用3.5mL PBS洗脱LPS。
7.吸取100μL微球体(BioPlex COOH-beads，1.25x106个珠子/mL)到小瓶(处理以防止静电)中。
8.以13,000g旋转珠子5min。
9.加入100μL EDC/NHS溶液(Biacore)并孵育20min。
10.以13,000g旋转颗粒5min，移出上清液。
11.涡旋混合剩下的悬液。
12.加入100μL碳酰肼并以13,000g旋转珠子5min。
13.移出上清液并涡旋混合剩余的悬液。
14.加入100μL乙醇胺。
15.在20min孵育之后，以13,000g旋转珠子5min。
16.移出上清液并涡旋。
17.用100μL PBS清洗成小球的珠子并以13,000g旋转珠子5min。
18.移出上清液并涡旋混合。
19.将50μL DMTMM-改性的LPS加入到活化的微球体。
20.孵育过夜。
21.以13,000g离心5min，移出上清液并涡旋混合。
22.加入100μL氰基硼氢化钠。
23.孵育60min。
24.以13,000g离心悬液5min。
25.抛弃上清液，加入100μL PBS，重复离心并移出液体。
26.将微球体储存在包含1％(v/v)马血清和0.01％(m/v)Proclin 150的100μL PBS(pH 7.2)中。
结果 参考血清针对可替换地偶联LPS至羧基(C/珠子)或氨基(A/珠子)微球体的响应概括在图47中。
使用阴性和阳性血清来评价用DMTMM改性LPS(DMTMM/LPS)涂覆的羧基和氨基微球体的活性。用于该目的的参考血清来自免疫化动物并且是反应性的，如下 动物1和8沙门氏菌血清组B 动物3和9沙门氏菌血清组C1 动物4和10沙门氏菌血清组C2 动物5和11沙门氏菌血清组D 动物6和12沙门氏菌血清组E 动物7阴性参考 结果以信噪比表示，其中噪声定义为来自阴性血清的平均响应+三倍标准偏差。DMTMM/LPS-C/珠子的结果表明相比于“缺失”偶联，对于C1和C2改进的特异性响应，其是如在本文所有其他实施例中描述的方法。对于其他血清组的响应是较低质量(minorquality)的。在DMTMM/LPS-A/珠子的情况下，相比于“缺失”偶联，观察到对于C1和C2改进的特异性响应以及对血清组E相当的结果。当在乙醇胺存在下制备DMTMM/LPS-A/珠子时，结果相对于没有加入乙醇胺被改进。然而，DMTMM改性，显著影响(抗原结构)血清组B和D，其被认为是在沙门氏菌血清学中最重要的血清组。这些血清组在所有食物传播沙门氏菌感染时是最重要的，涉及的沙门氏菌血清变型属于这些血清组B和D的最大部分。
从这些结果很明显，根据本发明的方法对于获得包含血清组B和/或D抗原的耐用的和/或灵敏载体特别有用。
实施例16LPS与含氨基微球体的偶联 当考察可替换的微球体(即来自不同供应商)的适宜性时，观察到来自Duke Scientific Corporation的羧基微球体在试验猪血清时很难操作。作为用于含羧酸微球体的替换，可以使用含氨基的颗粒，采用与本文实施例1-14中所描述的几乎相同的化学(方法)，即在蛋白质存在下氧化LPS。
程序步骤 不同之一在于，LPS是8倍多稀释的，如在实施例1-14中所述的。氧化后的蛋白质强化的LPS的终浓度为0.06mg/mL。为此，改性LPS的原液在10mM NaAc(pH 4.0)中稀释。
1.将200μL 7.3×107个微球体转移到抗-静电处理的小瓶(1.5mL；抗静电处理的小瓶)中。
2.以13,000g使微球体成小球5min。
3.移出上清液并留下大约10μL液体。
4.涡旋混合悬液。
5.将200μL 0.06mg/mL LPS加入10mM NaAc(pH＝4.0)中。
6.孵育同时附着至回转振荡器1.5h。
7.以13,000g离心悬液5min。
8.移出上清液并留下大约10μL液体。
9.涡旋混合剩余的粒状物质。
10.将200μL 100mM氰基硼氢化钠加入10mM NaAc(pH 4.0)中。
11.在回转振荡器上孵育混合物1h。
12.以13,000g旋转珠子5min。
13.移出上清液并留下大约10μL。
14.涡旋混合剩余的物质。
15.加入200μL PBS(pH 7.2)。
16.以13,000g离心悬液5min。
17.移出上清液并留下大约10μL液体。
18.涡旋混合成小球的物质。
