别与根据 表3所示的SEQIDN0的对应多核苷酸具有指示的序列同一性：
[0205]
[0206] 因此，作为实例，上表3的优选实施方案A2("A2 -ChAd55"）是包含下述的多核苷 酸：
[0207] (i)在全长上与SEQIDN0:32至少98%相同的多核苷酸；
[0208] (ii)在全长上与SEQIDN0:38至少98%相同的多核苷酸；
[0209] (iii)在全长上与SEQIDN0:44至少98%相同的多核苷酸。
[0210] 下表4列出了上面概述的本发明的第四个方面的多核苷酸的大量进一步特别优 选的实施方案。优选的多核苷酸选自表4所示的多核苷酸A3至H3,其中所述多核苷酸编码 根据指示的SEQIDN0的腺病毒纤维、六邻体和五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所有3 种蛋白质和/或编码的功能性衍生物总共包含等于或少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或大于100,优选不超过20个缺失的、插入的、修饰的和 /或置换的氨基酸：
[0211]
[0212] 在本发明的第四个方面的多核苷酸的另一个实施方案中，所述多核苷酸编码根据 表4所不的各个SEQIDN0的同一毒株的腺病毒纤维和六邻体蛋白或其功能性衍生物。在 本发明的第四个方面的多核苷酸的另一个实施方案中，所述多核苷酸编码根据表4所示的 各个SEQIDN0的同一毒株的腺病毒纤维和五邻体蛋白或其功能性衍生物。在本发明的第 四个方面的多核苷酸的另一个实施方案中，所述多核苷酸编码根据表4所示的各个SEQID NO的同一毒株的腺病毒六邻体和五邻体蛋白或其功能性衍生物。在此上下文中，在每种情 况下所述功能性衍生物包含少于1、2、3、4、5、6、7、8、9或少于10，最优选少于3个缺失的、插 入的、修饰的和/或置换的氨基酸。
[0213] 在本发明的第四个方面的另一个优选的实施方案中，所述多核苷酸由下述多核苷 酸组成或包含下述多核苷酸：其在全长上与（i)由SEQIDN0:13、62、63或65中的任一个 组成的序列或（ii)由SEQIDN0:13、62、63或65中的任一个组成的并缺乏一个或多个基 因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E30RF1、E3 0RF2、E3 0RF3、E3 0RF4、E3 0RF5、E3 0RF6、E3 0RF7、E3 0RF8、E3 0RF9、E4 0RF7、E4 0RF6、E4 0RF5、E4 0RF4、E4 0RF3、E4 0RF2 和 / 或 E4 0RF1 的序列至少 90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 9%或 100%， 优选98%同一。因此，上述一个或多个基因组区域优选地在测定同一性百分比的比对中不 予考虑。在本发明的分离的多核苷酸的另一个优选的实施方案中，多核苷酸包含SEQID 勵：13、62、63或65或由5￡0 1〇勵：13、62、63或65组成，其中一个或多个基因组区域￡1八、 E1B、E2A、E2B、E3 0RF1、E3 0RF2、E3 0RF3、E3 0RF4、E3 0RF5、E3 0RF6、E3 0RF7、E3 0RF8、 E3 0RF9、E4 0RF7、E4 0RF6、E4 0RF5、E4 0RF4、E4 0RF3、E4 0RF2 和E4 0RF1 分别从SEQ IDNO: 13、62、63或65中被缺失或被置换为编码异源蛋白质的转基因或表达盒（如本文中 描述的）。在最优选的实施方案中，缺失腺病毒区域E1、E3和/或E4,这也在实施例2中举 例说明。上述优选的缺乏一个或多个指示的基因组区域的多核苷酸可进一步包含编码异源 蛋白质的多核苷酸序列或包含这样的编码异源蛋白质的多核苷酸序列的表达盒。