dAb和互补决定区（CDR) 变体，单链抗体（scFv)，嵌合抗体，人源化抗体，双抗体和包含抗体的至少一部分的多肽，所 述抗体的至少一部分足以赋予特定抗原与该多肽结合。
[0106] 在本发明上下文中将在哺乳动物中施用免疫原/抗原以引起/产生免疫应答称为 "引发"，将在哺乳动物中施用免疫原/抗原以增强针对所述免疫原/抗原例如特定病原（例 如病毒粒子或病毒病原体，病原细菌的抗原或肿瘤抗原）的免疫应答称为"加强"。短语"异 源引发-加强"的意思是用于在哺乳动物中引起/产生免疫应答（引发）的载体和用于在 哺乳动物中增强免疫应答（加强）的载体是不同的。如果受试者例如患者已对第一个载体 产生了抗体并需要加强，"异源引发-加强"是有用的。因此，在异源引发-加强的优选实施 方案中可使用2种不同的腺病毒，例如用于接种和/或基因治疗。在此上下文中，如果在第 一种腺病毒引发过程中引起的抗体应答不能阻止超过70%或优选超过80%的施用的用于 加强的第二种腺病毒颗粒进入已经历引发和加强的动物的细胞核，第一种和第二种腺病毒 应具有足够大的差异。
[0107] 术语"可复制的"重组腺病毒（AdV)指在细胞中不包含任意重组辅助蛋白质的情 况下可以在宿主细胞中复制的腺病毒。优选地，"可复制的"腺病毒包含以下完整或功能必 需的早期基因：E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4。从特定动物分离的野生型腺病毒可在该动物 中复制。
[0108] 术语"复制缺陷的"重组AdV指已变得不能复制的腺病毒，因为其已被改造为包含 至少一个功能性缺失，即损伤基因功能但不完全将其去除的缺失，例如引入人工终止子，缺 失或突变活性位点或相互作用结构域，突变或缺失基因的调控序列等等，或完全去除编码 对于病毒复制所必需的基因产物的基因，例如一个或多个选自E1、E2、E3和E4的腺病毒基 因。本发明的重组黑猩猩腺病毒载体优选地是复制缺陷的。
[0109] 在多核苷酸、多肽或蛋白质序列的上下文中，术语"同一性"或"相同 的"（"identical"）指当进行最大对应性比对时，在2条序列中相同的残基数。特别地，2 条序列的序列同一性百分比（不管是核酸或氨基酸序列）是2条比对的序列之间的精确匹 配数除以较短的序列长度然后乘以100。可用于比对2条序列的比对工具是本领域技术人 员熟知的，例如可从万维网，例如ClustalW(www.ebi.ac.uk/clustalw)或Align(http:// www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)上获得。2条序列之间的比对可使用标准设置 进行，对AlignEMBOSS: :needle优选：矩阵：Blosum62,缺口开放10. 0，缺口延伸0. 5。本 领域技术人员理解可能有必要在2条序列中的任一条中引入缺口以产生令人满意的比对。 将2条多肽之间的"最佳序列比对"定义为产生最大的比对同一残基数的比对。
[0110] 腺病毒
[0111] 腺病毒（Ad)是已在若干禽类和哺乳动物宿主中鉴定的无囊膜二十面体病毒。人 腺病毒（hAd)属于哺乳动物腺病毒属，其包括所有已知的人腺病毒和许多动物（例如牛、 猪、犬、鼠、马、猿和羊）腺病毒。通常基于大量生物学、化学、免疫学和结构标准将人腺病 毒分为6个亚群（A-F)，这些标准包括大鼠和猕猴红细胞的血凝性能，DNA同源性，限制酶 切割模式，G+C含量百分比和致癌性（Straus, 1984,inTheAdenoviruses,H.Ginsberg 编，pps. 451-498,NewYork:PlenusPress,和Horwitz，1990;inVirology,B.N.Fields和 D.M.Knipe编，pps. 1679-1721)。
[0112] 腺病毒粒子具有二十面体对称和60-90nm的直径（取决于血清型）。二十面体衣 壳包含3种主要蛋白质、六邻体（II)、五邻体基质（III)和隆起的（knobbed)纤维（IV)蛋 白（W.C.Russel,J.Gen.Virol.，81:2573-2604(2000))。在人中观察到的先存免疫力的一个 方面是体液免疫，其可导致特异性针对腺病毒蛋白质的抗体的产生和持续。腺病毒引起的 体液应答主要针对3个主要的结构蛋白：六邻体、五邻体和纤维。
[0113] 至今已识别了 51个不同的人腺病毒血清型并基于其血凝性能和生物物理和生 物化学标准分为亚群。已发表的报导已确定包含针对多种血清型的抗体的滴度是普遍的 (Dambrosio，E. (1982)J.Hyg. (London)89:209-219)并且滴度的相当大的一部分具有中和 活性。