19.加入并储存在含1％(v/v)马血清和0.01％(m/v)Proclin150的200μL PBS(pH 7.2)中。
20.剧烈涡旋混合并在避光4℃下储存。
在图48中，比较了使用含COOH或含NH2的珠子的特异性血清抗-沙门氏菌抗体的响应。该图表明了在猪血清情况下，NH2-珠子的性能优于COOH-珠子。在该图中，鉴定的关键是 动物1和8沙门氏菌血清组B免疫化猪； 动物3和9沙门氏菌血清组C1免疫化猪； 动物4和10沙门氏菌血清组C2免疫化猪； 动物5和11沙门氏菌血清组D免疫化猪； 动物6和12沙门氏菌血清组E免疫化猪； 相同种类的珠子(即偶联至含氨基微球体的LPS)相对于小鸡血清也提供良好的结果(未示出)。



图1根据本发明的方法的一个实施方式的示意图。
图2使用细菌噬菌体作为指示有机体的用于检测细菌的BIA的示意概括。指示有机体可以培养过夜或更短。
图3利用凝集血清分离自鼠伤寒沙门氏菌(批次St2003.2)的Hb-强化的、氧化的LPS的反应性，以相对任意生物传感器响应(RU)。在氧化过程中LPS的Hb强化水平在图中示出。凝集血清的预期结合列于表3中。
图4来自实施例2实验1的ROC曲线。TPF真阳性部分；FPF假阳性部分。
图5来自实施例2实验2的ROC曲线。TPF真阳性部分；FPF假阳性部分。
图6用来自肠炎沙门氏菌(反映血清组D)、黄金海岸沙门氏菌(反映血清组C2)、利文斯通沙门氏菌(反映血清组C1)、火鸡沙门氏菌(反映血清组E)和鼠伤寒沙门氏菌(反映血清组B)的LPS涂覆的制备珠子的分析。LPS涂覆和特异性的成功利用商购的针对O4(血清组B)、O5(血清组B)、O7(血清组C1)、O8(血清组C2)和O9(血清组D)的单克隆抗血清进行测试。响应作为在Y轴的中间荧光指数(MFI)以任意单位表示，而X-轴表示单个珠子LPS轭合的类型。
图7制备的用反映血清组B、C1、C2和D的LPS涂覆的珠子的分析。涂层的活性利用针对O4(血清组B)、O5(血清组B)、O7(血清组C1)、O8(血清组C2)和O9(血清组D)的单克隆抗血清进行测试。类似于图6，只是在更低响应上放大。注意到抗-O5的响应处于破坏。细节参见图6的图例。
图8用来自肠炎沙门氏菌(反映血清组D)和黄金海岸沙门氏菌(反映血清组C2)、利文斯通沙门氏菌(反映血清组C1)和鼠伤寒沙门氏菌(反映血清组B)的氧化LPS的两个不同氧化批次涂覆的珠子的分析。涂层利用商购的对O5(血清组B)、O7(血清组C1)、O8(血清组C2)和O9(血清组D)的单克隆抗血清进行测试。
图9来自小鸡的肉滴和血清的分析。商购的抗血清用来增强肉滴和血清。收集自小鸡的肉组织的小滴(Drip)、液体提取物利用标准ISO方法作为无沙门氏菌进行测试；Drip+CH-SPF，利用收集自无特定病原体(SPF)小鸡的血清增强的小滴；CH-SPF，获自无特定病原体(SPF)小鸡的血清；DripSPA-PG，用与鸡白痢沙门氏菌和鸡沙氏杆菌反应的抗血清增强的小滴；SPA-PG，抗鸡白痢沙门氏菌和抗鸡沙氏杆菌抗血清；DripCHSi，用对于婴儿沙门氏菌感染是血清学阳性的小鸡血清增强的小滴；CH-Si，对婴儿沙门氏菌血清学阳性的小鸡血清。X-轴表示单个珠子的LPS轭合的类型。对于细节参见图6、7和8。
图10用商购的抗鼠伤寒沙门氏菌(黄色棒)和抗利文斯通沙门氏菌(蓝绿色棒)增强的猪血清的分析。另外，缓冲液(蓝色棒)和阴性猪血清(紫色棒)中的珠子在用代表血清组B、C1、C2和D的LPS涂覆的珠子上进行分析。
图11在Biacore SPR生物传感器上，细菌噬菌体FO1与来自鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌和利文斯通沙门氏菌的固定化LPS的结合。PFU，斑形成单位。
图12细菌噬菌体FO1与涂覆有鼠伤寒沙门氏菌LPS的SPR生物传感器芯片的结合，随后用1.2x109PFU细菌噬菌体FO1孵育鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌、利文斯通沙门氏菌。虚线表示截止值。
图13在沙门氏菌属-特异性细菌噬菌体FO1存在下，孵育不同食物病原体和酸败细菌。在生长期间，监测作为细菌生长量度的在λ600nm处的光学密度。b1+FO1，缺乏细菌的空白介质，仅补充了细菌噬菌体。