可将所述 编码异源蛋白质的多核苷酸序列和所述包含这样的编码异源蛋白质的多核苷酸序列的表 达盒插入例如本发明的多核苷酸的缺失区域，这是本领域所熟知的并也在下面的实施例中 描述。所述异源蛋白质可为如本文描述的用于递送至靶细胞的分子，例如编码抗原蛋白或 其片段，优选病原体的抗原蛋白或片段例如HIVgag蛋白，肿瘤抗原或单纯疱疹病毒的蛋白 质的多核苷酸，如实施例中描述。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的分离的多核苷 酸进一步包含编码选自病毒抗原、病原细菌抗原和肿瘤抗原的抗原的多核苷酸。在一个实 施方案中，所述异源蛋白质因此可为选自RNA病毒抗原、病原细菌抗原和肿瘤抗原的抗原。 抗原指能够在哺乳动物中引起免疫应答的任意蛋白质或肽。抗原优选地包含至少8个氨基 酸和最优选包含8至12个氨基酸。因此，当测定序列同一性时，在比对中优选地不考虑基 因组区域￡认31832六32833和/或￡4，即使用下述序列进行比对，其由3￡〇10勵 ：13、 6263或65的全序列组成的但不包括基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4和/或任意编 码异源多肽的多核苷酸或包含这样的多核苷酸的表达盒。还如上所述地，优选根据本发明 的第四个方面和所有其优选实施方案的多核苷酸编码功能性六邻体、五邻体和/或纤维衣 壳蛋白或其功能性衍生物，例如编码的蛋白质具有与感染性腺病毒粒子中的各个衣壳蛋白 具有相同的功能。因此，在其衣壳中包含所述编码的重组五邻体、六邻体和/或纤维蛋白或 其功能性衍生物的重组腺病毒能够进入宿主细胞。进一步优选根据本发明的或由本发明的 多核苷酸编码的衣壳蛋白或其功能性衍生物在人中没有血清阳性率。
[0214] 本发明还提供了由根据本发明的分离的多核苷酸编码的分离的蛋白质，即由根据 本发明的第一、第二和/或第三个方面的分离的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽或 其功能性衍生物。在此上下文中，在一个实施方案中的"功能性衍生物"不包含超过5、10或 不包括超过25个的氨基酸改变（即缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸）。
[0215] 本发明还涉及包含根据本发明的分离的多核苷酸的载体。
[0216] 优选地，载体不包含选自￡认41842六42843和￡4的基因组区域中的基因，和/ 或包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因，其中所述至少一个 基因包含使所述至少一个基因无功能的缺失和/或突变。使这些基因产物之一无功能的一 种可能是在这些基因的开放阅读框中引入一个或多个人工终止子（例如TAA)。使病毒复制 缺陷的方法是本领域熟知的（见例如Brody等人，1994AnnNYAcadSci.，716:90-101)。
[0217] 在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码本发明的六邻体蛋白；五邻体蛋 白；纤维蛋白；六邻体蛋白和五邻体蛋白；六邻体蛋白和纤维蛋白；五邻体蛋白和纤维蛋 白；或六邻体蛋白、五邻体蛋白和纤维蛋白的多核苷酸和还包含另外的腺病毒多核苷酸。因 此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的分离的多核苷酸包含以下至少一项：
[0218] (a)腺病毒5'-反向末端重复（ITR);
[0219] (b)腺病毒Ela区，或其选自13S、12S和9S区的片段；
[0220] (c)腺病毒Elb区，或其选自小T、大T和IX区的片段；
[0221] (d)腺病毒E2b区，或其选自小pTP、聚合酶和IVa2区的片段；
