TTGACCCGAACA :序列号 2)0. 5 μ l、rTaq-Mix 4 μ 1、DW 15 μ 1 构成，PCR产物在94°C 条件下实施3分钟改性过程，然后，在（94°C /30秒钟、59°C /30秒钟、72°C /60秒钟）条件 下扩增35次，使反应72°C /5分钟之后，在包含EtBr的1 %琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认 是否存在对象PCR产物的扩增。
[0076] 其结果，如图2B所示，在陶瓷碎片4、5、6中，可知PCR产物得到扩增。使用电子显 微镜观察基因组DNA的扩增最佳的陶瓷碎片4的表面，可知陶瓷内的空隙以各种不同的大 小分布（图3的A)。但是，在无法一致地调节陶瓷碎片的表面或面积的情况下，难以明确区 分陶瓷碎片的类型和PCR产物扩增效率。
[0077] 因此，为了确认每个陶瓷碎片对辣椒的gDNA的吸收程度以及实际上是否可适用 于PCR，以精制的CM334gDNA(lug/ μ 1)替代叶子来用作材料。
[0078] 向塑料培养皿的表面滴落精制的gDNA，每次滴落1 μ 1，接着，以各个陶瓷碎片吸 收gDNA，将其用作PCR用模具。如图2C所示，可知如同将1 μ 1的CM334gDNA作为模具来使 用的阳性对照区（PC)，相同大小的PCR产物在所有处理区均得到扩增，它们的浓度之间有 所差异，而这应该是由于所使用的陶瓷碎片的大小或表面积不均匀所致。一方面，吸收gDNA 的上述陶瓷碎片可用作PCR扩增用模具，对此，调查了它们能否用于植物病毒诊断。利用 QIAGEN RNeasy Mini Kit，为了精制阴性对照区用RNA和阳性对照区用RNA，从未感染病毒 的健全的黄花烟草烟叶（NC用）和人工感染番茄花叶病毒病（TSWV)的黄花烟草烟叶（PC 用）分离全部RNA，并将其用作逆转录反应用模具。在感染番茄花叶病毒病的烟叶上放置各 个陶瓷碎片，使用引脚V下压，使得吸收RNA或病毒粒子，向添加有IOpmol下游引物TSNCP R(5' -TCAAGCAAGTTCTGCGAGTT-3' ：序列号 3)0. 5 μ 1 的逆转录反应用 RT-预混料（reverse transcription master premix，ELPIS-Biotech，Korea)，每管各添加一个陶瓷碎片。在 42°C条件下执行1小时的逆转录反应之后，将1 μ 1反应液用作PCR用模具。PCR预混料 由 IOpmol 上游引物（Tsca-F AAACGCCATCATTCGTTTTC :序列号 4)0. 5 μ IUOpmol 下游引物 94°C条件下实施3分钟改性过程，然后，在（94°C /30秒钟、59°C /30秒钟、72°C /60秒钟） 条件下扩增35次，使反应72°C /5分钟之后，在包含EtBr的1 %琼脂糖凝胶上进行电泳，来 确认是否存在对象PCR产物（777bp)的扩增。如图2D所示，除了 4号和6号的陶瓷碎片之 外的剩余陶瓷碎片处理区中确认了预计的逆转录PCR产物成功得到扩增。这意味着仅以吸 收至陶瓷碎片的番茄花叶病毒RNA或番茄花叶病毒粒子也可以实现番茄花叶病毒检定，相 比于如图2B所示的gDNA，在逆转录PCR中PCR产物实现了更好的扩增，是由于通过逆转录 反应生成了更多的PCR模具。根据以上结果，可判断出若按照恒定大小制备陶瓷碎片并将 其用于吸收生物分子，则可以实现更优秀的结果。
[0079] 实施例3.根据氧化物材质的多孔性陶瓷立方体的种类的生物分子的吸收率调查
[0080] 图3表示以表1中记载的氧化物为主要成分制备的各个多孔性陶瓷立方体的表面 的扫描电子显微镜（SEM)放大图。由于根据陶瓷主要成分和制备温度，表面和空隙的大小 会不同，因此，为了提高对象生物分子的吸收率，应制备成具有陶瓷立方体的最优化空隙的 大小及数量后投入使用。
[0081] 表 1 [表 1]
[0082]
[0083]
【主权项】
1. 一种从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其中，包括将多孔性固 体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙的步 骤。
2. 根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其 中，上述生物样品源于动物、植物、细菌或霉菌。
3. 根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其 中，上述生物分子为DNA、RNA、dsRNA、microRNA、类病毒、病毒、细菌、霉菌或微藻类。
4. 根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其 中，上述核酸扩增反应为cDNA合成、PCR、多重PCR或逆转录-PCR。
5. 根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其 中，上述多孔性固体状为选自由碳化纤维素类、粒子状纸团、天然沸石或合成沸石、聚苯乙 烯、聚碳酸酯、聚丙烯、多孔性金属粒子、多孔性橡胶、以粒子状玻璃纤维团形成的微孔玻 璃、石灰、贝壳、陶瓷切片及氧化物材质的陶瓷组成的组中的至少一种。
6. 根据权利要求5所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其 中，上述氧化物材质的陶瓷的主要成分为三氧化二铝、三氧化二铁、低温共烧陶瓷、氧化铅 或氧化锌。
7. 根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其 中，上述多孔性固体状呈正方体、长方体、球形、圆柱形、条形、条的一侧末端具有槽的条形 或端部尖锐的条形。
