Fields和D.M.Knipe,编（ravenPress,NewYork)pp. 1679-1740)的亚 群E(ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47)和亚群C(PanAdl、PanAd2 和PanAd3)。
[0326] 通过比对人和黑猩猩腺病毒的六邻体氨基酸序列得到系统树。结果与使用Align X程序（Informax,Inc)基于局限于六邻体HVR1-6和7的核苷酸序列比对的最初分类一致， 证明ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47分离株与人Ad4(亚群E)的密切的系统发 生关系，而倭黑渥渥腺病毒分尚株PanAdl、PanAd2和PanAd3与人Adl、2、5、6 (亚群C)有 关。
[0327] 实施例2 :载体构建
[0328] 根据下述策略在质粒载体中克隆PanAdl、PanAd2和PanAd3以及ChAd55、ChAd73、 ChAd83、ChAdl46、ChAdl47病毒基因组。对载体基因组的所有操作在大肠杆菌中根据标准 技术进行。通过从ChAd和PanAd骨架缺失E1和E3区域构建载体系统。用基于人CMVIE 启动子和BGHpA信号的包含HCV非结构区（HCVNS)和HIVgag(SEQIDN0:1)基因的表达 盒替换El区以用于在动物模型中评估免疫学效价。此外，构建了表达分泌的碱性磷酸酶基 因（SEAP)的ChAd和PanAd载体用于中和测定。根据标准方案在293细胞中增殖载体并通 过CsCl梯度纯化。
[0329] 按照以下提供的步骤进行PanAdl、PanAd2和PanAd3AE1载体的构建。
[0330]I.PanAd穿梭载体的构建
[0331] 使用PanAdl基因组构建穿梭载体，用于通过PanAdl、PanAd2和PanAd3全基因组 的同源重组的克隆。简单地说，如下构建用于克隆倭黑猩猩腺病毒1的穿梭载体，在本文中 将其称为pBAdlRLD_EGFP:
[0332]通过PCR使用寡核苷酸 5 '-ATCTGGAAITCGITTAAACCATCATCAATAATATACCTTAITT EQIDN0:8)扩增PanAdl左端（nt1-450)，用Spel和EcoRI消化，然后连接至已包含HCMV-EGFP-bghpolyA表达盒的质粒载体从而产生pBAdl-L。然后通过PCR使用寡核苷 酸 5'-TCCAGCGGCGCGCCAGACCCGAGTCTTACCAGGA-3'（SEQIDN0:9)和 5'-ATTCAGGATCCG AAirCGITTAAACCATCATCAATAATATACCTTAmTG-3'（SEQIDN0:10)扩增PanAdl右端（nt 37362-37772)，然后克隆至pBAdl-L，由此产生质粒pBAdl-RL。
[0333]然后通过PCR使用寡核苷酸 5' -TAITCTGCGATCGCTGAGGTGGGTGAGTGGGCG-3'（SEQ IDN0:11)和 5'-TTACTGGCGCGCCTGCCTCGAGTAAACGGCATTTGCAGGAGAAG-3'（SEQIDN0:12) 扩增包含pIX编码区的PanAdlDNA片段（nt3498-4039)，然后将其克隆至pBAdl-RL，得到 pBAdlRLDEGFP穿梭质粒。通过置换pBAdlRLDEGFP穿梭质粒中的EGFP基因也构建了包含 分泌的碱性磷酸酶（SEAP)、HIVgag、HCV非结构区（NS)基因的表达盒的穿梭质粒。
[0334] 如Emini等人，国际公开号WO03/031588中所描述的构建基于人巨细胞病毒 (HCMV)启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号（BghpolyA)的HIVgag、HCVNS区、SEAP和 EGFP表达盒。病毒DNA表达盒被设计为包含仅在2个ITR的末端存在的限制酶位点（Pmel) 以允许从质粒DNA中释放病毒DNA。
[0335]II.AElPanAdl、PanAd2 和PanAd3 载体的构建
[0336] 通过在大肠杆菌菌株BJ5183中的同源重组构建PanAdl、PanAd2和PanAd3载体。 用PanAdl、2 和 3 的纯化病毒DNA和pBAdlRLD-EGFP或pBAdlRLD-Gag共转化BJ5183 细胞。 在线性化pBAdlRLD-EGFP或pBAdlRLD-Gag末端存在的pIX基因、右ITRDNA序列和病毒基 因组DNA之间的同源重组允许病毒基因组DNA通过同时缺失E1区（其被表达盒置换）插入 质粒载体。此策略允许构建表达EGFP或HIVgag转基因的preadeno质粒pPanAdl、pPanAd2 和pPanAd3。然后通过替换EGFP或Gag表达盒将SEAP或HCV-NS表达盒克隆至pPanAd1、 2和3载体。
[0337]III.E3区的缺失