[0222] (e)腺病毒L1区，或其片段，所述片段编码选自28.lkD蛋白、聚合酶、 agnoprotein、52/55kDa蛋白和Ilia蛋白的腺病毒蛋白质；
[0223] (f)腺病毒L2区或包含编码本发明的五邻体蛋白的多核苷酸的L2区，或其片段， 所述片段编码选自五邻体蛋白或本发明的五邻体蛋白、VII、V和Mu蛋白的腺病毒蛋白质；
[0224] (g)腺病毒L3区或包含编码本发明的六邻体蛋白的多核苷酸的L3区，或其片段， 所述片段编码选自VI蛋白、六邻体蛋白或本发明的六邻体蛋白和内切蛋白酶的腺病毒蛋 白质；
[0225] (h)腺病毒E2a区；
[0226] (i)腺病毒L4区，或其片段，所述片段编码选自100kD蛋白、33kD同源物和蛋白质 VIII的腺病毒蛋白质；
[0227] (j)腺病毒E3 区，或其选自E3 0RF1、E3 0RF2、E3 0RF3、E3 0RF4、E3 0RF5、E3 0RF6、E3 0RF7、E3 0RF8 和E3 0RF9 的片段；
[0228] (k)腺病毒L5区或包含编码本发明的纤维蛋白的多核苷酸的L5区，或其片段，所 述片段编码纤维蛋白或本发明的纤维蛋白；
[0229] (1)腺病毒E4 区，或其选自E4 0RF7、E4 0RF6、E4 0RF5、E4 0RF4、E4 0RF3、E4 0RF2和E4 0RF1的片段；特别是所述E4区的0RF6 ;
[0230] 和 / 或
[0231] (m)腺病毒 3'-ITR。
[0232] 在上述多核苷酸的一些实施方案中可能也如上所述地希望，优选地，所述多核苷 酸不包含如上概述的基因组区域的0RF(例如如在实施例2中定义的区域E3和/或E4)和 /或包含下述腺病毒基因，其包含使至少一个基因无功能的缺失和/或突变。在这些优选的 实施方案中，合适的腺病毒区将被修饰以不包含上述基因或使选定的基因无功能。任意腺 病毒基因缺失将为插入转基因例如如本文描述的小基因盒制造空间。此外，基因缺失可用 于产生下述腺病毒载体，其在不使用包装细胞系或辅助病毒的情况下不能复制，这是本领 域熟知的。因此，包含如上所述的包含一个或多个特定的基因/区域缺失或丧失功能的突 变的多核苷酸的最终重组腺病毒可为例如基因治疗或接种提供更安全的重组腺病毒。
[0233] 在特别优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下至少一项：
[0234] (a)SEQIDN0:13、62、63 或 65 中任一个的 5' -反向末端重复（ITR)区；
[0235] 〇3)5￡〇10勵：13、62、63或65中任一个的腺病毒￡1&区，或其选自135、125和95 区的片段；
[0236] (c)SEQIDN0:13、62、63或65中任一个的腺病毒Elb区，或其选自小T、大T和IX 区的片段；
[0237] ((1)3￡〇10勵：13、62、63或65中任一个的腺病毒￡213区；或其选自小口了？、聚合酶 和IVa2区的片段；
[0238] (6)3￡〇10勵:13、62、63或65中任一个的腺病毒11区，或其片段，所述片段编码 选自28.lkD蛋白、聚合酶、agnoprotein、52/55kDa蛋白和Ilia蛋白的腺病毒蛋白质；
[0239] &)3￡〇10勵:13、62、63或65中任一个的腺病毒12区，或其片段，所述片段编码 选自具有SEQIDN0:31、52或55的氨基酸序列的五邻体蛋白、VII、V和Mu蛋白的腺病毒 蛋白质；
[0240] &)3￡〇10勵：13、62、63或65中任一个的腺病毒13区，或其片段，所述片段编码 选自VI蛋白、具有SEQIDN0:25、51或54的氨基酸序列的六邻体蛋白和内切蛋白酶的腺 病毒蛋白质；
[0241] 〇1)3￡〇10勵：13、62、63或65中任一个的腺病毒￡2&区 ；
[0242] (1)3￡〇10勵：13、62、63或65中任一个的腺病毒14区，或其片段，所述片段编码 选自100kD蛋白、33kD同源物和蛋白质VIII的腺病毒蛋白质；
