治疗kras相关疾病的有机组合物的制作方法
【专利说明】治疗KRAS相关疾病的有机组合物
[0001] 发明背景
[0002] KRAS是小分子GTP酶的RAS亚族中的一员。它参与细胞信号转导、细胞的生长、 分化、存活以及其它细胞功能。KRAS以及RAS家族成员HRAS和NRAS的过度表达或活性 过高与包括各种癌症在内的多种疾病有关。在约三分之一的全部人类恶性肿瘤中发现了 RAS突变（Bos等人，1989. Cancer Res. 49:4682-4689)。KRAS占了大多数人类恶性肿瘤中 所发现的RAS突变的大部分，包括在肺腺癌中发现的RAS突变的90% (Forbes等人，2006. Br. J. Cancer 94:318-322)〇
[0003] KRAS的突变、活性过高和/或过度表达与癌症有关，包括腺癌、结肠直肠癌（包括 晚期和转移的结肠直肠癌）、结肠癌、肺癌（包括非小细胞肺癌和肺腺癌）、急性髓细胞性 肺癌、膀胱癌、脑癌、乳癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、肾癌、白血病、骨髓增生异常 综合症、髓系白血病、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、心面皮肤 (CFC)综合征和努南综合征，以及类似和相关的疾病。
[0004] 需要与KRAS相关疾病相关的治疗。
[0005] 发明概述
[0006] 本公开涵盖针对KRAS的RNAi (RNA干扰）剂，其可用于治疗KRAS相关疾病，例如 癌症、心面皮肤（CFC)综合征和努南综合征，以及类似和相关的疾病。
[0007] 本公开还涵盖一种治疗患有至少部分由KRAS表达介导的病理状态的人类个体的 方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的针对KRAS的RNAi剂的步骤。
[0008] 该方法还任选地进一步包括施用第二种活性剂的步骤。在一些实施方案中，所述 第二种活性剂是针对KRAS的另一种RNAi剂。在另一些实施方案中，第二种活性剂是另一 种治疗，例如针对另一种也在病理状态中活性过高、突变和/或过度表达的靶点的治疗。
[0009] 本公开提供可用于减少个体（例如哺乳动物，如人）中KRAS水平的特异性RNAi 剂和方法。本公开特别地提供包含KRAS的至少15个到至少19个或更多个连续核苷酸的 双链RNAi剂。具体而言，本公开提供包含与例如表1至6中提供的RNAi剂的那些序列差 异0、1、2或3个核苷酸的15个或更多个连续核苷酸的序列的活性剂。在一个实施方案中， RNAi剂特别可以包含每条链小于30个核苷酸，例如，17至23个核苷酸，15至19个核苷酸， 18至22个核苷酸，和/或19至21个核苷酸，和/或如例如在表1至6中提供的那些，及其 修饰变体和未修饰变体（例如其中的有义链和/或反义链或第一链和/或第二链是修饰的 或未修饰的）。本公开还提供包含有义链和反义链的活性剂，其中所述有义链和/或反义 链包含与例如表1至6中提供的RNAi剂及其修饰变体和未修饰变体的那些序列差异0、1、 2或3个核苷酸的19个或更多个连续核苷酸的序列。有义链和反义链可以是连续的，或共 价结合，例如，借助环或接头共价结合。在一个实施方案中，RNAi剂特别可以包含每条链小 于30个核苷酸，例如，17至23个核苷酸，18至22个核苷酸和/或19至21个核苷酸，和/ 或如例如在表1至6中提供的序列。
[0010] 双链RNAi剂可以具有0、1或2个平末端，和/或从一个末端或3'末端和/或5' 末端具有含1、2、3个或4个核苷酸（即，1至4个核苷酸）的突出端。双链RNAi剂也可以 任选地包含一个或两个3'帽结构和/或一个或多个修饰的核苷酸。本文所提供的序列的 修饰变体包括那些除了天然核苷酸被相应的修饰的核苷酸置换外其它均相同的变体。
[0011] 此外，RNAi剂可以仅包含天然的核苷酸亚单位（例如核糖核苷酸），或包含针对一 个或多个替换核苷酸亚单位的糖、磷酸酯或碱基的一个或多个修饰，无论它们是否包含核 糖核苷酸亚单位或脱氧核糖核苷酸亚单位或其它相关的修饰变体。在一个实施方案中，公 开的RNAi剂的修饰变体具有替换尿苷的胸苷（作为RNA，或优选地，DNA)，或具有肌苷碱基。 在一些实施方案中，公开的RNAi剂的修饰变体可以具有位于过客链中的切口、引导链与过 客链之间的错配、替代引导链和过客链的一部分（例如种子区）中的RNA的DNA、和/或缩 短的过客链（例如15、16、17或18个核苷酸）。一旦确定了功能性引导链，就可以容易地制 备RNAi剂的修饰和变体。任何不相互排斥的修饰的组合均是可行的（例如碱基修饰与缩 短的过客链的组合；有切口的过客链与碱基修饰的组合；或DNA替代部分或全部种子区与 剩余RNA的碱基修饰的组合等）。