[0338] 通过使用包括在大肠杆菌中的克隆和同源重组的若干步骤的策略在 PanAdl,PanAd2和PanAd3载体骨架中引入E3区的缺失。PanAdlE3缺失跨越基因组PanAdl 序列（SEQIDNO. : 13)的第28636位核苷酸至第32596位核苷酸；PanAd2E3缺失跨越基 因组PanAd2序列（SEQIDN0. :62)的第28653位核苷酸至第32599位核苷酸；PanAd3E3 缺失跨越基因组PanAd3序列（SEQIDNO. : 63)的第28684位核苷酸至第32640位核苷酸。
[0339]IV.E4区的缺失
[0340] 缺失PanAdl,PanAd2和PanAd3的天然E4区并替换为Ad5E4 0RF6编码序列（SEQ IDN0. :64)。在PanAd1，2和3骨架中引入的E4缺失的坐标如下：
[0341]PanAdlE4 缺失跨越第 34690 至 37369 位核苷酸（SEQIDN0. : 13);
[0342]PanAd2 E4 缺失跨越第 34696 至 37400 位核苷酸（SEQIDNO. : 62);
[0343]PanAd3 E4 缺失跨越第 34690 至 37369 位核苷酸（SEQIDNO. : 63)。
[0344] 缺失的区域包括所有PanAdE4 0RF但E4的天然启动子和多聚腺苷酸化信号未被 缺失。
[0345] 如Emini等人，国际公开号W0 03/031588中所描述的构建基于人巨细胞病毒 (HCMV)启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号（BghpolyA)的HIVgag和HCVNS区表达 盒并利用HCMV和BghpolyADNA序列之间的同源性通过在大肠杆菌菌株BJ5183中的同源 重组插入PanAdl、2和3AE1EGFP载体。
[0346]V.ChAd55DE1表达载体的构建和挽救
[0347] 构建用于ChAd55克隆的穿梭载体
[0348] 根据上面描述的构建PanAd载体的相同策略构建ChAd55穿梭质粒，然后用于克隆 ChAd55病毒基因组。为此，用AscI限制酶线性化包含病毒基因组右端和左端的穿梭载体 PARSChAd55 (左端从ITR至pIX基因具有E1区被缺失并被置换为表达盒）并与ChAd55的 纯化病毒DNA共转化至大肠杆菌菌株BJ5183。在线性化pARSChAd55以及ChAd55、ChAd73、 ChAd83、ChAdl46和ChAdl47的纯化病毒基因组DNA末端存在的pIX基因和右ITR之间的 DNA序列的同源重组允许病毒基因组DNA通过同时缺失E1区插入质粒载体。图4提供了黑 猩猩腺病毒55 (ChAd55)基因组克隆策略的图解。
[0349] 构建了基于人巨细胞病毒（HCMV)启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号（Bgh polyA)的表达盒以表达分泌的碱性磷酸酶（SEAP)、EGFP、HIVgag、HCVNS基因。将所有表 达盒插入将要通过同源重组转移至AE1腺病毒预质粒（pre-plasmid)的pARSChAd55载 体的单个SnaBI位点中。
[0350] 实施例3:免疫实验
[0351] 使用表达HIVgag转基因的载体在小鼠中评估了ChAd55、ChAd73、ChAd83、 ChAdl46、ChAdl47、PanAdl、PanAd2和PanAd3载体作为潜在的重组疫苗的效力。在平行进 行的免疫实验中比较了ChAd55gag和人Ad5gag的载体效价。对10只动物的实验组在四头 肌内注射l〇svp/小鼠载体剂量的Ad5gag或ChAd55gag(图5A)。在单独的实验中对5只动 物的实验组注射l〇Svp/小鼠载体剂量的Ad5gag或PanAdlgag,PanAd2gag和PanAd3gag(图 5B)。通过用10svp/小鼠载体剂量的ChAd55gag平行免疫5只小鼠的实验组也测定了 ChAd73gag、ChAd83gag、ChAdl46gag和Chadl47gag的效价（图5C)。通过在脾细胞上的干 扰素-yElispot测定测量针对HIVgag引起的免疫应答。相比人Ad5gag载体，ChAd55、 ChAd73、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47以及PanAdl、PanAd2和PanAd3在免疫实验中的结果显 示本发明的新腺病毒在引发特异性免疫应答方面至少和现有技术的重组腺病毒Ad5-样 有效。
[0352] 实施例4:中和研究
