一种双诱导同源重组无标记载体质粒及其应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，提供一种双诱导同源重组无标记载体质粒及其应用，所述的质粒序列如SEQ ID NO.1所示。应用点特异重组的逆反应系统，可将质粒定位地插入目标基因组，并通过温度诱导同源重组酶的表达，使得原有质粒载体中用于转化子筛选的抗生素基因切除，由此构建植物特异性状基因的表达载体和一类小amiRNA的载体，避免转基因植物携带对人类不利的抗生素基因对生态环境的可能污染。
【专利说明】
一种双诱导同源重组无标记载体质粒及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种双诱导同源重组无标记载体质粒及其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]生物技术等高新科技在农业生产上的应用，将使整个农业发生革命性的变化.在作物育种中，用重组基因技术将外源有益基因导入作物中，和通过反义RNA技术或amiRNA技术，定向修饰植物某个(些)目标性状并保留其它原有性状，这是常规杂交育种所无法实现的理想.国内外用原生质体融合、微注射、电穿孔法、激光和基因枪等手段将抗病、抗虫或高蛋白质基因、花色基因导入植物中并得到表达，如成熟时不软化的番茄、高蛋白低淀粉含量的马铃薯、蓝色玫瑰、抗花叶病毒病的番茄或烟草等等，现在已有一百多种转基因作物处于中小规模，甚至大规模的田间实验。美国国会也正式批准在农业上使用转基因作物。我国中国科学院和北京大学等单位都有转基因的抗病烟草在生产上应用，并已推广，在国际上处于领先地位。同时随着别的作物转基因技术的成熟，转基因植物的风险性成为公众的焦点话题，其中风险之一就是外源基因的污染，为避免对外源基因的污染，降低基因遗传转化的风险性。其中一种外源基因的污染是来自遗传转化系统的标记基因。多年来科学家正在寻求各种能将这种由于标记基因造成的污染减少到最低的技术方法。上个世纪90年代国际上就有实验室开始这项工作，已有他人文献报道了一些采用位点特异性重组系统和热激启动子的可删除标记基因的质粒载体，主要是使用Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体，现有的Cre/loxP位点特异性重组系统去除转基因植物中标记基因的方法中因Cre/1xP位点特异性重组系统具有可逆性，导致其删除效率降低的问题，和FLP/frt位点特异性重组系统，利用重组酶FLP植物表达载体二次转化含有frt位点的抗选择标记烟草植株时，17%的共转化植株发生了选择标记基因切除事件;利用含有frt位点的植物表达载体与重组酶FLP植物表达载体共转化烟草时，二者感染烟草叶盘浓度比为3:1时共转化效率最高，为21%，共转化植株选择标记基因的切除效率为5% ;而利用含有frt位点的植物表达载体二次转化含有重组酶FLP基因的转基因烟草植株时，转化效率只有1.6%，且未见到选择标记基因被切除。它们均未采用双诱导启动子来控制重组酶的表达效率，并且未对该载体转化的植株在不同植物(拟南芥、水稻、白菜)、不同发育时期、不同诱导温度下的标记基因切除效率进行系统性研究；另有他人文献报道了一些采用位点特异性重组系统、低温诱导启动子、P i ggyBac转座酶、Gateway克隆系统构建的可删除标记基因的质粒载体，但是它们并未同时采用位点特异性双诱导重组系统和热激启动子构建载体。我们质粒系统利用双诱导型启动子诱导Cre重组酶基因在植物发育的特定时期高效表达可防止Cre重组酶基因在转基因植物中组成型表达带来的基因组不稳定等问题。相对于其它诱导型启动子，热诱导启动子具有诱导简便、反应灵敏、作用高效、对植物生长发育危害小等优点。目标基因是采用了 es trad i ο I诱导型启动子，可以完全控制表达时期和表达量。