用于降低免疫测定的干扰且稳定免疫测定的分子伴侣-分子伴侣融合多肽的制作方法
【专利说明】用于降低免疫测定的干扰且稳定免疫测定的分子伴侣-分 子伴侣融合多肽 发明领域
[0001] 本发明涉及包含几个分子的折叠辅助多肽的融合多肽，其包含一个多聚化结构域 (特别是Skp)和至少一个分子的SlyD或SlpA，其中没有进一步的目标多肽序列融合至所 述融合多肽。本发明进一步涉及免疫测定和所述融合多肽在免疫测定中用于降低干扰或尽 可能减少假阳性结果或用于稳定蛋白测定试剂的用途。进一步，本发明涉及用于免疫测定 中使用的试剂盒，其包含所述融合多肽。
[0002] 发明背景 分子伴侣，其已知为经典折叠辅助分子，是帮助其他蛋白的折叠和结构完整性的维持 的蛋白。它们结合蛋白的变性或疏水性表面，并且帮助复性且保持蛋白溶解。由于它们优 异的物理化学特性，分子伴侣在蛋白技术中被用作折叠助手和融合伴侣。一类分子伴侣是 FKBP分子伴侣（结合免疫抑制剂药物FK506的蛋白）的家族。
[0003] FKBP分子伴侣如SlyD、FkpA和SlpA (= SlyD-样蛋白A)作为困难蛋白的融合伴 侣的用途已得到广泛描述（WO 2003/000878、WO 2009/074318、EP 2127679)。
[0004] 用于检测针对病原体如，例如，人免疫缺陷病毒（HIV)、风瘆病毒、巨细胞病毒 (CMV)或单纯疱瘆病毒（HSV)的抗体的市售免疫测定含有多肽融合蛋白，其中分子伴侣 融合至特定目标抗原序列。此类融合蛋白描述于，例如，Scholz等人，J. Mol. Biol. (2005) 345，1229-1242，Scholz等人，Biochemistry (2006) 45，20-33或Scholz等人， Biochemistry (2008) 47， 4276-4287。
[0005] SlyD、FkpA和SlpA具有突出的增溶（即分子伴侣）特性，并且特征在于它们能够 在化学或热诱导的解折叠后可逆地再折叠。作为困难目标多肽的融合伴侣，它们发挥至少 三重作用：首先，它们增加在原核生物中异源过表达的目标蛋白的产生，其次，它们促进和 帮助目标多肽的体外再折叠，且第三，它们增加各目标多肽的总体溶解度和稳定性。
[0006] 然而，分子伴侣如SlyD、FkpA和SlpA以其自身即为免疫原。因为它们是丰富的细 菌蛋白，所以它们被人（或一般而言，哺乳动物）免疫系统识别为非自身的，引发强有力的 体液免疫应答，这导致产生具有高亲和力的特异性抗体。因此，相当百分比的成人血清含有 针对这些分子伴侣的显著免疫球蛋白滴度。作为结果，存在很大可能性人血清样品可在免 疫测定（特别是使用融合至细菌分子伴侣模块的抗原特定物（antigen specifiers)的双 抗原夹心形式的免疫测定）中变成假阳性。
[0007] 为了避免由于融合伴侣的抗体诱导的桥接（bridging)导致的此类不希望的交叉 反应，通常以不对称的方式设计免疫测定。这意味着，例如在以众所周知的双抗原夹心形式 (DAGS)设计的用于检测抗体的免疫测定中，本领域技术人员对于测定的两侧上的应用抗原 使用不同的融合伴侣以避免非特异性桥接。如果相同融合伴侣用于固相和检测侧上的抗 原，则样品中的干扰组分可以建立所述相同融合伴侣之间的桥接，从而引发（假）阳性反 应。
[0008] 作为防止不希望结合至作为抗原融合蛋白的一部分的融合伴侣的进一步方式，通 常将化学聚合形式的所采用的融合模块（即没有任何特异性抗原的融合部分）以大过量添 加至测定中。由于它们的高表位密度和它们的高有效浓度，这些化学聚合的融合模块优选 引诱、结合和猝灭针对所述融合模块的那些IgG和IgM。化学聚合的融合模块充当诱饵，并 且它们非常有效地猝灭样品中的干扰化合物，使得干扰可以受到抑制并排除。当，例如，大 肠杆菌SlyD用作双抗原夹心类型的免疫测定中的给定抗原的融合伴侣时，高度建议生成 化学聚合的大肠杆菌SlyD (借助于与例如戊二醛交联）且将该聚合物作为抗干扰物质添加 至测定。
[0009] 然而，使用化学聚合蛋白的相当大的缺点在于化学产生过程本身。根据应用的交 联剂，化学聚合过程不是完全可重复的。化学交联的聚合物通常显示不同大小的聚合物的 大分布，即它们在连接性方面强烈变化，并且它们的特征在于相当大的异质性。为了选择有 效的聚合物级分（即具有所需抗干扰能力的聚合物级分），聚合物合并物需要通过费时且 麻烦的层析方法纯化和分级分离。此外，仅仅可以获得有限的产率，因为仅仅小百分比的产 物将洗脱在期望的级分中。
[0010] 为了克服在免疫测定中使用未充分表征的化学聚合的材料的障碍，我们搜索替代 方式来生成抗干扰物质。我们努力获得简单且方便的方式的具有足够高且良好定义的表位 密度的抗干扰模块。因此，我们致力于是否可能以完全重组的方式生成良好定义、高度可溶 且高度有效的抗干扰模块的问题。简而言之，待解决的问题是以可重复且可标准化的方式 获得具有高表位密度的可溶形式的分子伴侣融合伴侣。
[0011] 发明概沐 所述问题通过如权利要求表征的本发明解决。具体而言，本发明涉及包含几个分子的 折叠辅助多肽的融合多肽，其包含一个多聚化结构域和至少一个分子的SlyD或SlpA，其中 没有进一步的目标多肽序列融合至所述融合多肽。作为优选的多聚化结构域，使用Skp。 优选地，一个分子的Skp融合至两个相邻分子的SlyD或两个相邻分子的SlpA。在另一个 优选实施方案中，一个分子的Skp N末端融合至两个相邻分子的SlyD或两个相邻分子的 SlpA，或融合至充当融合伴侣的另一个单体分子伴侣。术语"N末端融合的"意指，Skp融 合至另一蛋白分子的N末端，在该情况下，融合至SlyD或SlpA的N末端。以进一步优选 的方式，根据本发明的融合多肽包含SEQ ID NO. 1，其也可以被命名为Skp-串联-SlyD或 Skp-SlyD-SlyD。优选的融合多肽是由SEQ ID NO. I (Skp-串联-SlyD)组成的多肽。进 一步优选的融合多肽是包含SEQ ID NO. 9的多肽，其也可以被命名为Skp-串联-SlpA或 Skp-SlpA-SlpA。特别优选的是由SEQ ID NO. 9组成的多肽。