[0353] 进行了中和测定以评估针对普通黑猩猩腺病毒55、73、83、146、147和倭黑猩猩腺 病毒1、2和3型的中和抗体在人血清中的阳性率。该测定评估了血清预孵育对携带分泌 的碱性磷酸酶（SEAP)基因的ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47、PanAdl、PanAd2 和PanAd3转导人293细胞的能力的影响。将中和滴度定义为使在具有病毒、缺乏血清的 阳性对照中观察到的SEAP活性减少50%的血清稀释度。在多个稀释度上（5个4倍递增， 从1/18稀释开始至1 :4608)检测了每种血清样品。样品在37°C预孵育1小时，然后加入 到接种至96孔板的293细胞中（3xl04个细胞/孔）。检测了一组人血清的中和活性。对 Ad5和黑猩猩和倭黑猩猩AdSEAP载体平行检测了相同的组。图6提供了结果。结果显示 对黑猩猩腺病毒的血清阳性率低于人腺病毒Ad5。然而，通常在受试者的子集中可检测到 针对已描述的ChAd(CV-68)的中和抗体的存在。相反地，目前检测的所有人血清不能中和 ChAd55 以及PanAdl、PanAd2 和PanAd3,甚至在极低的滴度上。对ChAd73、ChAd83、ChAdl46 和ChAdl47观察到相同的结果。因此，新腺病毒分离株ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、 ChAdl47以及PanAdl、PanAd2和PanAd3代表了限制基于普通人Ad血清型例如Ad5的病毒 载体的施用的先存抗人Ad免疫力问题的理想解决方案。
[0354] 实施例5 :与Ad5载体相比PanAdl和3载体的免疫效力
[0355] 使用表达单纯疱疹病毒（HSV)抗原的载体和使用表达癌症抗原的载体在BALB/c 小鼠中评估了PanAdl和PanAd3载体作为潜在的重组疫苗的效力。比较了表达HSVAg和 癌症Ag的PanAdl和3的载体效价与基于人Ad5的对应载体。
[0356] 为了评估抗病毒效价，对9组BALB/c小鼠在四头肌内以从107vp/小鼠开始直到 109vp/小鼠的递增载体剂量平行注射PanAdl-HSV、PanAd3-HSV和Ad5-HSV(见图7A)。通过 在与覆盖抗原的全部氨基酸序列的肽库孵育的小鼠脾细胞上的干扰素-yElispot测定来 测量针对HSV抗原引起的免疫应答。在图7中报告的与人Ad5载体比较的PanAdl，PanAd2 和PanAd3的免疫实验结果显示本发明的新腺病毒比现有技术的重组腺病毒Ad5在每个检 测的浓度上均更有效地引起特异性免疫应答。在使用PanAdl和PanAd3载体免疫的小鼠中 观察到的更高频率的抗原特异性T细胞明确证明了这一点。
[0357] 通过对BALB/c小鼠组在四头肌内注射从107vp/小鼠开始直到10\p/小鼠的递增 载体剂量免疫小鼠评估PanAd载体引起抗肿瘤T细胞应答的效力。对2组BALB/C小鼠以 107vp/小鼠和109vp/小鼠注射表达肿瘤抗原的Ad5载体。平行地用107、10s、109vp的携带 相同肿瘤抗原的PanAdl或PanAd3载体免疫3组BALB/C小鼠。通过在脾细胞上使用表示 已定位的⑶8表位的单个肽的干扰素-yElispot测定来测量T细胞应答。图7B中显示的 结果证明与用Ad5载体免疫的动物组相比，用PanAd载体免疫的动物组在最低载体剂量上 应答的动物频率更高和抗原特异性T细胞的频率更高。
[0358] 实施例6 :用PanAd载体免疫食蟹猴
[0359] 采用异源引发/加强方案通过肌肉内注射CsCl纯化的PanAdl和PanAd3免疫2 组猕猴，每组3只。在第0周，组1中的每只动物在三角肌内接受10svp剂量的PanAd3Gag 载体，而组2中的动物接受101(Vp剂量。然后在第13周用101(VpPanAdlGag的单一剂量 加强两组中的所有动物。
[0360] 通过IFN-yELISPOT测定在不同时间点测量CMI。此测定测量HIV抗原特异性 ⑶8+和⑶4+T淋巴细胞应答。制备了基于HIVGag蛋白的氨基酸序列的肽用于这些测定以 测量接种腺病毒载体的猴子中的免疫应答。各个肽具有20-mer的重叠，10个氨基酸的偏 移。
[0361]IFNy-ELISPOT测定提供了抗原特异性T淋巴细胞应答的定量测定。连续稀释 PBMC并将其置于用抗-恒河猴IFN-y抗体（MD-1U-Cytech)包被的微板孔中。它们与HIV Gag肽库一起培养20小时，导致前体细胞的再激发和IFN-y的分泌。洗去细胞，留下在细 胞存在的集中区域中与抗体包被的孔结合的分泌的IFN。用生物素化的抗-恒河猴IFN抗 体（检测AbU-Cytech)和之后用碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素（Pharmingen13043E) 检测捕获的IFN。不可溶的碱性磷酸酶底物的加入导致孔中在细胞存在（located)的位点 处的暗斑，在分泌了IFN-y的每个T细胞上留下一个斑点。