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于双诱导同源重组无标记载体质粒及其应用，应用点特异重组的逆反应系统，可将质粒定位地插入目标基因组，并通过温度诱导同源重组酶的表达，使得原有质粒载体中用于转化子筛选的抗生素基因切除，由此构建植物特异性状基因的RNAi的载体，避免转基因植物携带对人类不利的抗生素基因对生态环境的可能污染。因此，本项目通过构建RNAi生态环保型质粒，并将探索性地应用于作物生态环保型分子育种。开辟国内生态环保型分子育种的新理念，具有很大的社会和生态效益。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
双诱导同源重组无标记载体质粒，所述的质粒序列如SEQ ID N0.1所示。
[0005]本项目的具体技术要点及其解决的问题:
(1)利用酵母基因组的部分同源重组序列Cre基因构建表达抗除草剂标记基因的元件；
(2)以热激蛋白基因的启动子为酵母Cre重组酶基因的启动子，在38-45度温度下诱导表达重组酶；
(3)将以上(I)和(2)元件与RNAi载体组装在一起构建生态环保型质粒； ID-Hsp-Cre-RNA1-NptLox 质粒:
LB P35S-bar-T35S-Tocs-cre-HSP-P35S-NptI1-T35S-T35S-amiRNA-T35S-1Dpromoter
RB
所述质粒已经在水稻、拟南芥和白菜中应用。热激蛋白启动子的诱导的最适温度在水稻中为45度，标记基因的切除率80%;拟南芥中为42度，标记基因切除率90%;白菜中为38度。标记基因切除率70%。
[0006]具体步骤为:
(I)克隆了2kb的番前、水稻、白菜和拟南芥热激蛋白hsp70 (heat shock protein70)5’端上游调控序列，通过对启动子元件分析，设计了四种植物不同长度含不同元件的调控序列片段，分别将其与⑶S (β-glucuronidase)报告基因连接，并与CaMV35启动子驱动的草丁膦抗性基因bar的选择标记基因模块一同构建成hsp70启动子功能探测载体。四个载体将用于番茄、水稻、白菜和拟南芥热激蛋白hsp70启动子热激诱导活性的功能验证。
[0007](2)将四个hsp70 5’端上游调控序列片段分别与重组酶基因Cre基因相连，并与SV40启动子-bar基因模块串联，分别插入到两个反向的1xP位点和两个反向的1xp-FRT融合识别位点之间，构建了八个基于Cre/loxP系统的可诱导删除选择标记基因的表达载体。八个载体将用于对番茄、水稻、白菜和拟南芥热激蛋白热激诱导删除bar基因的功能验证，并比较单一使用1xP位点与联合使用loxp-FRT融合识别位点的删除效率的差别。建立番茄、水稻、白菜和拟南芥选择标记剔除表达载体是实现转基因安全应用的重要突破，上述工作可提供基本元件和多样化的载体，为相关研究工作奠定了一定基础。
[0008](3)根据已经测序的基因组序列设计特异基因引物，利用常规PCR的方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)和白菜中克隆出一类对激酶活性调控的目标基因的RNAi片段，克隆测序后组装在Estrad1l诱导的启动子下，并在目标基因的3末端增加一个标签(HA)，构建表达元件中间载体。在植物双价表达载体T一DNA区段，35s:Npt Π:nos表达元件位于同向排列的Lox位点之间，然后通过构建一系列中间载体，再将HSP70: Cre: nos这一表达元件插入到Lox位点之间，目的基因将来可以插入到T一DNA区域两个同向排列的Lox位点之外，从而实现在植物遗传转化初期利用抗性筛选标记获得转基因植株，在得到转基因植株的基础上，通过温度诱导调控Cre基因的表达从而删除选择标记，获得含有目的基因而无选择标记的嵌合体。这将是一种对当前植物转基因技术更为安全有效的无标记系统。