[0114] 如所述，重组腺病毒可用于基因治疗和作为疫苗。基于黑猩猩腺病毒的病毒载体 为使用人源Ad载体用于基因疫苗的开发提供了替代方案（FarinaSF，JVirol. 2001Dec; 75(23):11603-13.;FattoriE，GeneTher.2006Jul;13(14):1088-96)。从黑猩猩中分离 的腺病毒与从人中分离的腺病毒紧密相关，如它们在人源细胞中的有效增殖所证明的。但 是，由于人和黑猩猩腺病毒是近亲，可以预期在2个病毒物种之间的血清学交叉反应。
[0115] 当黑猩猩腺病毒被分离和表征后，此推测得到证实。然而，来自黑猩猩的腺病毒分 离株显示了与人腺病毒表位的普通血清型的减少的交叉反应。因此，黑猩猩腺病毒（本文 中又将普通黑猩猩腺病毒简称为"ChAd"和将倭黑猩猩腺病毒简称为"PanAd"）提供了降低 与人中针对人腺病毒普通血清型的先存免疫力相关的副作用的基础。但是，在人血清的亚 群中检测到针对目前分离的黑猩猩腺病毒的低至中度中和滴度，因此所有已知的黑猩猩腺 病毒血清型仍然可被人血清在一定程度上中和。
[0116] 本发明包含意料之外的发现：可分离到新的黑猩猩腺病毒毒株，即从普通黑猩 渥（Pantroglodytes)中分离的ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47 和从倭黑渥 猩（Panpaniscus)中分离的PanAdl、PanAd2和PanAd3。所有这些新的毒株在人中显示 了测量不到的血清阳性率，即这些腺病毒毒株代表了迄今为止描述的黑猩猩腺病毒中的例 外，因为检测的所有人血清对中和抗体的存在完全呈阴性。在此上下文中，中和抗体指这 样的抗体，其结合腺病毒的表位并阻止腺病毒在宿主细胞中产生有效感染或阻止表达转基 因的不能复制的载体转导靶细胞，例如腺病毒DNA能够进入宿主细胞。尽管在所有现有技 术中的黑猩猩来源的腺病毒中观察到中和抗体，新的腺病毒类型ChAd55、ChAd73、ChAd83、 ChAdl46、ChAdl47、PanAdl、PanAd2和PanAd3的特征在于：在人中完全缺乏针对这些腺病毒 类型的先存中和抗体。因此，这些腺病毒提供了有价值的医学工具，例如可被用于免疫和/ 或基因治疗。
[0117] 如下进一步详细描述的，本发明在一个方面提供了代表大部分暴露在表面的腺病 毒表位的腺病毒衣壳蛋白，即六邻体、五邻体和纤维蛋白的新序列。如已经提到的，在人血 清中不包含特异性针对根据本发明的病毒的中和抗体。因此，上述黑猩猩六邻体、五邻体和 纤维蛋白的新序列的一个优势是可将这些蛋白质序列用于增强现有技术中已被改造用于 例如医学目的的腺病毒。例如，本发明的衣壳蛋白或其功能片段可用于例如分别替换/置 换不同的腺病毒（例如现有技术的腺病毒）的一个或多个主要结构衣壳蛋白或其功能片段 以得到在人中具有减少的血清阳性率的改进的重组腺病毒。因为本发明的新腺病毒以及如 上所述的已重新改造的腺病毒在施用时在人中不会遭遇任何显著的抑制性免疫应答，其总 体转导效率和感染性将提高。因此，预期这样改进的腺病毒被期望是例如更有效的疫苗，因 为病毒进入宿主细胞和抗原盒的表达将不会受到任何显著滴度的中和抗体的阻碍。此外， 如在实施例中所示，甚至在使用包含ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47、PanAdl、 PanAd2或PanAd3分离株的六邻体、五邻体和纤维蛋白的编码HIV-gag的重组腺病毒接种 的初次接受实验的小鼠中引起了针对HIVgag的有效免疫应答。ChAd55-gag、ChAd73-gag、 ChAd83-gag、ChAdl46-gag、ChAdl47-gag、PanAdl-gag、PanAd2_gag和PanAd3_gag腺病毒引 起的免疫应答与迄今为止基于现有技术中表达HIVgag蛋白的重组人Ad5载体开发的最有 效的载体所观察到的应答相当（见图5A、5B、5C中酶联免疫斑点（ELIspot)测定的数据）。
[0118] 如上所述，腺病毒引起的体液应答主要针对3种主要的腺病毒结构蛋白质：六邻 体、五邻体和纤维蛋白，其均包含组成腺病毒衣壳的一部分和暴露在病毒颗粒以外的多肽 序列（又见：MadischI，等人，J.Virol. 2005Dec;79 (24) : 15265-76 ;又见：MadischI，等 人，JVirol. 2007Aug;81(15):8270-81 和Pichla-GollonSL,等人，J.Virol. 2007Feb; 81(4) : 1680-9)。
[0119] 如图1所示的多重序列比对所示，本发明的PanAdl、PanAd2、PanAd3、ChAd55、 ChAd73、ChAd83、ChAdl46和ChAdl47这一组的新腺病毒分离株共有非常相似的六邻体 蛋白质序列。在比对中也标记了高变区（HVR)，其出现在六邻体分子顶端位于病毒粒子 外部并覆盖大量病毒粒子表面的环中（见JophnJ.Ruxet.Al，J.ofVirology,Sept 2003,vol. 77,no. 17)。在图2和3中分别提供了新的黑猩猩腺病毒的其他衣壳蛋白纤维蛋 白和五邻体的序列相关性。预计所有3种结构衣壳蛋白均作用于低血清阳性率，因此可彼 此独立地或组合用于抑制腺病毒与先存中和抗体的亲和力，例如用于制备具有减少的血清 阳性率的重组嵌合腺病毒。