[0362] 每个孔中的斑点数与抗原特异性T细胞的前体频率直接相关。在此测定中选择干 扰素y作为直观的细胞因子（使用特异性抗-干扰素y单克隆抗体），因为它是活化的T 淋巴细胞合成和分泌的最常见的细胞因子和最大量的细胞因子之一。在此测定中，测定了 样品在存在或缺乏（培养基对照）肽抗原时的斑点形成细胞数（SFC)/百万个PBMC。图8 显示了在剂量1后和剂量2后的不同时间点获得的PBMC的来自猕猴的数据。在两种剂量 上用PanAd3引发的所有动物显示了针对HIVGag的T细胞应答，通过PanAdl的第二次注 射的有效加强证明：如六邻体、五邻体和纤维蛋白序列比对已暗示的，PanAdl和PanAd3是 不同的血清型并可以在异源引发-加强免疫方案中组合。因此，在另一个方面，本发明提供 了本发明的2种重组腺病毒在异源引发-加强免疫中的用途，其中本发明的2种重组腺病 毒是不同的腺病毒血清型，最优选如本文描述的PanAdl和PanAd3。
[0363]
【主权项】
1. 一种多核苷酸，其包含： (i) 一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白，并且所述多核苷酸选自： (a) 多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID N0:53中氨基酸序列的多肽；和 (b) 多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQ ID N0:53中氨基酸序列至少85%相同的氨 基酸序列的功能性衍生物； (ii) 一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒六邻体蛋白，并且所述多核苷酸选自： (c) 多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID N0:54中氨基酸序列的多肽；和 (d) 多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQ ID N0:54中氨基酸序列至少95%相同的氨 基酸序列的功能性衍生物；和 (iii) 一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒五邻体蛋白，并且所述多核苷酸选自： (e) 多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID N0:55中氨基酸序列的多肽；和 (f) 多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQ ID N0:55中氨基酸序列至少85%相同的氨 基酸序列的功能性衍生物。2. 根据权利要求1的多核苷酸，其另外包含以下至少一项： (a) 腺病毒5' -端，优选腺病毒5'反向末端重复， (b) 腺病毒Ela区或其选自13S、12S和9S区的片段， (c) 腺病毒Elb区或其选自小T、大T和IX区的片段， (d) 腺病毒E2b区或其选自小pTP、聚合酶和IVa2区的片段， (e) 腺病毒Ll区或其片段，所述片段编码选自28. IkD蛋白、聚合酶、agnoprotein、 52/55kDa蛋白和IIIa蛋白的腺病毒蛋白质； (f) 腺病毒L2区或其片段，所述片段编码选自VII、V和Mu蛋白的腺病毒蛋白质， (g) 腺病毒L3区或其片段，所述片段编码选自VI蛋白和内切蛋白酶的腺病毒蛋白质， (h) 腺病毒E2a区， (i) 腺病毒L4区或其片段，所述片段编码选自IOOkD蛋白、33kD同源物和蛋白质VIII 的腺病毒蛋白质， (j) 腺病毒 E3 区或其选自 E30RF1、E30RF2、E30RF3、E30RF4、E30RF5、E30RF6、E30RF7、 E30RF8 和 E30RF9 的片段， 00腺病毒L5区， (l) 腺病毒 E4 区或其选自 E40RF7、E40RF6、E40RF5、E40RF4、E40RF3、E40RF2 和 E40RF1 的片段，和/或 (m) 腺病毒3' -端，优选腺病毒3'反向末端重复。3. 根据权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下述多 核苷酸：其在全长上与基本上由SEQ ID NO:63组成的序列或由SEQ ID NO:63组成但缺乏 SEQ ID N0:63的基因组区域￡认、￡18、￡2六、￡2843和/或￡4的序列至少90%相同。4. 一种由根据权利要求1的分离的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽，或其功能 性衍生物。5. -种载体，其包含根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸。6. 根据权利要求5的载体，其中所述载体不包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基 因组区域中的基因，和/或包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个 基因，其中所述至少一个基因包含使所述至少一个基因无功能的缺失和/或突变。