用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状 及其用途，更具体地涉及从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，包括将多 孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙 的步骤；在生物样品中扩增靶序列的方法，包括直接添加多孔性固体状，或者执行逆转录酶 反应之后，作为用于核酸扩增反应的模具来扩增靶序列的步骤，其中，上述多孔性固体状为 通过将多孔性固体状接触于生物样品而使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固 体状的空隙的多孔性固体状；利用上述在生物样品中扩增靶序列的方法的在生物样品内迅 速确认是否存在靶序列的方法；用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的试剂 盒及组合物，包括多孔性固体状，其能够使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固 体状的空隙。
【背景技术】
[0002] 在检测动植物发病病原体的方法中，最常见的就是检测病原体的固有蛋白质的血 清学诊断方法和检测核酸的分子生物学诊断方法。在分子生物学诊断方法中，最常用的方 法就是聚合酶链反应（PCR, polymerase chain reaction)方法，它具有检测灵敏度高、任何 人都可以方便使用的优点。为了执行PCR，首先应从对象组织中提取作为模具来利用的基 因体。目前，DNA的提取方法有，使用苯酚/三氯甲烷的方法、盐析方法、使用离液序列高的 盐及二氧化硅树脂的方法、使用亲和性树脂的方法、离子交换色谱法及使用磁珠的方法等。 这些方法记载于美国专利第5057426号、第4923978号、EP专利第0512767A1号及EP第 0515484B号、WO第95/13368号、WO第97/10331号及WO第96/18731号等。这些专利中的 记载内容涉及使核酸吸收至固体支撑体之后从中分离（isolation)核酸的方法。根据以往 使用的方法，为了分离核酸而使用恒定类型的溶剂。
[0003] 利用PCR来扩增DNA或RNA模具中的靶部位的方法可应用于DNA分子标记、探针 制作、cDNA及基因组组DNA文库制作、病原体检测等各种领域。例如，在对病原体的基因体 进行扩增的情况下，可通过标的产物的扩增与否来轻松判断检体内是否存在病原体。在用 于病原体诊断的情况下，PCR的特异性和检测灵敏度非常高，但很难实现一次性检查大量试 料。这是由于如需从各种检体迅速分离PCR模具，仍需要消耗大量时间和费用。已报告有很 多可从各种组织分离出DNA或RNA的多种方法，还有将血迹、头发、上皮细胞、叶片作为对象 煮沸的方法、氢氧化钠（NaOH)处理VC-捕获、热提取、微波炉提取、氢氧化钠（NaOH)提取等 方法，可使得PCR尽可能轻松地获取到基因体。但是，这些方法的基因体提取效率不均一， PCR的再现性低。若不阻碍PCR技法所具有的高特异性和检测灵敏度的前提下可从各种检 体轻松地大量提取到PCR模具用生物分子，则PCR的应用性将远远高于目前的水平，这是显 而易见的。
[0004] -方面，韩国授权专利第2005-0088164号中公开了核酸分离方法，日本授权专利 第2007-506404号中公开了用于迅速检测核酸分子的方法，但并未揭示本发明的利用多孔 性固体状来从生物样品中迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明是鉴于如上所述的需求而提出的，本发明人将感染黄瓜花叶病毒 (cucumber mosaic virus)的辣椒叶作为生物样品，利用金属引脚V的后方扁平部分施压， 使得作为多孔性固体状的氧化物材质的多孔性陶瓷立方体与上述生物样品相接触，并使得 存在于辣椒试料内的RNA、gDNA及病毒粒子吸收至多孔性陶瓷立方体的空隙之后，针对被 吸收的生物分子不实施利用单独溶剂的洗脱过程，而直接将多孔性陶瓷立方体作为模具放 入PCR管，以黄瓜花叶病毒特异性引物扩增结果，可知其为感染黄瓜花叶病毒的辣椒。由 此可知，将上述方法适用于精制的黄瓜花叶病毒粒子、感染黄瓜花叶病毒的全部RNA、精制 的辣椒基因组DNA，根据陶瓷立方体的材质和制备温度，可有效地吸收上述基因体，并用于 PCR和cDNA合成。并且，利用本发明的低温共烧陶瓷立方体，将从烟叶分离的核酸作为模 具，成功的执行了多重逆转录PCR和以大肠菌为对象的细菌人工染色体（BAC)质粒扩增。
[0006] 由此，本发明能够通过迅速分离存在于生物样品内的生物分子，来迅速诊断出是 否存在靶序列，从而完成本发明。
[0007] 为了解决上述问题，本发明提供从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的 方法，该方法包括将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收 至多孔性固体状的空隙的步骤。