[0243] (]_)3￡〇10勵：13、62、63或65中任一个的腺病毒￡3区，或其选自￡3 01^1、￡3 0RF2、E3 0RF3、E3 0RF4、E3 0RF5、E3 0RF6、E3 0RF7、E3 0RF8 和E3 0RF9 的片段；
[0244] 〇〇3￡〇10勵：13、62、63或65中任一个的腺病毒15区，或其片段，所述片段编码 具有SEQIDNO: 19、50或53的氨基酸序列的纤维蛋白；
[0245] (1)3￡〇10勵：13、62、63或65中任一个的腺病毒￡4区，或其选自￡4 01^7、￡4 0RF6、E4 0RF5、E4 0RF4、E4 0RF3、E4 0RF2 和E4 0RF1 的片段；或Ad5E4 区的 0RF6(SEQID NO:64)；
[0246]和
[0247] (m)SEQIDNO: 13、62、63 或 65 中任一个的 3' -ITR。
[0248] 在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸还编码一个或多个优选所有以下腺 病毒蛋白质：蛋白质VI、蛋白质VIII、蛋白质IX、蛋白质Ilia和蛋白质IVa2。优选地这些 蛋白质由本文公开的PanAdl、PanAd2和PanAd3基因组序列的各自的开放阅读框编码。重 组腺病毒领域的一般技术人员熟知如何测定编码上述特定腺病毒蛋白质的开放阅读框。他 也知道腺病毒基因组的结构并可以不需过多劳动将本文概述的各个腺病毒区域和0RF定 位至例如本发明的新腺病毒基因组PanAdl、PanAd2和PanAd3中的任一个。
[0249] 为了表达多核苷酸，优选编码本发明的一个或多个腺病毒蛋白质的cDNA，可将所 述多核苷酸亚克隆至表达载体，所述表达载体包含引导转录的强启动子，转录/翻译终止 子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域所熟知的，例如大肠杆 菌、芽孢杆菌属物种和沙门氏菌，并且用于这些表达系统的试剂盒是可以商业获得的。类似 的用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域所熟知的并也可以商业获 得。
[0250] 除了启动子以外，表达载体通常包含转录单位或表达盒，所述转录单位或表达盒 包含在宿主细胞中表达腺病毒蛋白质编码核酸所需的所有其他元件。因此一般的表达盒包 含与编码腺病毒蛋白质/多肽的核酸序列可操作连接的启动子和转录物有效多聚腺苷酸 化所需的信号，核糖体结合位点和翻译终止子。表达盒的其他元件可包括例如增强子。表 达盒应也包含结构基因下游的转录终止区以提供有效终止。终止区可从与启动子序列相同 的基因中得到，或可从不同的基因得到。
[0251] 用于运送遗传信息至细胞的具体表达载体不是特别关键。可使用用于在真核或 原核细胞中表达的任意传统载体。标准细菌表达载体包括质粒例如基于PBR322的质粒、 pSKF、pET23D和融合表达系统例如GST和LacZ，但还有许多本领域技术人员已知的可被有 效利用的载体。
[0252] 包含来自真核病毒的调控元件的表达载体通常被用于真核表达载体，例如SV40 载体，乳头状瘤病毒载体和EB病毒来源的载体。其他示例性真核载体包括pMSG，pAV009/ A.sup. +、pMT010/A.sup. +、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、pcDNA3. 1、pIRES和任意其他允许 在下述启动子引导下表达蛋白质的载体：例如HCMV即早期启动子、SV早期启动子、SV晚期 启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动 子或其他显示对真核细胞中的表达有效的启动子。
