用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状及其用图_2

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b DNALadder,Lane 1?14 :按顺序记录于表1的材料, Lane PC :将精制的gDNAl μ 1作为模具来使用。
[0019] 图7为本发明的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体制备温度对PCR扩增产生影 响的分析结果。Lane M:lkb DNALadder,Lane PC:将精制的gDNAlyl作为模具来使用, Lane 30?34 :30 (低温共烧陶瓷,650°C ),31 (低温共烧陶瓷,700°C ),32 (低温共烧陶瓷, 750°C ),33 (低温共烧陶瓷,800°C ),34 (低温共烧陶瓷,850°C )。
[0020] 图8表示根据制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体的表面(A?E)和内部 (F?J)剖面。A?J :10, 000倍观察的扫描电子显微镜(SEM)图片。30?34 :30 (低温共 烧陶瓷,650°C ),31(低温共烧陶瓷,700°C ),32(低温共烧陶瓷,750°C ),33(低温共烧陶 瓷,800°C ),34 (低温共烧陶瓷,850°C )。
[0021] 图9为根据制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷的物质吸收能力和过滤能力的 调查结果。分别利用500倍扫描电子显微镜(SEM)和250倍透射电子显微镜(TEM)观察 立方体的表面(A?E)和内部(F?J)剖面,调查金纳米粒子和聚苯乙烯粒子的混合液分 布。30?34 :30(低温共烧陶瓷,650°C ),31(低温共烧陶瓷,700°C ),32(低温共烧陶瓷, 750°C ),33 (低温共烧陶瓷,800°C ),34 (低温共烧陶瓷,850°C )。
[0022] 图10为根据制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷的物质吸收能力和过滤能力的 调查结果。
[0023] 洗脱吸收至低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体的内部的金纳米粒子及聚苯乙烯粒 子之后,利用3500倍透射电子显微镜(TEM)调查其分布。33 (低温共烧陶瓷,800°C ),34 (低 温共烧陶瓷,850°C )。
[0024] 图11为立方体表面的特性对PCR产物扩增效率产生的影响的调查结果。A?C : 以1000倍拍摄的扫描电子显微镜(SEM)图片。A、33(低温共烧陶瓷,800°C)立方体,不 研磨;B、33,研磨 48 小时;C、33,研磨 72 小时。D 与 E :Lane M,Ikb DNA(DNA)Ladder ;Lane PC,将精制的基因组DNA (gDNA) 1 μ 1作为模具来使用;Lane 39, 33(低温共烧陶瓷,800°C ) 立方体,不研磨;Lane 41,33,研磨48小时;Lane 42,33,研磨72小时。使用引物10(D)和 146 (E)〇
[0025] 图12为将利用本发明的低温共烧陶瓷立方体而从烟叶分离的生物分子作为模具 的多重(multiplex)逆转录PCR结果。Lane M :lkb DNALadder,Lane 1?3为分别是黄瓜 花叶病毒(473bp)、三叶草黄脉病毒(CIYVV) (806bp)、黄瓜花叶病毒(473bp)+三叶草黄脉 病毒(806bp)的逆转录PCR产物。
[0026] 图13为利用本发明的低温共烧陶瓷立方体并以大肠菌为对象的细菌人工染色体 (BAC)质粒扩增结果。Lane M :lkb DNALadder,Lane 1?4将大肠菌培养液1 μ 1、2 μ 1、 3 μ 1、4 μ 1作为模具来使用。5?8分别放入使吸收大肠菌的多孔性陶瓷立方体(8,低温共 烧陶瓷,850°C) -个、两个、三个、四个并作为模具来使用。聚合酶链条厚度保持恒定,即, 大肠菌被均匀地吸收,吸收至1个立方体的模具与4个的情况并无差别。此时,当提高引物 浓度时,相比于聚合酶链条为1个的情况,使用4个时明显变厚。1?4表示大肠菌培养液 的粘度高而导致无法恒定地添加的结果。
[0027] 图14表示为了使吸收生物分子而可利用的多孔性陶瓷的形态。
[0028] A ;单一的简单结构(矩形、圆形等),B ;为了提高材料吸收率,在单一简单结构的 内部形成孔状空间的结构,C ;表面气孔尺寸及相互不同的材料整合的结构,D ;密度不同的 双重结构(左侧)及内部包含空隙的结构(右侧)
【具体实施方式】
[0029] 为了实现本发明的目的,本发明提供从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分 子的方法,该方法包括将多孔性固体状接触于生物样品,使存在于生物样品内的生物分子 吸收至多孔性固体状的空隙的步骤。
[0030] 在本发明的一实现例的方法中,上述生物样品可源于动物、植物、细菌或霉菌,优 选地,可源于植物或动物,但不受此限定。
