家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其构建方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其构建方法和应用。获得丝胶蛋白1基因启动子、His 6序列、DDDDK序列、丝素轻链蛋白信号肽、丝素轻链蛋白基因3’末端序列、家蚕肌动蛋白基因A3启动子、EGFP基因和SV40序列，然后再构建质粒，第一表达框包括A3启动子、EGFP基因和SV40序列，第二表达框包括丝胶蛋白1基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、His 6序列、DDDDK和丝素轻链蛋白基因3’末端序列，且含有ApaI和NheI两个酶切位点。本发明质粒减少了构建donor质粒的工作量，提高了家蚕中部生物反应器工作效率。
【专利说明】
家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其构建方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及了一种质粒及其构建方法与应用，尤其是涉及了一种家蚕中部丝腺生 物反应器通用型质粒及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] piggyBac转座子最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368细胞株的基因组中 分离得到的，是目前发现的转座活性最高的DNA转座子。piggyBac转座系统是一种非病毒载 体，转座效率较高。与sleeping beauty相比，piggyBac载体容量较大，可携带18kb,可以实 现多基因的共表达，且转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以 实现切除后精确修复，在可逆转基因的应用中具有重要作用。
[0003] piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器的研究开展了十几年，世界各 国的科学家致力于外源基因的表达，已经建成了以丝素蛋白轻链启动子（Fib-L Promoter)、丝素蛋白重链启动子(Fib-H Promoter)和丝胶蛋白1启动子(SerlPromoter)表 达外源蛋白的转基因家蚕丝腺生物反应器。
[0004] 由于piggyBac载体多数含有两个表达框，具有较多的元件和相同的酶切位点，所 以，每次表达不同的外源基因时，需要从头构建质粒，组装启动子、信号肽、外源基因 、polyA 等结构，费时费力，工作效率低下。
【发明内容】
[0005] 为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种家蚕中部丝腺生 物反应器通用型质粒及其构建方法和应用，具体是利用常规构建质粒的生物技术方法构建 一种不含目的基因，但拥有其它所有必需元件的通用型质粒。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
[0007] -、一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒：
[0008] 所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[Serlpromoter-FLSP-His 6-DDDDK-FL PA]， 是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和 PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。
[0009] -个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3 Promoter-EGFP-SV40,另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号 肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3'末端的表达框，即 SeriPromoter-Fibroin L chain signal peptide-His 6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA〇
[0010] 所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的Apal和Nhel的两个酶切位点，两个酶切位点 用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。
[0011] 二、一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒的构建方法，方法的步骤如下：
[0012] 1)通过分子生物学方法构建包含[丝胶蛋白1基因启动子575-海肾萤光素酶基因- SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子4023-萤火虫萤光素酶基因 -SV40]-[A3基因启动子-绿色荧 光蛋白基因 _SV40]([Ser 575-Rluc-SV40]-[Ser 4023-Fluc-SV40]-[A3-GFP-SV40])的质 粒piggy-14413,以质粒piggy-14413为模板，质粒piggy-14413的碱基序列如SEQ ID NO. 1， 以如 SEQ ID NO · 2的 ggtaccGTTGGCGGTCTTTGGATCG 序列 1 和如SEQ ID N0.3 的 gaattccttaagGCACACACACTACATACCATGTATTTG序列2为引物，采用PCR扩增获得片段长为 583bp的丝胶蛋白1基因启动子，其碱基序列如SEQ ID N0.4;
[0013] 2)用EcoRI和ΚρηΙ双酶切包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组 氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列(FL692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和 Amp抗性基因的质粒piggy-4086,质粒piggy-4086其碱基序列如SEQ ID N0.5,得到长度为 3378bp的包含丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链 3 ' 序列(FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的片段；
[0014] 3)连接步骤1)获得的丝胶蛋白1基因启动子与步骤2)获得的包含丝素轻链蛋白信 号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列的片段，得到包含丝胶 蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白 轻链3'序列（Seri promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的质粒piggy-3969;
[0015] 4)用Aflll和Bglll双酶切步骤3)获得的质粒piggy-3969,获得长度为1322bp的包 含丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝 素蛋白轻链3 '序列（Ser-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的片段；
[0016] 5)用Aflll和Bglll双酶切包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP- SV40)和Amp抗性基因的质粒piggy-6212,质粒piggy-6212的碱基序列如SEQ ID NO.6,得到 长度为5870bp的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)的片段；
[0017] 6)连接步骤4)获得的包含丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨 酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列的片段与步骤5)获得的包含A3基因启 动子-绿色荧光蛋白基因 -SV40的片段，得到包含[A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因_ SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3 ' 序列（[A3-EGFP-SV40]-[Serl promoter-FLSP-His-DDDDK-FLPA])的 质粒piggy-7192作为本发明所述的质粒，即为家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其碱 基序列如SEQ ID N0.7。