[0253] -些表达系统具有提供基因扩增的标记例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二 氢叶酸还原酶。可选地，不涉及基因扩增的高产表达系统也是合适的。
[0254] 在表达载体中也可包括的元件包括在大肠杆菌中有功能的复制子，编码药物抗性 以允许选择含有重组质粒的细菌的基因，和在质粒的非必需区的唯一限制性位点以允许插 入真核序列。选择的具体药物抗性基因不是关键的一一本领域已知的许多药物抗性基因中 的任一种都是合适的。如果需要，任选地选择原核序列使其不干扰DNA在真核细胞中的复 制。
[0255] 可使用标准转染方法产生细菌、哺乳动物细胞、酵母或昆虫细胞系。可使用任意 熟知的用于将外源多核苷酸序列引入宿主细胞的程序。例如，可商业获得的基于脂质体的 转染试剂盒例如Lipofectamine?(Invitrogen)，可商业获得的基于脂的转染试剂盒例如 Fugene(RocheDiagnostics)，基于聚乙二醇的转染，磷酸|丐沉淀，基因枪（生物射弹），电 穿孔或病毒感染和可使用任意其他熟知的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其 它外源遗传物质引入宿主细胞的方法。仅需要使用的特定基因工程程序能够成功地将至少 一个基因引入能够表达受体的宿主细胞中。
[0256] 可使用标准技术任选地纯化表达的腺病毒蛋白质。例如，可在细胞进行沉淀和层 析步骤前机械地或通过渗压震扰裂解细胞，重组蛋白质的性质和序列将取决于待回收的特 定重组材料。可选地，重组蛋白质可以被分泌并从培养重组细胞的培养基中回收，如蛋白质 表达领域已知的。
[0257] 在一个优选的实施方案中，本发明的载体是质粒载体，例如表达载体。根据本发明 的质粒也可用于产生重组腺病毒。
[0258] 因此，本发明的另一个方面是重组腺病毒，优选不能复制的腺病毒，其包含根据本 发明的分离的多核苷酸和/或根据本发明的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽。优选地本发 明的重组腺病毒包含本发明的六邻体、纤维和五邻体蛋白，例如如在上表2中概述的组合。 在优选的实施方案中，重组腺病毒的特征在于其能够感染人细胞一一优选在所述腺病毒在 人血清中孵育1小时后能够感染人细胞，所述人血清来源于以前从未接触黑猩猩腺病毒的 人。
[0259] 由于提供了本发明的新六邻体、五邻体和纤维蛋白的序列信息，可以获得所述重 组腺病毒，例如通过构建由通常的腺病毒蛋白质组成但具有包含至少一种根据本发明的分 离的腺病毒衣壳多肽或其功能性衍生物的衣壳的重组腺病毒。在这点上优选重组腺病毒包 含含有编码本发明的五邻体蛋白的多核苷酸序列的L2区，含有编码本发明的六邻体蛋白 的多核苷酸序列的L3区和/或含有编码本发明的纤维蛋白的多核苷酸序列的L5区。最优 选地所述重组腺病毒包含分别编码本发明的五邻体、六邻体和纤维蛋白的L2区、L3区和L5 区。
[0260] 构建重组腺病毒的方法是本领域熟知的。例如在Graham&Prevec, 1991In MethodsinMolecularBiology:GeneTransferandExpressionProtocols, (Ed. Murray,EJ. )，p. 109 ;和Hitt等人，1997〃HumanAdenovirusVectorsforGeneTransfer intoMammalianCells〃AdvancesinPharmacology40:137-206 中综述了制备重组腺病毒 的有用技术。在W0 2006/086284中描述了其他方法。为了制备复制缺陷的腺病毒，可在补 充细胞系（complementingcellline)中表达E1A、E1B、E2A、E2B、E3 和E4 基因产物中的 一种或几种，所述补充细胞系可用于增殖和挽救不能复制的重组腺病毒，因为其缺乏例如 上述基因产物中的一种。这些细胞系的使用也在上述参考中描述。