[0031] 在本发明中,作为将多孔性固体状接触于生物样品的方法,在生物样品的形态为 液状的情况下,上述方法表示通过单纯接触来引导向多孔性固体状的吸收的方法,在生物 样品的形态为固体状的情况下,上述方法表示利用引脚V扎入多孔性固体状而导致细胞被 破坏时产生的生物分子的吸收方法,但上述方法不受此限定。
[0032] 在本发明的一实现例的方法中,上述生物分子可以是DNA、RNA、dsRNA、microRNA、 类病毒(viroid)、病毒、细菌、霉菌或微藻类,优选地,可以是DNA或RNA,但不受此限定。
[0033] 关于本发明的生物分子,在动物的情况下,可以从各种来源(source)获取,例如 肌肉、表皮、血液、骨头、脏器,最优选地,可以从肌肉或血液中获取,但不受此限定。在植物 的情况下,可以从各种部位提取物中获取,例如叶、花、茎、根、果、种,最优选地,可以从叶、 种或花中获取,但不受此限定。在微生物的情况下,可以从菌种、菌丝或分泌物(ooze)获 取,最优选地,可以从它们集中栖息的地方(病变发生部位)中获取,但不受此限定。在病 毒、细菌、霉菌或微藻类的情况下,通过使合理调整空隙大小的多孔性固体状接触,使得它 们的部分粒子或全部细胞吸收至空隙内,并将其作为模具促使PCR,在PCR步骤中的高温改 性步骤(约94?96°C )中,由于组织破坏,可释放内部的核酸,进而可以分析对象遗传基 因。
[0034] 本发明的生物分子不仅可以包括作为核酸分子的基本构成单位的核苷酸,还可以 包括核苷酸的盐基变形的类似物(analogue)。
[0035] 在通过本发明的方法分离的生物分子为gDNA的情况下,可以使陶瓷棒前端接触 生物样品来进行吸附。在先驱体为mRNA的情况下,使陶瓷棒前端接触生物样品,将吸附于 前端的总RNA作为模具并利用逆转录酶,合成至cDNA。由于上述总RNA是从植物或动物细 胞中分离的,因此,mRNA的末端具有多聚腺苷酸尾,利用这种序列特性的OligodT引物及逆 转录酶,可容易合成cDNA。并且,在病毒的情况下,若有多聚腺苷酸尾,cDNA,而如若烟草花 叶病毒没有多聚腺苷酸尾,则根据本发明所属行业公开的各种方法,利用特异性下游引物 (antisense primer),向对象核糖核酸(RNA)合成 cDNA。
[0036] 在本发明的方法中,上述少量的生物分子可应用于可作为模具的本发明所属 行业公开的各种方法。例如,可应用于本发明的技术包括CAPS或SCAR分子标记、使用 焚光标记的HRM、实时PCR、嵌套(Nested) PCR、免疫捕捉(immunocapture) PCR、同时用 于各种病原体检测的多重(Mutiplex)PCR、直接性DNA序列决定、单链构象分析(SSCA, Orita et al.,PNAS,USA 86:2776(1989))、RNase 保护分析(Finkelstein et al., Genomics,7:167 (1990))、改性梯度凝胶电泳(DGGE,Wartell et al.,Nucl. Acids Res., 18:2699(1990))、利用可识别核苷酸失配的蛋白质(例如:E. coli的mutS蛋白质)的方法 (Modrich,Ann. Rev. Genet. ,25:229-253(1991))、对立型特异 PCR,但不受此限定。
[0037] 在适用核酸扩增技术的情况下,为了本发明的病毒检测,如何设计合适的引物很 重要。但是,相比于在相同管中执行逆转录反应(RT)及PCR的情况,在分别于不同的管中 执行逆转录反应和PCR的情况下,更能够增加模具的扩增量,进而提高病毒检定结果的可 靠性。在本发明的优选实现例中,本发明提供一种以与吸收至陶瓷块的核苷酸相匹配的方 式设计的利用基因分型(genotyping)引物来分析组织内是否存在病毒的方法。
[0038] 通过本发明的核酸扩增可用于DNA分子标记制作、探针制作、cDNA及基因组DNA文 库制作、病原体检定等,但不受此限定。
[0039] 在本发明的一实现例的方法中,上述核酸扩增反应有cDNA合成、聚合酶链反应 (PCR)、多重(muliplex)PCR、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、连接酶链反应(ligase chain reaction)、基于核算序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification)、基于 转录的扩增系统(transcription-based amplification system)、链置换扩增(strand displacement amplification)或通过Q0复制酶(replicase)的扩增或本发明所属行业 公开的用于扩增核酸分子的任何其它合适的方法。在上述内容中,PCR是指利用聚合酶从 以特异性方式结合于对象核酸的引物对来扩增目标核酸的方法。这种PCR方法已被本发明 所属行业公开,还可利用商用试剂盒。
[0040] 在本发明的一实现例的方法中,上述多孔性固体状可以是碳化纤维素类、粒子状 纸团、天然沸石或合成沸石、聚苯乙
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