8. -种在生物样品中扩增靶序列的方法，其中，包括： 步骤（a)，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多 孔性固体状的空隙；以及 步骤（b)，将步骤（a)的使吸收生物分子的多孔性固体状作为用于核酸扩增反应的模 具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列。
9. 根据权利要求8所述的在生物样品中扩增靶序列的方法，其中，上述核酸扩增反应 为 PCR〇
10. -种在生物样品中扩增靶序列的方法，其中，包括： 步骤（a)，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多 孔性固体状的空隙； 步骤（b)，向步骤（a)的使吸收生物分子的多孔性固体状添加逆转录酶，来执行逆转录 酶反应；以及 步骤（c)，将上述逆转录酶反应物作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引 物组执行扩增反应，来扩增靶序列。
11. 一种在生物样品内迅速确认是否存在革E1序列的方法，其中，包括： 步骤（a)，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多 孔性固体状的空隙； 步骤（b)，将步骤（a)的使吸收生物分子的多孔性固体状作为用于核酸扩增反应的模 具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列；以及 步骤（c)，检测上述扩增产物。
12. -种在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法，其中，包括： 步骤（a)，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多 孔性固体状的空隙； 步骤（b)，向步骤（a)的使吸收生物分子的多孔性固体状添加逆转录酶，来执行逆转录 酶反应； 步骤（c)，将上述逆转录酶反应物作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引 物组执行扩增反应，来扩增靶序列；以及 步骤（d)，检测上述扩增产物。
13. -种在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒，其中，包括： 多孔性固体状，能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空 隙； 目标引物组；以及 试剂，用于执行扩增反应。
14. 根据权利要求13所述的在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒， 其中，用于执行上述扩增反应的试剂包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs及缓冲溶液。
15. 根据权利要求13所述的在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒， 其中，上述多孔性固体状为选自由碳化纤维素类、粒子状纸团、天然沸石或合成沸石、聚苯 乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、多孔性金属粒子、多孔性橡胶、以粒子状玻璃纤维团形成的微孔玻 璃、石灰、贝壳、陶瓷切片及氧化物材质的陶瓷组成的组中的至少一种。
16. -种用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的试剂盒，其中，包括多孔 性固体状，其能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙。
17. -种用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的组合物，其中，包括多孔 性固体状，其能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙。
18. 根据权利要求17所述的用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的组 合物，其中，上述多孔性固体状为选自由碳化纤维素类、粒子状纸团、天然沸石或合成沸石、 聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、多孔性金属粒子、多孔性橡胶、以粒子状玻璃纤维团形成的微 孔玻璃、石灰、贝壳、陶瓷切片及氧化物材质的陶瓷组成的组中的至少一种。
【专利摘要】本发明提供一种利用可使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至空隙的多孔性固体状，来从生物样品迅速地分离核酸扩增反应用生物分子并将其扩增，进而在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法。
【IPC分类】C12N15-10, C12Q1-68, C12N11-02
【公开号】CN104583397
【申请号】CN201380044466
【发明人】朴旲浩, 申埈盛, 韩定宪, 印金淑, 崔洪秀, 金政洙
【申请人】生物立方体系统有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年8月20日
【公告号】EP2891716A1, US20150252356, WO2014035090A1