[0009](4)载体构建成功后，使用一系列载体进行了拟南芥和白菜的转基因，对其转化条件和温度诱导条件一一植株预处理的时间、菌液侵染时间、温度诱导的时间，两种诱导型启动子及不同温度条件和不同Estrad1l浓度和时间处理下外植体的表现进行了实验，PCR检测表明，我们得到了高效率转化，高切除率的阳性转基因苗。不同植物不同温度诱导，热激蛋白启动子的诱导的最适温度在水稻中为45度，标记基因的切除率80%;拟南芥中为42度，标记基因切除率90%;白菜中为38度。标记基因切除率70%。
[0010]本发明的优点在于:
1、载体具有20%高转化效率，标记基因70%_90%高切除率。
[0011]2、HSP启动子温度诱导重组酶的表达，和Estrad1l诱导目标基因表达。
[0012]3、不同植物不同温度诱导，热激蛋白启动子的诱导的最适温度在水稻中为45度，标记基因的切除率80%;拟南芥中为42度，标记基因切除率90%;白菜中为38度。标记基因切除率70%。
【附图说明】
[0013]图1成功应用生态环保质粒系统转化激酶SRlRNAi片段获得的突变体表型。生态环保型质粒构建的SRl RNAi载体，应用农杆菌真空浸染法侵染拟南芥未开放的花，TO代播种后10天幼苗经0.1%除草剂筛选，获得的阳性植株，长至两片真叶时，42度温度处理4小时，恢复正常生长条件，继续培养到4周，提取植株基因组DNA进行PCR筛选，统计切除除草剂基因的植株，即为无标记的阳性转基因植株，收取种子。这些植株Tl播种，幼苗生长到特定时间(图中呈现是生长到3周龄)进行20mM的Estrad1l诱导处理2小时后，继续培养再进行表型观察，并同时设野生型对照组，如图。
[0014]图2成功应用生态环保质粒系统转化份RNAi片段的白菜植株。其中A为萌发10天的“油青九号”白菜幼苗，下胚轴长5厘米;B为切下Icm的下胚轴经带有构建好表达载体的农杆菌侵染;C筛选、诱导愈伤组织分化;D 0.1%除草剂加入培养基中进行筛选，获得阳性转化子，不同配比的激素浓度诱导根和芽组织分化;E 38度温度处理4小时后继续培养；F提取组织基因组DNA进行PCR验证是否已经切除除草剂基因；G扩增无标记的转基因阳性植株;H无标记的转基因阳性植株。
[0015]图3双诱导同源重组无标记载体RNAi质粒图谱。
[0016]【具体实施方式】实施例1
(I)克隆了2kb的番前、水稻、白菜和拟南芥热激蛋白hsp70 (heat shock protein70)5’端上游调控序列，通过对启动子元件分析，设计了四种植物不同长度含不同元件的调控序列片段，分别将其与⑶S (β-glucuronidase)报告基因连接，并与CaMV35启动子驱动的草丁膦抗性基因bar的选择标记基因模块一同构建成hsp70启动子功能探测载体。四个载体将用于番茄、水稻、白菜和拟南芥热激蛋白hsp70启动子热激诱导活性的功能验证。
[0017](2)将四个hsp705’端上游调控序列片段分别与重组酶基因Cre基因相连，并与SV40启动子-bar基因模块串联，分别插入到两个反向的1xP位点和两个反向的1xp-FRT融合识别位点之间，构建了八个基于Cre/loxP系统的可诱导删除选择标记基因的表达载体。八个载体将用于对番茄、水稻、白菜和拟南芥热激蛋白热激诱导删除bar基因的功能验证，并比较单一使用1xP位点与联合使用loxp-FRT融合识别位点的删除效率的差别。建立番茄、水稻、白菜和拟南芥选择标记剔除表达载体是实现转基因安全应用的重要突破，上述工作可提供基本元件和多样化的载体，为相关研究工作奠定了一定基础。
[0018](3)设计特异基因引物，利用PCR的方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)和白菜中克隆出一类对激酶活性调控的目标基因的RNAi片段，克隆测序后组装在Estrad1l诱导的启动子下，并在目标基因的3末端增加一个标签(HA)，构建表达元件中间载体。在植物双价表达载体T一DNA区段，35s:Npt Π:nos表达元件位于同向排列的Lox位点之间，然后通过构建一系列中间载体，再将HSP70: Cre:nos这一表达元件插入到Lox位点之间，目的基因将来可以插入到T一DNA区域两个同向排列的Lox位点之外，从而实现在植物遗传转化初期利用抗性筛选标记获得转基因植株，在得到转基因植株的基础上，通过温度诱导调控Cre基因的表达从而删除选择标记，获得含有目的基因而无选择标记的嵌合体。这将是一种对当前植物转基因技术更为安全有效的无标记系统。