图14在沙门氏菌属-特异性细菌噬菌体FO1存在下，孵育不同沙门氏菌血清变型。细节参见图13的图列。
图15在沙门氏菌属-特异性细菌噬菌体FO1存在下，孵育不同食物病原体和酸败细菌。斑形成单位(PFU)的数量在孵育5h后确定。b1+FO1，缺乏细菌的空白介质，仅补充了细菌噬菌体。
图16在沙门氏菌属-特异性细菌噬菌体FO1存在下，孵育不同沙门氏菌血清变型。细节参见图13的图列。FO1原液没有进行孵育。
图17在浓缩和渗析病毒之后，在不同沙门氏菌血清变型中增殖的细菌噬菌体FO1的SPR生物传感器分析。悬液系列稀释和分析；浓缩/稀释的细菌噬菌体的终浓度在X-轴上表示。
图18糖类部分的氧化。R’和R分别表示糖类链中的远端和近端位置。
图19与含多胺的分子(R”)如蛋白质的轭合。
图20固定至荧光珠子以及化学键的稳定化。
图21偶联至珠子的LPS的程序以及血清分析的示意图。
图22a弯曲杆菌-感染性细菌噬菌体的实例。
图22b利斯特菌(Listeria)-感染性细菌噬菌体的实例。
图22c沙门氏菌-感染性细菌噬菌体的实例。
图23计数室和技术。
图241mm2的Bürker-Türk计数室(A)的总面积，其中B表示该总面积1/16的面积。
图25高碘酸盐浓度对肠炎沙门氏菌的LPS固定到SPR生物传感器芯片上的影响。
图26高碘酸盐浓度对肠炎沙门氏菌(批次Se2002.1)的固定化LPS的抗原活性的影响。LPS被固定至生物传感器芯片上并在SPR生物传感器中进行分析(图25)。测试的范围为0.2mM至1.8mM高碘酸钠。O9、O12、O polyA-S、S.typh、SE是分别来自抗-O9抗血清、抗-O12抗血清、针对血清组A至S的多克隆抗体、对于鼠伤寒沙门氏菌阳性的小鸡血清和对于肠炎沙门氏菌阳性的小鸡血清的生物传感器响应。
图27高碘酸盐浓度对肠炎沙门氏菌(批次Se2002.1)的固定化LPS的抗原活性的影响。测试的范围为1.8mM至48.6mM高碘酸钠。细节参见图26。
图28高碘酸盐浓度对在SPR生物传感器芯片上的黄金海岸沙门氏菌LPS的固定化的影响。
图29高碘酸盐浓度对黄金海岸沙门氏菌(批次Sg2002.1)的固定化LPS的抗原活性的影响。LPS被固定至生物传感器芯片上并且在SPR生物传感器中进行分析(图28)。测试的范围为0.2mM至5.4mM高碘酸钠。O6，7、O8、O polyA-S、利文斯通沙门氏菌、婴儿沙门氏菌分别是抗-O6/7抗血清、抗-O8抗血清、针对血清组A至S的多克隆抗体、对于利文斯通沙门氏菌阳性的猪血清和对于婴儿沙门氏菌阳性的小鸡血清的生物传感器响应。
图30高碘酸盐浓度对在SPR生物传感器芯片上的利文斯通沙门氏菌LPS的固定化的影响。
图31高碘酸盐浓度对黄金海岸沙门氏菌(批次Sg2002.1)的固定化LPS的抗原活性的影响。LPS被固定至生物传感器芯片上并且在SPR生物传感器中进行分析(图30)。测试的范围为0.2mM至5.4mM高碘酸钠。O6，7、O8、O polyA-S、利文斯通沙门氏菌、婴儿沙门氏菌分别是抗-O6/7抗血清、抗-O8抗血清、针对血清组A至S的多克隆抗体、对于利文斯通沙门氏菌阳性的猪血清和对于婴儿沙门氏菌阳性的小鸡血清的生物传感器响应。
图32程序步骤的示意图。
图33用于LPS提取工艺的定性纸(quality sheet)。
图34LPS固定至生物传感器表面和化学键的稳定化。
图35在COM 1上的Biacore 3000控制软件。
图36固定化向导(immobilization wizard)。
图37固定化试验向导。
图38存入(logging)。
图39氧化LPS的固定化的典型感应谱。报告点1基线；2活化EDC/NHS；3碳酰肼；4乙醇胺；5固定化LPS Se。
图40在含LPS的CM5芯片上分析的抗沙门氏菌O PolyA-S的感应谱。
图41在黄金海岸沙门氏菌LPS-血红蛋白固定化CM5生物传感器芯片上，凝集血清和组特异性沙门氏菌抗血清的典型血清学响应。
图42禽鸟参考血清(SPF-CH、EIA St、EIA Se、SPA-PG和CH-Si血清)以及猪参考血清(SW-血清)在黄金海岸沙门氏菌LPS-血红蛋白固定化CM5生物传感器芯片上的典型血清学响应。
图43黄金海岸沙门氏菌LPS-血红蛋白固定化CM5生物传感器芯片的典型基线响应。
