一种用于EB病毒荧光定量PCR检测的引物和探针组、及试剂盒的制作方法

本发明涉及一种用于eb病毒荧光定量pcr检测的引物和探针组、及试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术：

在早期婴幼儿时体液免疫功能还没有发育完善，处于相对低水平，或在eb病毒感染早期，抗体检测也为阴性，且抗体检测也容易受到类风湿因子的干扰而出现假阳性结果，所以eb的抗体检测不能很好地客观反映婴幼儿的eb病毒感染的真实情况。

但随着实时荧光pcr检测技术的临床应用，eb病毒dna作为eb感染的分子生物学标记，具有特异性强、敏感性高、精确性高的优点，医生可以根据病人体内病毒载量的多少可以推测病人eb病毒的感染状况，及时有效的进行抗病毒治疗，对于避免滥用抗生素和及时缓解病情都具有积极意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于eb病毒荧光定量pcr检测的引物和探针组，该引物和探针组可配合对eb病毒特异性的核酸片段体现出良好的扩增效率。

本发明的第二个目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒通过特异性的引物和探针、在阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品的监控下，与阳性标准品进行同步测定，测得的结果具有灵敏度高、准确度高的特点。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种用于eb病毒荧光定量pcr检测的引物和探针组，包括，

上游引物eb-f：5’ccggtgtgttcgtatatggag3’，如seqidno.1所示；

下游引物eb-r：5’gggagacgactcaatggtgta3’，如seqidno.2所示；

探针eb-p：5’tgcccttgctattccacaatgtcgtctt3’，如seqidno.3所示；探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。

进一步地，引物和探针根据eb病毒的基因组序列中的靶片段进行设计，该靶片段的序列如seqidno.4所示；该靶片段位于eb病毒的基因组的高保守区。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种用于eb病毒荧光定量pcr检测的试剂盒，包括：核酸提取液、红细胞裂解液、pcr反应液、、混合酶液、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品和阳性标准品；pcr反应液包括引物和探针；

引物为：上游引物eb-f：5’ccggtgtgttcgtatatggag3’，如seqidno.1所示；下游引物eb-r：5’gggagacgactcaatggtgta3’，如seqidno.2所示；

探针为：eb-p：5’tgcccttgctattccacaatgtcgtctt3’，如seqidno.3所示；探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

阴性质控品包括不含eb病毒dna片段的重组质粒；

临界阳性质控品和强阳性质控品均包括含有eb病毒dna片段的重组质粒；

阳性标准品包括含有eb靶片段的重组质粒，该靶片段的序列如seqidno.4所示。进一步地，核酸提取液包括体积百分比0.1-1％的np-40和1-10％的chelex-100。

进一步地，红细胞裂解液包括质量百分浓度20-50％的蔗糖和体积百分比1-5％的tritonx-100。

进一步地，pcr反应液包括浓度为0.2-0.4mm含dutp的dntp、2-7mm的mgcl2、5-20mm的kcl、0.2-1μm的引物和0.1-0.3μm的探针；上游引物和下游引物等量；

进一步地，混合酶液包括1-5u的hotstarttaq酶和0.1-0.5u的ung酶。

进一步地，阳性标准品包括：

阳性标准品1：含有浓度为1.0×10⁴copy/ml的eb靶片段的重组质粒；

阳性标准品2：含有浓度为1.0×10⁵copy/ml的eb靶片段的重组质粒；

阳性标准品3：含有浓度为1.0×10⁶copy/ml的eb靶片段的重组质粒；

阳性标准品4：含有浓度为1.0×10⁷copy/ml的eb靶片段的重组质粒。

进一步地，试剂盒进行pcr的反应体系为：42℃，2min；94℃，2min；94℃，10sec，58℃，1min，45个循环；数据的采集定在58℃。

进一步地，重组质粒为pge重组质粒。

本发明的待检样本包括但不限于全血。

本发明的设计原理如下：

荧光定量pcr是一种在核酸扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法，通过内参或者外参法对待测样品中的特定核酸序列进行定量分析的方法。本发明利用一对靶核酸序列的特异性引物和探针，采用一步法进行实时荧光定量rt-pcr，通过pcr技术实现靶核酸序列片断的扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(r)和荧光淬灭基团(q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在pcr扩增过程中，dna聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。

临床样本与设定不同浓度的阳性标准品同步进行荧光定量pcr，通过ct值计算出标准曲线，推算出样本的具体含量。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明的引物和探针组可配合对eb病毒特异性的核酸片段体现出良好的扩增效率；

2、本发明的试剂盒与荧光pcr检测技术相配合，通过特异性的引物和探针、在阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品的监控下，与阳性标准品进行同步测定，操作简便，无需电泳，防止产物被污染，测得的结果具有超高的灵敏度和高准确度。

附图说明

图1为扩增曲线图；

图2为标准曲线图；

图3为最低检出限样本扩增曲线图；

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

实施例1：

一、预配置试剂和设备的准备：

1、核酸提取液：核酸提取液含体积百分比0.5％的np-40和5％的chelex-100；

2、红细胞裂解液：红细胞裂解液含质量百分浓度20％的蔗糖和体积百分比2％的tritonx-100；

3、pcr反应液体系：取pcr反应液，在冰上或4℃融化；然后取出混合酶液，将所有组分轻微摇晃混匀并低速简短离心；每20μl的pcr反应液体系含pcr反应液19.5μl和混合酶液0.5μl。

pcr反应液含浓度为0.4mm的dntp(dntp中含有dutp)、4.5mm的mgcl2和10mm的kcl、0.4μm的上游引物、0.4μm的下游引物和0.2μm的探针；