[0120] 因此，在一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白或其功 能性衍生物并且其选自：
[0121] (&)编码具有根据5￡〇10勵：14-19、50和53;即5￡〇10勵：14、15、16、17、18、19、 50或53中任意氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0122] 〇3)编码根据5￡〇10勵：14-19、50和53;即5￡〇10勵：14，15，16，17，18，19、50或 53中任意多肽的功能性衍生物的多核苷酸，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸 残基的缺失、插入和/或置换；和
[0123]((：)编码具有在全长上与5￡〇10勵：14-19、50和53;即5￡〇10勵：14、15、16、 17、18、19、50 或 53 中任意氨基酸序列至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%，更优选至少85%和最优选至少99%相同的 氨基酸序列的功能性衍生物的多核苷酸。
[0124] "腺病毒纤维蛋白"的意思是腺病毒中包含的隆起的纤维（IV)蛋白。在优选的实 施方案中，本发明第一个方面和以下描述的其优选的实施方案中包含的分离的多核苷酸编 码与感染性腺病毒粒子中的纤维蛋白或其片段具有相同功能的纤维蛋白或其功能性衍生 物。因此，优选包含所述纤维蛋白或功能纤维蛋白衍生物作为衣壳蛋白的重组腺病毒能够 进入宿主细胞。可以容易地测定重组腺病毒是否能够进入宿主细胞。例如，在宿主细胞接 触腺病毒后可洗涤并裂解重组宿主细胞，使用例如特异性针对腺病毒RNA和/或DNA的合 适的杂交探针可测定是否在宿主细胞中发现了腺病毒RNA和/或DNA。可选或另外地，可洗 涤、裂解并用腺病毒特异性抗体探测（例如使用蛋白质印迹）已与重组腺病毒接触的宿主 细胞。在另一个可选方案中，例如在体内观察宿主细胞在被重组腺病毒感染后是否表达一 种基因产物，例如荧光蛋白，所述重组腺病毒包含合适的表达盒以在宿主细胞中表达所述 基因产物。
[0125] 进一步优选地，纤维蛋白和其功能性衍生物对腺病毒五邻体蛋白例如对SEQID NO: 26-31、52和/或55具有亲和力。一般技术人员熟知如何检测蛋白质-蛋白质亲和力。 为了测定第一种蛋白是否能够结合第二种蛋白，例如黑猩猩来源的腺病毒的五邻体蛋白， 技术人员可使用例如遗传学的酵母双杂交测定或生物化学测定例如拉拽（pull-down)，酶 联免疫吸附测定（ELISA)，基于荧光激活的细胞分选（FACS)测定或等离子共振测定。当使 用拉拽或等离子共振测定时，将至少一种蛋白质与亲和标签例如HIS-标签、GST-标签或其 他生物化学领域中熟知的其他标签融合是有用的。腺病毒纤维蛋白以其糖基化形式能够进 一步三聚化。因此，也优选根据本发明的第一个方面的多核苷酸编码的纤维蛋白或其片段 能够被糖基化和/或形成三聚体。
[0126] 如本申请通篇使用的，短语蛋白质或多肽的"功能性衍生物"通常指蛋白质或多肽 的修饰形式，例如蛋白质或多肽的一个或多个氨基酸可被缺失、插入、修饰和/或置换。上 面也提到过，如果在其衣壳中包含功能性衍生物的嵌合腺病毒能够感染宿主细胞，则衍生 物是有功能的。此外，在"功能性衍生物"的上下文中，插入指在原始多肽或蛋白质中插入 一个或多个氨基酸。优选地功能性衍生物不含有超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100个氨基酸改变（即缺失、插入、修饰和/或置换的 氨基酸）。在另一个实施方案中，优选地不超过1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%、15%或不超过20% (最优选不超过5%)的蛋白质或多肽的所有氨基酸被改变（即 缺失、插入、修饰和/或置换的氨基酸）。也可修饰，例如化学修饰蛋白质或多肽的氨基酸。 例如，通过例如糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等可修饰蛋白质或多肽的氨基酸的侧链或 游离氨基或羧基末端。如本领域熟知的，也可在体内例如在宿主细胞内进行化学修饰。例 如，在蛋白质的氨基酸序列中存在的合适的化学修饰基序，例如糖基化序列基序将导致蛋 白质被糖基化。在衍生物中的置换可以为保守或非保守置换，优选保守置换。在某些实施 方案中，置换也包括天然存在氨基酸和非天然存在氨基酸的交换。保守置换包含将氨基酸 置换为另一个与被置换的氨基酸具有类似化学性质的氨基酸。优选地，保守置换是选自下 述的置换：