7. -种重组腺病毒，优选不能复制的腺病毒，其包含根据权利要求1-3中任一项的多 核苷酸和/或至少一种根据权利要求1的分离的多核苷酸（i)、（ii)或（iii)中任一项的 腺病毒衣壳多肽，其中所述重组腺病毒包含用于递送至靶细胞的分子。8. 根据权利要求6的重组腺病毒，其中所述腺病毒在人受试者中具有低于5%的血 清阳性率和优选在人受试者中无血清阳性率，和/或其中所述腺病毒能够感染哺乳动物细 胞。9. 根据权利要求7-8中任一项的重组腺病毒，其中所述用于递送至靶细胞的分子是编 码抗原蛋白或其片段的多核苷酸。10. -种组合物，其包含佐剂和以下（i)至（iv)中至少一项： (i) 根据权利要求4的腺病毒衣壳多肽， (ii) 根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸， (iii) 根据权利要求5-6中任一项的载体， (iv) 根据权利要求7-9中任一项的重组腺病毒， 和任选地，药学上可接受的赋形剂。11. 根据权利要求10的组合物，其中所述佐剂是受体的激动剂，所述受体选自I型细胞 因子受体、II型细胞因子受体、TNF受体、担当转录因子的维生素D受体、以及Toll样受体 I (TLRl)、TLR-2、TLR 3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7 和 TLR9。12. 根据权利要求11的组合物，其中所述佐剂是Toll样受体4或9激动剂。13. -种细胞，其包含以下至少一项： (i) 根据权利要求4的腺病毒衣壳多肽， (ii) 根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸， (iii) 根据权利要求5-6中任一项的载体， (iv) 根据权利要求7-9中任一项的重组腺病毒。14. 根据权利要求13的细胞，其中所述细胞是表达至少一种选自Ela、Elb、E2a、E2b、 E4、LU L2、L3、L4和L5的腺病毒基因的宿主细胞。15. 根据权利要求12的组合物用于疾病的治疗或预防的用途。16. 根据权利要求15的用途，其中所述治疗或预防是接种。17. 根据权利要求15的用途，其中所述治疗是基因治疗。18. -种分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，并且所述多核苷 酸选自： (a) 多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO: 14-19、50和53中任意氨基酸序列的多肽， (b) 多核苷酸，其编码根据SEQ ID NO: 14-19、50和53中任意多肽的功能性衍生物，其 中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和 (c) 多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQ ID NO: 14-19、50和53中任意氨基酸序列至 少85%相同的氨基酸序列的功能性衍生物。19. 一种重组腺病毒，其包含： (i) 由根据SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成的腺病毒纤维蛋白； (ii) 由根据SEQ ID N0:20的氨基酸序列组成的腺病毒六邻体蛋白；和 (iii)根据SEQ ID N0:26的氨基酸序列组成的腺病毒五邻体蛋白； 其中所述腺病毒是由已被保藏且具有保藏号ECACC 08110603的腺病毒衍生的。
【专利摘要】本发明涉及猿腺病毒核酸和氨基酸序列、包含其的载体及其用途。具体地，本发明涉及具有改进的血清阳性率的新腺病毒毒株。在一个方面，本发明涉及腺病毒衣壳蛋白例如六邻体、五邻体和纤维蛋白的分离的多肽及其片段和编码其的多核苷酸。也提供了包含根据本发明的分离的多核苷酸的载体和包含根据本发明的分离的多核苷酸或多肽的腺病毒和包含所述载体、腺病毒、多肽和/或多核苷酸的药物组合物。本发明还涉及分离的多核苷酸、分离的多肽、载体、腺病毒和/或药物组合物用于疾病的治疗或预防的用途。ECACC 0811060120081106
【IPC分类】A61K48/00, C12N15/861, A61K39/235, C12N15/34, C12N5/10, C12N7/01, C07K14/075
【公开号】CN105112428
【申请号】CN201510427025
【发明人】S.科洛卡, A.尼科西亚, R.科尔特塞, V.安门多拉, M.安布罗西奥
【申请人】葛兰素史密斯克莱生物公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2010年2月2日
【公告号】WO2010085984A1