图44来源于其中小鸡实验地用肠炎沙门氏菌感染的实验的肉滴的ImmuSpeedTM分析。阴性样品来自没有感染的对照小鸡。肉滴样品在Tris 100mM、pH 7中按1∶100(v/v)稀释。第二抗体是驴-抗-小鸡，在含1％(v/v)FCS的Tris 100mM pH 7中按1∶150(v/v)稀释。
图45沙门氏菌阴性SPF小鸡血清(黄线)和对于鸡白痢沙门氏菌-鸡沙氏杆菌阳性的小鸡血清的重复性OctetTM分析。显示了第一分析周期的试剂(秒)。分析中的步骤是1)接触PBS pH 7(基线)；2)取样血清；3)再生。一个周期利用PBS pH7再次开始。
图46抗O5MAB在三个生物传感器上的OctetTM分析(绿、红和紫曲线)，其中三个生物传感器都用血清组B抗原涂覆。阴性小鸡血清在两个其他生物传感器表面上进行测试(黄色和浅紫色曲线)，而一个生物传感器根本没有用LPS涂覆(蓝线)，并且一个传感器没有与液体接触。在600s时，生物传感器浸入样品中并在180s之后置换。
图47偶联至羧基珠子(紫色棒；每一组中的第一个)、偶联至氨基珠子(葡萄酒红棒；每一组中的第二个)、偶联至用乙醇胺处理的氨基珠子(黄色棒；每一组中第三个)以及使用本文描述的偶联化学偶联至羧基珠子(“缺失”，蓝绿色棒；每一组中的最后一个柱)的DMTMM改性的LPS。
Norm MFI/DL＝标准化平均荧光强度/决定限(decision limit)。
图48来自用特定沙门氏菌血清变型免疫化的猪的血清的信噪(S/N)比。COOH-珠子的S/N比在蓝色棒(每一组中左边的棒)示出，而NH2-珠子的S/N比用葡萄酒红棒(每一组中右边的棒)示出。
Norm MFI/DL＝标准化平均荧光强度/决定限(decision limit)。
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权利要求
1.一种用于将多糖固定到载体上的方法，包括使所述多糖与氧化剂和包含至少两个胺和/或酰胺基团的聚合物接触以获得多糖-聚合物复合物，以及使所述多糖-聚合物复合物偶联至所述载体。
2.根据权利要求1所述的方法，所述聚合物是蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述多糖来源于革兰氏阴性细菌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述多糖来源于肠细菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述多糖来源于沙门氏菌(亚)种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述多糖是脂多糖。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是血红蛋白或肌红蛋白。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述氧化剂是偏高碘酸(钠)盐。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，进一步包括活化所述载体的表面。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述载体包含用金涂覆的玻璃表面。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述载体利用包含羧基供体的涂层，优选地羧甲基化的葡聚糖层进行改性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述羧基供体和/或葡聚糖层利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和碳酰肼加以活化。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，包括至少两种不同的多糖。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述载体是生物传感器芯片。
15.一种通过根据权利要求1-14中任一项所述的方法获得的载体。
16.一种载体，在其表面上包含固定化多糖-蛋白质复合物。
