用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状及其用图_3

文档序号:8268818阅读:来源:国知局
稀(polystylene)、聚碳酸醋(polycarbonate)、聚丙稀 (polyprophylene)、多孔性金属粒子、多孔性橡胶、以粒子状玻璃纤维团形成的微孔玻璃、 石灰、贝壳、陶瓷切片或氧化物材质的陶瓷,优选地,可以是氧化物材质的陶瓷,但不受此限 定。
[0041] 在本发明的一实现例的方法中,上述氧化物材质的陶瓷可以是三氧化二铝 (Al2O 3)、三氧化二铁(Fe2O3)、低温共烧陶瓷(Low temperature c〇-fired ceramic)、以氧化 铅(PbO)或氧化锌(ZnO)为主要成分制备的陶瓷,但不受此限定。
[0042] 在本发明的一实现例的方法中,上述多孔性固体状可以是正方体、长方体、球形、 圆柱形、条形(bar type)、条的一侧末端具有槽的条形或端部尖锐的条形、条的一侧末端具 有槽并且端部尖锐的条形或者条的一侧末端具有槽且端部尖锐且尖锐端部一侧的内部具 有大空隙的条形,但不受此限定。
[0043] 作为本发明的多孔性固体状,在使用氧化物材质的陶瓷的情况下,可调节其空隙 的大小,在使用相同氧化物材质来制备多孔性陶瓷的情况下,可以根据制备温度来调节空 隙的大小及空隙的数量,根据对象生物分子的类型来利用最优化的多孔性陶瓷,可有效地 执行PCR或逆转录PCR。这种多孔性陶瓷的空隙的大小可合理地调节多孔性固体状的大小, 使得在对象生物样品中选择性地吸收目标生物分子。并且,对于上述氧化物材质的陶瓷的 外形大小,只要能够轻易地进入PCR用管中,对此不做特殊限制,例如,可以是1mm 3,但不受 此限定。
[0044] 并且,本发明提供在生物样品中扩增靶序列的方法,该方法包括如下步骤:
[0045] 步骤a,将多孔性固体状接触于生物样品,使存在于生物样品内的生物分子吸收至 多孔性固体状的空隙;以及
[0046] 步骤b,将步骤a的使吸收生物分子的多孔性固体状作为用于核酸扩增反应的模 具进行添加,利用目标引物组执行扩增反应,来扩增靶序列
[0047] 在本发明的一实现例的方法中,上述核酸扩增反应如上所述。
[0048] 并且,本发明提供在生物样品中扩增靶序列的方法,该方法包括如下步骤:
[0049] 步骤a,将多孔性固体状接触于生物样品,使存在于生物样品内的生物分子吸收至 多孔性固体状的空隙;
[0050] 步骤b,向步骤a的使吸收生物分子的多孔性固体状添加逆转录酶(Reverse Transcriptase),来执行逆转录酶反应;以及
[0051] 步骤c,将上述逆转录酶反应物作为用于核酸扩增反应的模具进行添加,利用目标 引物组执行扩增反应,来扩增靶序列。
[0052] 并且,本发明提供在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法,该方法包括如 下步骤:
[0053] 步骤a,将多孔性固体状接触于生物样品,使存在于生物样品内的生物分子吸收至 多孔性固体状的空隙;
[0054] 步骤b,将步骤a的使吸收生物分子的多孔性固体状作为用于核酸扩增反应的模 具进行添加,利用目标引物组执行扩增反应,来扩增靶序列;以及
[0055] 步骤c,检测上述扩增产物。
[0056] 并且,本发明提供在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法,该方法包括如 下步骤:
[0057] 步骤a,将多孔性固体状接触于生物样品,使存在于生物样品内的生物分子吸收至 多孔性固体状的空隙;
[0058] 步骤b,向步骤a的使吸收生物分子的多孔性固体状添加逆转录酶(Reverse Transcriptase),来执行逆转录酶反应;
[0059] 步骤c,将上述逆转录酶反应物作为用于核酸扩增反应的模具进行添加,利用目标 引物组执行扩增反应,来扩增靶序列;以及
[0060] 步骤d,检测上述扩增产物。
[0061] 本发明的方法包括检测上述扩增产物的方法。上述扩增产物的检测可通过DNA芯 片、凝胶电泳、放射性测量、荧光测量或磷光测量来执行,但不受此限定。作为检测扩增产物 的方法之一,可执行凝胶电泳。凝胶电泳可根据扩增产物的大小,利用琼脂糖凝胶电泳或丙 烯酰胺凝胶电泳。并且,根据荧光测量方法,在引物的5' -末端标记Cy-5或Cy-3并执行 PCR时,靶序列标记成可检测的荧光标记物质,利用荧光测定仪可测量这种被标记的荧光。 并且,根据放射性测量方法,当执行PCR时,向PCR反应液添加如 32P或35S等的放射性同位 元素来标记扩增产物之后,利用放射性测量仪器,例如盖革计数器(Geiger counter)或液 体闪烁计数器(liquid scintillation counter)来测量放射性。
[0062] 并且,本发明提供在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒,包括: 多孔性固体状,能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙; 目标引物组;以及试剂,用于执行扩增反应。