[0127] (i)将碱性氨基酸置换为另一个不同的碱性氨基酸；
[0128] (ii)将酸性氨基酸置换为另一个不同的酸性氨基酸；
[0129] (iii)将芳香族氨基酸置换为另一个不同的芳香族氨基酸；
[0130] (iv)将非极性脂肪族氨基酸置换为另一个不同的非极性脂肪族氨基酸；
[0131] (V)将极性、不带电荷的氨基酸置换为另一个不同的极性、不带电荷的氨基酸。
[0132] 碱性氨基酸优选地选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选地是天冬氨酸 或谷氨酰胺。芳香族氨基酸优选地选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性、脂肪族氨基酸 优选地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性、不带电荷的氨基 酸优选地选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸置换 相反，非保守氨基酸置换是一个氨基酸与任意不属于上述所列保守置换（i)至（v)的氨基 酸的交换。
[0133] 如果功能性衍生物包含缺失，那么在衍生物中已去除了在参考多肽或蛋白质序列 中存在的一个或几个氨基酸。但是缺失不能过多以致衍生物总共包含的氨基酸少于200 个。
[0134] 上面已描述了测定序列同一性的方法。此外，也可使用Karlin和Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877的数学算法测定2条序列之间的百分比同 一性。Altschul等人（1990)J.Mol.Biol. 215:403-410 的BLASTN和BLASTP程序也包含这 样的算法。当使用BLASTN和BLASTP时优选使用这些程序的默认参数。
[0135] 如上所述，腺病毒六邻体蛋白的高变结构域暴露在腺病毒的外侧。因此可通过中 和抗体识别和结合腺病毒衣壳的这些区域。因此，具有包含来源于本发明的新的腺病毒分 离株之一的六邻体蛋白的衣壳的腺病毒在人中将展示改进的即较小的血清阳性率。因此， 在第二个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生 物并且其选自：
[0136] (&)编码具有根据5￡01〇勵:20-25、51和54，即5已0 1〇勵:20、21、22、23、24、25、 51或54中任意氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0137] (b)编码根据SEQIDN0:20-25、51和54、即SEQID勵：20、21、22、23、24、25、51或 54中任意多肽的功能性衍生物的多核苷酸，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸 残基的缺失、插入和/或置换；和
[0138] ((：)编码具有在全长上与5￡0 1〇勵:20-25、51和54，即5￡0 1〇勵:20、21、22、23、 24、25、51或54中任意氨基酸序列至少95%、98%、99%、99. 5%、99. 9%或至少99. 95%，更 优选至少98%和最优选至少99. 95%相同的氨基酸序列的功能性衍生物的多核苷酸。
[0139] 在优选的实施方案中，在本发明的第二个方面和以下描述的其优选实施方案中包 含的分离的多核苷酸编码与感染性腺病毒粒子中的六邻体蛋白或其片段具有相同功能的 六邻体蛋白或其功能性衍生物。因此，优选包含所述六邻体或功能性衍生物作为衣壳蛋白 的重组腺病毒能够进入宿主细胞。产生六邻体蛋白的功能性衍生物的一种合适方法在美国 专利5, 922, 315中描述，将其引入作为参考。在此方法中，腺病毒六邻体的至少一个环区域 改变为另一种腺病毒血清型的至少一个环区域。例如，本发明的六邻体蛋白质的环区域可 用于置换现有技术中的腺病毒的对应的六邻体环以产生改进的杂交腺病毒。类似地也可产 生本发明的五邻体和纤维蛋白的衍生物。
[0140] 在第三个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒五邻体蛋白或其功 能性衍生物并且其选自：
[0141] (a)编码具有根据SEQIDN0:26-31、52 和 55，即SEQIDN0:26、27、28、29、30、31、 52或55中任意氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0142] (b)编码根据SEQIDN0:26-31、52和 55,即SEQID勵：26、27、28、29、30、31、52或 55中任意多肽的功能性衍生物的多核苷酸，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸 残基的缺失、插入和/或置换；和