[0012] 在一个实施方案中，公开的RNAi剂的修饰变体包括具有与表1至6中所公开的序 列相同的序列（例如，相同碱基序列）、但是具有针对一个或多个核苷酸亚基的糖或磷酸酯 中一者或多者的一个或多个修饰的RNAi剂。在一个实施方案中，所述修饰改善RNAi剂的 功效、稳定性（例如，针对血清和/或肠液中的核酸酶）和/或降低免疫原性。本公开的一 个方面涉及包含至少一个非天然核碱基的双链寡核苷酸。在某些实施方案中，非天然核碱 基是二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。在一个特定实施方案中，非天然 核碱基是二氟甲苯基。在某些实施方案中，两条寡核苷酸链中仅一条链含有非天然核碱基。 在某些实施方案中，两条寡核苷酸链均含有非天然核碱基。
[0013] RNAi剂可以任选地连接至被选择用来改善RNAi剂的一种或多种特征，例如，稳定 性、分布和/或细胞摄入的配体，例如胆固醇或其衍生物。RNAi剂可以是分离的或是用于本 文所述方法的药物组合物的一部分。特别地，药物组合物可以被配制成用于向特定的组织 (例如，KRAS-相关疾病的患病组织）递送或配制成用于胃肠外给药。药物组合物可以任选 地包含两种或更多种RNAi剂，每一种涉及KRAS mRNA的相同或不同区段。任选地，药物组 合物还可以包含用于任何KRAS相关疾病的任何已知治疗或与其联合使用。
[0014] 本公开还提供了用于降低细胞中KRAS mRNA水平的方法，特别是在以KRAS过度表 达或活性过高为特征的疾病情况下。包含KRAS的改变例如突变、过度表达和/或活性过高 的细胞被称为"KRAS缺陷型"细胞。所述方法包括向细胞施用一种或多种本公开的RNAi剂 的步骤，如下文进一步所述。本发明的方法利用参与RNA干扰的细胞机制来选择性地降解 细胞中的靶RNA，并且包括使细胞与本公开的一种或多种RNAi剂接触的步骤。
[0015] 本公开还提供了用于降低细胞中KRAS mRNA水平的方法，特别是在以KRAS过度表 达、突变或活性过高为特征的疾病情况下。所述方法包括向细胞施用一种或多种本公开的 RNAi剂的步骤，如下文进一步所述。本发明的方法利用参与RNA干扰的细胞机制来选择性 地降解细胞中的靶RNA，并且包括使细胞与本公开的一种或多种RNAi剂接触的步骤。
[0016] 本公开还涵盖一种治疗患有至少部分由KRAS表达介导的病理状态的人类个体的 方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的靶向KRAS的RNAi剂的步骤。额外的方法 涉及预防、治疗、调节和/或改善其中疾病的进展（例如，肿瘤生长）需要KRAS (虽然KRAS 未扩增、过度表达或错误定位）的病理状态。所述方法包括向个体施用一种或多种本公开 的RNAi剂的步骤，如下文进一步所述。本发明的方法利用参与RNA干扰的细胞机制来选择 性地降解细胞中的靶RNA，并且包括使细胞与本公开的一种或多种RNAi剂接触的步骤。所 述方法可以对细胞直接进行，或者可以通过向个体施用本公开的一种或多种RNAi剂/药物 组合物而对哺乳动物个体进行。减少细胞中的靶KRAS RNA导致所产生的编码的KRAS蛋白 的量减少。在生物体中，这可以导致恢复涉及KRAS的途径中的平衡、和/或阻止KRAS积累、 和/或降低KRAS活性和/或表达、和/或阻止KRAS介导的其它基因激活、和/或改善、治 疗和/或预防KRAS相关疾病。在一个实施方案中，KRAS表达、水平或活性的降低可以限制 肿瘤生长。
[0017] 本公开的方法和组合物，例如，该方法和KRAS RNAi剂组合物，可以以本文所述的 或本领域已知的任何适宜剂量和/或制剂、以本文所述的或本领域已知的任何适宜的施用 途径使用。
[0018] 在附图和下文描述中阐述本公开的一个或多个实施方案的详细内容。多种实施方 案的不相互排斥的要素（例如，RNAi剂的序列、修饰、末端帽结构、组合、涉及KRAS RNAi剂 和另一种活性剂的组合疗法等）可以彼此组合，其如本文所述并且是本领域已知的或被开 发的。例如，本文中公开的任何RNAi剂序列可以与本文中公开的任何修饰或末端帽结构的 集合相组合。修饰、5'末端帽结构和/或3'末端帽结构的任何组合可以随本文中公开的任 何RNAi剂序列一起使用。本文中公开的任何RNAi剂（具有修饰或末端帽结构的任何组合 或者不具有修饰或末端帽结构）可以与本文中公开的任何其它RNAi剂或其它治疗组合物 或方法组合。
[0019] 从本说明书、附图和权利要求书中可以明显看出本公开的其它特征、目的和优点。
[0020] 附图简述
[0021] 图1显示各种修饰的核苷酸：可以在本文中公开的RNAi剂中使用的U002、U003、 U004、U005、C004、C005、A004、A005、G005 和 G004。U002 表示作为 DNA 的 2' -脱氧胸苷。 U003表示2' -脱氧尿苷。U004表示具有带2' -O-甲基修饰的尿苷（"U"）碱基的核苷酸。 U005表示带2' -O-甲氧基乙基（MOE)修饰的U碱基。C004表示带2' -O-甲基修饰的半胱 氨酸（"C"）碱基。C005表示带2' -0-甲氧基乙基修饰的C碱基。A004表示带2' -0-甲 基修饰的腺苷（"A"）碱基。A005表示带2' -0-甲氧基乙基修饰的A碱基。G005表示带 2' 0-甲基修饰的鸟苷（"G"）碱基。G004表示带2' 0-甲基修饰的G碱基。
[0022] 发明详述
[0023] 本公开涵盖用于靶向和抑制KRAS基因的针对KRAS的RNAi剂，所述RNAi剂