[0063] 本发明的上述核酸扩增反应用试剂盒可包括用于microRNA分离、smallRNA分离 或cDNA合成的试剂,但不受此限定。
[0064] 在根据本发明的一实现例的试剂盒中,用于执行扩增反应的上述试剂可包括DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲剂等。并且,本发明的试剂盒可补充包括记载有最佳反应执行条件的使 用指南书。指南书是说明有试剂盒的使用方法的印刷物,例如PCR缓冲液制备方法、建议反 应条件等。指南书包括在手册或传单形态的指南册子、附着在试剂盒的标签以及用于包含 试剂盒的包装的表面上的说明。并且,指南书还包括通过如同互联网等电子媒介公开或提 供的信息。
[0065] 在根据本发明的一实现例的试剂盒中,上述核酸扩增反应可以是cDNA合 成、PCR(Polymerase Chain Reaction)、多重(multiplex)PCR 或逆转录 PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction),但不受此限定。并且,上述多孔性固体状如 上所述。
[0066] 并且,本发明提供用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的试剂盒, 该试剂盒包括多孔性固体状,能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固 体状的空隙。
[0067] 在根据本发明的一实现例的试剂盒中,上述核酸扩增反应可以是cDNA合 成、PCR(Polymerase Chain Reaction)、多重(multiplex)PCR 或逆转录 PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction),但不受此限定。并且,上述多孔性固体状如 上所述。
[0068] 并且,本发明提供用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的组合物, 该组合物包括多孔性固体状,能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固 体状的空隙。上述组合物包括能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固 体状的空隙多孔性固体状,通过使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至上述多孔性 固体状的空隙,来用于核酸扩增反应。上述多孔性固体状如上所述。
[0069] 在根据本发明的一实现例的组合物中,上述核酸扩增反应可以是cDNA合 成、PCR(Polymerase Chain Reaction)、多重(multiplex)PCR 或逆转录 PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction),但不受此限定。并且,上述多孔性固体状如 上所述。
[0070] 以下,将根据实施例对本发明进行详细说明。但是,下述实施例仅仅用于例示本发 明,本发明的内容并不限定于下述实施例。
[0071] 实施例1.利用多孔性陶瓷立方体的基因体吸附与作为逆转录PCR/PCR模具的应 用
[0072] 图1表示了本发明的利用多孔性陶瓷立方体的基因体吸附与作为逆转录PCR/PCR 模具的应用模式图。在本发明中,以表1中记载的主要成分作为材料,通过改变制备温度, 使得1立方毫米(Imm3)的立方体表面的空隙大小发生变化,进而制备14种立方体,将其多 孔性陶瓷立方体放大显示于图1B。由于立方体为多孔性,因此,非选择性地吸收小于空隙的 物质,通过改变空隙的大小(通常,在高温下制备陶瓷时,空隙变小),在组织被破坏时产生 的各种物质中,可以选择性地进行吸收,即,目的在于以可最大限度地排除PCR阻碍物质的 空隙的大小来向立方体赋予超滤(ultrafiltration)功能。
[0073] 在本发明中,将制备的上述1个多孔性陶瓷立方体放在植物体叶子上,利用引脚V 后面向立方体施压,破碎组织,使得基因体吸收至立方体的空隙,在琼脂糖凝胶中确认将吸 收有基因体的上述1个立方体作为逆转录PCR或PCR模具来使用的结果(图1E)。
[0074] 实施例2.利用陶瓷切片从生物样品分离用于核酸扩增反应的DNA/RNA模具
[0075] 使用钳子(nipper)细碎包括青瓷和白瓷的7种类的陶瓷切片,在不包含釉料的 部位中,挑选大小约为lmm3的碎片,用作基因体吸附材料。在图2A的5号陶瓷切片的情 况下,根据涂敷有釉料的部位,分为黄色和灰色,由此分别获得的黄土色碎片标记为5号, 灰色碎片标记为6号。在甜椒CM334辣椒叶上放置各陶瓷碎片,利用引脚V的扁平的后 端轻压陶瓷碎片,使得吸收gDNA向PCR管添加可检定出辣椒的表皮毛管相关分子标记的 引物预混料,并向每个PCR管添加各一个吸收有gDNA的陶瓷碎片。PCR预混料由IOpmol 上游引物(Tsca-F :AAACGCCATCATTCGTTTTC :序列号 1)0. 5 μ IUOpmol 下游引物(Tsca-R : CATGAAAG
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