[0143] (c)编码具有在全长上与SEQIDN0:26-31、52 和 55,即SEQIDN0:26、27、28、 29、30、31、52 或 55 中任意氨基酸序列至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%，更优选至少85%和最优选至少99%相同的 氨基酸序列的功能性衍生物的多核苷酸。
[0144] 优选地，五邻体蛋白和其功能性衍生物对腺病毒纤维蛋白例如对SEQID NO: 14-19、50和/或53具有亲和力。如上所述一般技术人员熟知如何检测蛋白质-蛋白质 亲和力。"腺病毒五邻体蛋白"的意思是在腺病毒中包含的五邻体基质（III)蛋白。腺病毒 五邻体蛋白的特征在于其位于衣壳的二十面体对称的转角（corner)。如上所述，在本发明 的第一、第二和/或第三个方面和如下文描述的其优选实施方案的多核苷酸的优选实施方 案中，所述多核苷酸编码一种或多种多肽，其中优选包含所述一种或多种多肽作为衣壳蛋 白的重组腺病毒能够感染，即进入宿主细胞。
[0145] 下面将对本文公开的每个新黑猩猩腺病毒分离株详细说明本发明的第一、第二和 第三个方面的优选实施方案。
[0146]腺病毒ChAd55
[0147] 在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQID NO: 14的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物（i)不 包含超过 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或超过 100,优 选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或（ii)具有在全长上与SEQID N0:14 的氨基酸序列至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %或至少99 %，更优选至少85 %和最优选至少99 %相同的氨基酸序列。
[0148] 在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQID N0:20的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物（i) 不包含超过 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或超过 100， 优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或（ii)具有在全长上与SEQ 10吣:20的氨基酸序列至少95%、98%、99%、99.5%、99.9%或至少99.95%，更优选至少 98 %相同的氨基酸序列。
[0149] 在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQID N0:26的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物（i) 不包含超过 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或超过 100， 优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或（ii)具有在全长上与SEQ IDN0:26的氨基酸序列至少98%、99 %、99. 5%、99. 9%或至少99. 95%，更优选至少98% 和最优选至少99. 9%相同的氨基酸序列。
[0150] 在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二 和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸 包含其他在腺病毒基因组中（例如使用Ad5基因组作为参考）与六邻体、五邻体和/或纤 维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病 毒颗粒所需的序列。
[0151]腺病毒ChAd73
[0152] 在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQID N0:15的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物（i)不 包含超过 1、2、3、4、5、6