[0018]三、所述质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒的应用。
[0019] 本发明先设计引物，用PCR的方法获得获得丝胶蛋白1基因启动子的序列;再分别 用限制性内切酶酶切相应的片段，电泳得到目的条带后，切胶回收，用T4连接酶将相应的片 段相连，使所需的元件（SerlPromoter-Fibroin L chain signal peptide-His6_DDDDK-Fibroin L chain PolyA)依次连接;接着将piggy-6212质粒中的标记基因与上述元件整合 到同一个质粒，得到通用型质粒，最终如图1所示。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] 本发明的质粒可对于任意一种外源基因，只需经一步酶切连接反应，就将任何一 种外源基因导入质粒，完成表达外源基因质粒的构建。
【附图说明】
[0022]图1是本发明Seri通用型质粒的组成示意图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0024]本发明的实施例如下：
[0025] (1)设计引物，以piggy-14413质粒（SEQ ID NO. 1)为模板，获得丝胶基因启动子 (SEQ ID N0.4)。并在启动子5 '端加 EcoRI的酶切位点，在3 '端加 ΚρηΙ的酶切位点。用EcoRI 和ΚρηΙ双酶切PCR产物，得到593bp的片段，即启动子，胶回收；用EcoRI和ΚρηΙ双酶切piggy-4086质粒（SEQ ID NO.5)，得到3378bp的片段，胶回收;连接两目的片段，得到piggy-3969质 粒。
[0026] (2)用Aflll和BglII、Sca頂每切piggy-3969质粒，得到长度为1322bp的片段；用 ΑΠΙΙ和Bglll双酶切piggy-6212质粒（SEQ ID N0.6)，得到长度为5870bp的片段，连接上述 两目的片段，得到Piggy-7192质粒(SEQ ID N0.7)，即为家蚕中部丝腺生物反应器通用型质 粒。
[0027] (3)用Apal和Nhel双酶切piggy-7192质粒，得到长度为7190bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[Serl promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA和Amp抗性基因的基因序列。将上游端带 有Apal酶切粘性末端序列、下游端带有Nhel酶切粘性末端序列的T4连接酶基因与上述片段 连接，构建成家蚕中部丝腺生物反应器表达T4连接酶基因的质粒piggy-8716,该质粒包含 的表达框序列为[A3-EGFP-SV40 ] -[ Ser 1 promoter-FLSP-His 6-DDDDK-T4Ligase-FLPA] 〇 [0028] 上述结果说明，利用家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒piggy-7912， 仅仅一步就能够得到在家蚕中部丝腺表达T4连接酶基因的质粒。
[0029]说明利用本发明的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒构建转基因家蚕的donor 质粒，操作程序简单，工作效率高。
【主权项】
1. 一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于：所述的质粒为pBaC[A3-EGFP-SV40]-[Serlpromoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带 有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和I 3BR以及两个转座臂之间的两个 功能表达框。2. 根据权利要求1所述的一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于:一个 功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Pr 〇m〇ter-EGFP-SV40,另一 个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、 肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3'末端的表达框，即Serl Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His 6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA03. 根据权利要求1所述的一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于:所述 的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点，两个酶切位点用于将质粒特 异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。4. 一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒的构建方法，其特征在于方法的步骤如 下： 1) 通过分子生物学方法构建包含[丝胶蛋白1基因启动子575-海肾萤光素酶基因_ SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子4023-萤火虫萤光素酶基因-SV40]-[A3基因启动子-绿色荧 光蛋白基因-SV40]的质粒piggy-14413,以质粒piggy-14413为模板，以如SEQ ID NO. 2的 ggtaccGTTGGCGGTCTTTGGATCG序列 1 和如 SEQ ID N0.3 的 gaattccttaagGCACACACACTACATACCATGTATTTG 序列 2为引物，获得片段长为583bp 的丝胶蛋 白1基因启动子，其碱基序列如SEQ ID NO.4; 2) 用EcoR I和Kpn I双酶切包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨 酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列（FL692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和 Amp抗性基因的质粒piggy-4086,质粒piggy-4086其碱基序列如SEQ ID NO. 5,得到长度为 3378bp的包含丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链 3'序列的片段； 3) 连接步骤1)获得的丝胶蛋白1基因启动子与步骤2)获得的包含丝素轻链蛋白信号 肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3 '序列的片段，得到包含丝胶蛋 白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻 链3 '序列和Amp抗性基因的质粒piggy-3969; 4) 用Af III和BglII双酶切步骤3)获得的质粒piggy-3969,获得长度为1322bp的包含丝 胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋 白轻链3'序列（Seri promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的片段； 5) 用Af III和Bgl II双酶切包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40 (A3-GFP-SV40) 和Amp抗性基因的质粒piggy-6212,质粒piggy-6212的碱基序列如SEQ ID NO.6,得到长度 为5870bp的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的片段； 6) 连接步骤4)获得的包含丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列的片段与步骤5)获得的包含A3基因启动 子-绿色荧光蛋白基因-SV40的片段，得到包含[A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝 素蛋白轻链3'序列的质粒piggy-7192其碱基序列如SEQ ID NO.7。5.-种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒的应用，其特征在于:权利要求1~3所述 的质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒。
【文档编号】C12N15/85GK105950653SQ201610287168
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】钟伯雄, 张玉玉, 叶露鹏
【申请人】浙江大学