17.根据权利要求16所述的载体，包括包含羧基供体，优选地羧甲基化葡聚糖的涂层，连接至包含抗原的多糖，其中所述羧基供体和所述多糖经由包含至少两个胺和/或酰胺基团的聚合物彼此连接，其中至少所述多糖经由所述多糖上的高碘酸盐氧化的邻二醇和所述聚合物上的胺和/或酰胺基团连接至所述聚合物。
18.根据权利要求17所述的载体，其是微球体或珠子。
19.根据权利要求18所述的载体，其中，所述微球体或珠子是聚苯乙烯微球体或珠子。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的载体，其被编码。
21.根据权利要求20所述的载体，其中，所述载体是通过存在某些标记物而被编码。
22.根据权利要求21所述的载体，其中，所述标记包括颜色。
23.根据权利要求22所述的载体，其中，所述颜色是荧光或磷光颜色。
24.一种微球体或珠子的集合，包括至少两种根据权利要求20-23中任一项所述的不同编码的微球体或珠子。
25.根据权利要求24所述的微球体或珠子的集合，其中，所述不同编码的微球体或珠子中的每一个包括包含不同抗原的多糖。
26.一种生物传感器，包括根据权利要求15或23所述的载体。
27.一种表面等离子体谐振检测系统，包括根据权利要求26所述的生物传感器。
28.一种用于确定样品中存在针对革兰氏阴性细菌的抗原的抗体的方法，包括使所述样品与根据权利要求15或23中任一项所述的载体或者根据权利要求26所述的生物传感器接触，以及
确定所述载体是否已结合任何抗体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述样品是血液、血液来源的液体材料、组织来源的流体，如肉滴、乳汁、蛋、来自眼的流体、唾液或粪便。
30.一种用于确定样品中存在革兰氏阴性细菌的方法，包括使所述样品与预定量的针对所述细菌的抗原的抗体接触，以及利用根据权利要求15或23所述的载体或者根据权利要求26所述的生物传感器确定没有结合至所述细菌的抗体的量。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中，与所述载体或所述生物传感器的结合通过表面等离子体谐振加以确定。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中，所述样品获自人类或动物。
33.一种用于确定样品中存在革兰氏阴性细菌的方法，包括
使所述样品与靶细菌特异性的细菌噬菌体接触并允许所述细菌噬菌体感染所述样品；
移出未结合和/或非侵入性细菌噬菌体，导致细菌噬菌体感染的样品；
使所述细菌噬菌体感染的样品与对所使用细菌噬菌体敏感的指示有机体接触；
在至少一个细菌噬菌体倍增周期期间进行孵育；
回收所述细菌噬菌体以获得含细菌噬菌体的样品；
利用根据权利要求15或23所述的载体或者根据权利要求26所述的生物传感器分析所述含细菌噬菌体的样品。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述样品获自人类、植物或动物。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述细菌噬菌体包含图22a、22b和/或22c的细菌噬菌体。
36.一种根据权利要求15-23中任一项所述的载体，包含图22a、22b和/或22c的细菌噬菌体。
全文摘要
本发明涉及化学和诊断领域，更具体地涉及当前和/或过去和/或无症状感染的诊断或者暴露于格兰氏阴性细菌(如肠细菌或军团杆菌)的历史的诊断。甚至更具体地，本发明涉及对于存在不希望/不期望微生物的动物或动物产品的筛选。本发明进一步涉及一种对于筛选存在针对存在不希望/不期望微生物的抗体的样品的方法，并且优选这样的方法在生物传感器的帮助下实施。本发明还涉及一种将多糖固定至固体表面的方法。此外，本发明提供具有固定的多糖的固体表面以及这样的表面的应用。
文档编号G01N33/53GK101568836SQ200780047950
公开日2009年10月28日 申请日期2007年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者阿尔德特·安东尼·贝格韦夫, 埃伦·范伊尔德恩, 彼得乌斯·约翰内斯·纳肯, 贝尔塔·杰拉尔达·玛丽亚·格特马克, 罗纳尔杜斯·贝尔纳杜斯·赫哈德斯·沃尔贝特 申请人:Rna控股有限公司