[0008] 并且，本发明提供在生物样品中扩增靶序列的方法及利用上述方法在生物样品内 迅速确认是否存在靶序列的方法，上述在生物样品中扩增靶序列的方法包括直接添加多孔 性固体状，或者执行CDNA合成所需逆转录酶反应之后，作为用于核酸扩增反应的模具来扩 增靶序列的步骤，其中，上述多孔性固体状为通过将多孔性固体状接触于生物样品而使存 在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙的多孔性固体状。
[0009] 并且，本发明提供在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒，该试 剂盒包括多孔性固体状，能够使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空 隙。
[0010] 并且，本发明提供用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的试剂盒及 组合物，该试剂盒及组合物包括多孔性固体状，其能够使存在于生物样品内的生物分子吸 收至多孔性固体状的空隙。
[0011] 本发明通过迅速分离存在于生物样品内的生物分子，可迅速诊断出是否存在靶序 列，其将易于迅速准确地判别对象基因组DNA扩增、CDNA合成、病原体感染与否等。
【附图说明】
[0012] 图1表示利用多孔性陶瓷立方体的基因体吸附和作为逆转录PCR/PCR模具的应用 模式图。A :多孔性陶瓷立方体；B :多孔性陶瓷立方体的放大图，通过改变材料和制备温度， 使得1立方毫米（Imm3)的立方体表面的空隙大小发生变化，进而制备14种立方体；C :将1 个立方体放在植物体叶子上，利用引脚V后面向立方体施压，破碎组织，使得基因体吸收至 立方体的空隙；D :将吸收基因体的1个立方体作为逆转录PCR或PCR的模具使用；E :在琼 脂糖凝胶中确认PCR产物。
[0013] 图2表示利用陶瓷切片从生物样品分离出核酸扩增反应所需的DNA/RNA模具的 结果。A :用于制备约Imm3大小的陶瓷碎片的陶瓷切片（1?8)，6表示陶瓷切片5的箭头 部位；B :将8种类型的陶瓷碎片放在甜椒（Capsicum annuum)CM334辣椒叶，利用引脚V施 压之后，将其作为PCR模具来使用，以Tscar引物执行PCR的结果；C :以从A获得的8种 类型陶瓷碎片吸收从CM334辣椒叶中精制的gDNA (lug/μ 1)，将其作为PCR模具来使用， 以Tscar引物执行PCR的结果，Lane M ;lkb DNALadder，Lane PC ;从CM334辣椒叶精制的 gDNA (lug/ μ I) 1 μ 1作为PCR模具来使用；D :借助逆转录PCR的番茄花叶病毒病（TSWV)检 测，Lane M ;Ikb DNALadder，Lane NC ;从健全的黄花烟草（Nicotiana rustica)烟叶分离 的总RNAl μ 1作为逆转录反应模具来使用，Lane PC ;从人工感染番茄花叶病毒病的烟叶中 分离的总RNAl μ 1作为逆转录反应模具来使用，Lane 1?8 ;将8种的陶瓷碎片向感染番茄 花叶病毒病的黄花烟（N. rustica)烟叶施压，使吸收生物分子（其中，病毒粒子或RNA)之 后，将其作为逆转录反应模具来使用，箭头表示预计的PCR产物的大小。
[0014] 图3为基因组DNA扩增最佳的图2A的4的陶瓷碎片⑷和以各个氧化物材质制 备的多孔性陶瓷立方体的表面的扫描电子显微镜（SEM)放大图。图片均为1万倍放大图， 根据材料和制备温度的不同，表面形态、空隙大小和数量均有差异。1?14 :按顺序记录于 表1的材料，bar :1 μ m。
[0015] 图4为利用以各个氧化物材质制备的多孔性陶瓷立方体，从辣椒叶中分离黄瓜花 叶病毒RNA及基因组DNA来执行逆转录PCR/PCR的结果。
[0016] A :以黄瓜花叶病病毒（cucumber mosaic virus，黄瓜花叶病毒）总RNA作为对象 执行逆转录PCR的结果；B :以从辣椒叶中精制的基因组DNA作为对象执行PCR的结果，Lane M: Ikb DNALadder，Lane PC :在A中，将从感染黄瓜花叶病毒的辣椒叶中分离的总RNAl μ 1 作为逆转录PCR模具来使用。Lane 1?14 :按顺序记录于表1的材料。在B中，将从CM334 辣椒中分离的基因组DNAl μ 1作为PCR模具来使用。
[0017] 图5为利用以各个氧化物材质制备的多孔性陶瓷立方体，以感染黄瓜花叶病毒的 辣椒叶及精制的黄瓜花叶病毒粒子作为对象来调查生物分子的吸收率的结果。A :黄瓜花叶 病毒感染辣椒叶，B :精制的黄瓜花叶病毒（Lane PCl :将感染黄瓜花叶病毒的CM334的总 RNAl μ 1作为模具来使用。Lane PC2:将感染黄瓜花叶病毒的烟草细菌人工染色体（BAC) cum Xanthi-nc的总RNAl μ 1作为模具来使用）。Lane 1?14 :按顺序记录于表1的材料。
[0018] 图6为以辣椒叶为对象并利用在本发明中制备的各种多孔性陶瓷立方体来分析 DNA扩增效率的结果。Lane M:lk