[0019](4)载体构建成功后，使用一系列载体进行了拟南芥和白菜的转基因，对其转化条件和温度诱导条件一一植株预处理的时间、菌液侵染时间、温度诱导的时间，两种诱导型启动子及不同温度条件和不同Estrad1l浓度和时间处理下外植体的表现进行了实验，PCR检测表明，我们得到了高效率转化，高切除率的阳性转基因苗。
[0020]实施例2应用点特异重组的逆反应系统进行拟南芥SRl基因的敲除。
[0021]SRl为一个致死性蛋白，过表达和敲除都导致植株致死，这个质粒系统应用诱导型启动子诱导目标基因的表达，根据诱导表达的时间和表达丰度能够控制致死型蛋白的表达量。利用PCR的方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆出一类对SRl激酶活性调控的SRl基因RNAi小片段，克隆测序后以small酶切位点组装在Estrad1l诱导的启动子下，并在目标基因的3末端增加一个标签(HA)，构建表达元件中间载体。在植物双价表达载体T一DNA区段，35s:Npt Π: nos表达元件位于同向排列的Lox位点之间，然后通过构建一系列中间载体，再将HSP70:Cre:nos这一表达元件插入到Lox位点之间，目的基因将来可以插入到T一DNA区域两个同向排列的Lox位点之外，从而实现在植物遗传转化初期利用除草剂Basta筛选标记获得转基因植株，在得到转基因植株的基础上，通过42度温度诱导调控Cre基因的表达从而删除选择标记，删除率90%，获得含有目的基因而无选择标记的嵌合体。获得的植株结果如图1。
[0022]实施例3应用点特异重组的逆反应系统进行白菜型油菜腸Xrw基因的敲除。
[0023]WRKY31为一个转录因子，过表达和敲除都导致植株角果发育异常，无法收获种子。这个质粒系统应用诱导型启动子诱导目标基因的表达，根据是否需要收获种子而诱导WRKY31的表达。利用PCR的方法从白菜(Brass i ca rapa)中克隆出；^1^的RNAi基因片段，克隆测序后以small酶切位点组装在Estrad1l诱导的启动子下，并在目标基因的3末端增加一个标签(HA)，构建表达元件中间载体。在植物双价表达载体T一DNA区段，35s:Nptn:nos表达元件位于同向排列的Lox位点之间，然后通过构建一系列中间载体，再将HSP70:Cre:nos这一表达元件插入到Lox位点之间，目的基因将来可以插入到T一DNA区域两个同向排列的Lox位点之外，从而实现在植物遗传转化初期利用除草剂Basta筛选标记获得转基因植株，在得到转基因植株的基础上，通过38度温度诱导调控Cre基因的表达从而删除选择标记，删除率70%，获得含有目的基因而无选择标记的嵌合体。
[0024]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.双诱导同源重组无标记载体质粒，其特征在于:所述的质粒序列如SEQID N0.1所不O2.双诱导同源重组无标记载体质粒的构建方法，其特征在于:所述载体的构建方法为: (1)利用酵母基因组的Cre基因构建表达抗除草剂标记基因的元件； (2)以植物热激蛋白基因的启动子为酵母Cre重组酶基因的启动子，在38-45度温度下诱导表达重组酶； (3)将以上步骤(I)和(2)元件和RNAi载体组装在一起构建生态环保型质粒。3.如权利要求1所述的双诱导同源重组无标记载体质粒在水稻、拟南芥和白菜中应用。
【文档编号】C12N15/82GK105950652SQ201610391345
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】缪颖, 伍炳华, 任育军
【申请人】福建农林大学