[0261] 在一个实施方案中，使用本发明的多核苷酸（或包含本文描述的本发明的所述多 核苷酸的载体）产生重组腺病毒颗粒。重组腺病毒优选地如上述在一个或多个腺病毒区域 例如Ela或Elb区功能性缺失，和任选地具有其他突变，例如温度敏感突变或在其他腺病毒 基因中的缺失。在其他实施方案中，希望在重组腺病毒中保留完整的Ela和/或Elb区。这 样的完整E1区可位于其在腺病毒基因组中的天然位置或被置于天然腺病毒基因组中的缺 失位点（例如在E3区）。
[0262] 在构建腺病毒载体以递送基因至宿主例如人（或其它哺乳动物）细胞时，可在本 发明的载体中使用一系列腺病毒核酸序列。例如，可从组成重组病毒一部分的腺病毒序列 中除去腺病毒延迟早期基因E3的全部或部分。认为猿E3的功能和重组病毒颗粒的功能和 产生无关。在某些实施方案中，也可构建具有E4基因的至少0RF6区缺失的，和更理想地因 为此区域功能中的冗余性，缺失全部E4区的腺病毒载体。本发明的还另一个载体在延迟早 期基因E2a中含有缺失。也可在猿腺病毒基因组晚期基因L1至L5中的任意基因中进行缺 失。类似地，在中期基因IX和IVa2中的缺失可用于某些目的。可在其他结构和非结构腺 病毒基因中进行其他缺失。可单独使用上面讨论的缺失，即用于本发明的腺病毒序列可仅 在单个区域中包含缺失。可选地，可以任意组合使用整个基因的缺失或有效破坏其生物活 性的其部分的缺失。例如，在根据本发明的一个不例性载体中，腺病毒序列可具有E1和E4 区的缺失，或El，E2a和E3区的缺失，或E1和E3区的缺失，或El，E2a和E4区的缺失，具有 或不具有E3缺失，等等。如上讨论地，这些缺失可与其他腺病毒基因突变例如温度敏感突 变组合使用以获得预期结果。
[0263] 可在存在缺少的、对病毒感染性和腺病毒颗粒增殖所必需的腺病毒基因产物的情 况下培养缺乏任意必需腺病毒序列（例如选自Ela、Elb、E2a、E2b、E4 0RF6、L1或L4的区 域）的腺病毒载体。可通过在一种或多种辅助构建体（例如质粒或病毒）或包装宿主细胞 (如上所述的补充细胞系）的存在下培养腺病毒载体以提供这些辅助功能。见例如本文包 括的实例和1996年5月9日公开的国际专利申请W096/13597(引入本文作为参考）中所 描述的用于制备"最小"人腺病毒载体的技术。
[0264] 有用的辅助病毒包含补充在本发明的腺病毒载体的优选实施方案中缺失的和/ 或所述载体转染的包装细胞系不表达的各个基因的选定的腺病毒基因序列。在一个实施方 案中，辅助病毒是复制缺陷的并包含除了上述序列以外的多种腺病毒基因。
[0265] 可也使辅助病毒形成多聚阳离子缀合物，如Wu等人，J.Biol. Chem. ,264:16985-16987 (1989) ;K.J.Fisher和J.M.Wilson,Biochem.J. ,299:49(April 1，1994)中所述。辅助病毒可任选地包含第二个报告小基因（minigene)。大量这样的报告 基因是本领域已知的。在辅助病毒上存在不同于腺病毒载体上的转基因的报告基因允许独 立地监控腺病毒载体和辅助病毒二者。在纯化时，此第二个报告基因可用于帮助得到的重 组病毒和辅助病毒之间的分离。
[0266] 为了产生在本文的优选实施方案中描述的缺失任意基因的重组腺病毒（Ad)，如果 缺失的基因对病毒的复制和感染性是必需的，优选地通过辅助病毒或细胞系，即补充或包 装细胞系提供缺失的基因的功能。在许多情况下，表达人E1的细胞系可用于反式补充用于 产生重组腺病毒的载体。这是特别有利地，因为由于在本发明的多核苷酸序列和在目前可 利用的包装细胞中发现的人腺病毒E1序列之间的差异，使用目前包含人E1的细胞在复制 和生产过程中将避免产生能够复制的腺病毒。然而，在某些情况下，希望使用表达E1基因 产物的细胞系以产生E1缺失的重组腺病毒。
[0267] 如果希望，可使用本文提供的序列以产生在用于在选定的亲本细胞系例如HeLa 细胞中表达的启动子的转录控制下在