其中：

上游引物eb-f：5’ccggtgtgttcgtatatggag3’；

下游引物eb-r：5’gggagacgactcaatggtgta3’；

探针为：eb-p：5’tgcccttgctattccacaatgtcgtctt3’；探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

混合酶液含浓度2.5u的hotstarttaq酶和0.1u的ung酶(尿嘧啶-n-糖基化酶)；

ung酶+dntp中的dutp，组合的系统能够防止实验室的假阳性结果，提高该试剂盒的可靠性。pcr反应中最常见、最重要的污染物是pcr产物，pcr试剂盒以dutp部分取代dttp，所以pcr产物都是含有du的dna链。在pcr开始前增加42℃的保温步骤，ung酶即可将反应体系中已有的u-dna污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下dna链断裂,，消除由于污染pcr产物产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性和准确性。同时在变性阶段，ung酶被灭活，不会再降解新扩增的产物u-dna，从而保证荧光定量pcr的正常进行。

4、阴性质控品：为不含eb病毒dna片段的pge重组质粒；

5、临界阳性质控品：为含有eb病毒dna片段的pge重组质粒；

6、强阳性质控品：为含有eb病毒dna片段的pge重组质粒；

7、阳性标准品：

阳性标准品1：含有浓度为1.0×10⁴copy/ml的eb靶片段的重组质粒；

阳性标准品2：含有浓度为1.0×10⁵copy/ml的eb靶片段的重组质粒；

阳性标准品3：含有浓度为1.0×10⁶copy/ml的eb靶片段的重组质粒；

阳性标准品4：含有浓度为1.0×10⁷copy/ml的eb靶片段的重组质粒。

靶片段的序列如seqidno.4所示。

需要使用的设备有：

金属浴，采用微电脑控制和半导体制冷技术制造的一款恒温金属浴仪器，代替传统的水浴装置；

荧光pcr检测仪，abi荧光定量pcr仪，厂家：美国应用生物系统公司。

二、样本处理：

取出红细胞裂解液，使其温度平衡至室温，混匀；取出加入抗凝剂的全血样本，充分混匀；利用带滤芯的吸头在1ml红细胞裂解液中加入400μl全血样本，上下颠倒10次充分混匀，放置5min同时轻摇2-4次；然后放入离心机，12000rpm离心2min，弃去上清液，去沉淀；向沉淀中加入1ml红细胞裂解液，重悬至无明显块状沉淀，12000rpm离心2min，弃去上清液取沉淀；用1ml生理盐水洗涤白细胞沉淀，12000rpm离心5min，弃去上清液取沉淀；在管内加入200μl核酸提取液，重悬沉淀物；95℃加热10min，高转速离心10min；小心吸取上清液置于另一灭菌的离心管中，暂时储存于4℃待检，核酸溶液长期储存温度为-18℃。

三、质控品处理：

阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品、阳性标准品1、阳性标准品2、阳性标准品3和阳性标准品4各100μl，置于100μl的核酸提取液中，充分混匀，100℃金属浴处理10min，12000rpm离心5min，备用。

四、分装反应孔：

试剂盒中设有至少1个样本反应孔，1个阴性反应孔、1个临界阳性反应孔、1个强阳性反应孔、1个阳性标准1反应孔、1个阳性标准2反应孔、1个阳性标准3反应孔、1个阳性标准4反应孔、1个阴性对照反应孔；每个反应孔中加入20μl的核酸提取液，然后分别取20μl经处理的样本；阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品、阳性标准品1、阳性标准品2、阳性标准品3、阳性标准品4，加入各自的反应孔中，其中阴性对照反应孔不加入任何样本或dna。

五、反应：

将试剂盒放入荧光pcr检测仪中进行pcr扩增，反应体系为42℃，2min；94℃，2min；94℃，10sec，58℃，1min，45个循环；荧光信号收集设定为fam荧光素，数据的采集定在58℃。

六、检测结果分析：

将4个阳性标准品1、2、3、4的浓度输入，得到图像如图1所示，图1中1为阳性标准品1，2为阳性标准品2，3为阳性标准品3，4为阳性标准品4，5为强阳性质控品、6为临界阳性质控品，7为样本，8为阴性质控品，9为阴性对照，10为阈值。分析图像后调节baseline的start值、end值和threshold值：start值位于3-15之间，end值位于5-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线，再进行结果分析：

1)阴性质控品目的基因扩增曲线ct值应为undet；

2)临界阳性质控品的ebdna定量结果应约为5×10³copies/ml；

3)强阳性质控品的ebdna定量结果应约为5×10⁶copies/ml；

4)根据4个阳性标准品绘制的标准曲线如图2所示，相关系数应≥0.98。

5)以上5个条件需在同一次试验中同时满足，否则认为检测结果不能正确地反映样本实际情况，需重新进行检测。满足以上条件后方可进行以下结果判断：

(1)仪器显示undet表示待检样品为阴性；

(2)结果显示样本ebdna拷贝数在1×10²－6.0×10⁸copies/ml时，定量结果有效，可直接报告相应的定量数值；

(3)结果显示样本拷贝数大于6.0×10⁸copies/ml，可直接报告为大于6.0×10⁸copies/ml，也可将核酸样本做10倍梯度稀释后重新测定，测定后根据稀释倍数校准；

(4)结果显示典型扩增曲线，ebdna拷贝数低于1×10²copies/ml时，检测结果有效，定量数值仅供参考；

(5)待检样本ebdna的拷贝数小于30copies/ml时，不能100％检出。

实施例2：

试剂盒灵敏度测试：

将浓度为100copies/ml的eb全血样本，用eb阴性全血样本稀释至30copies/ml，标记为最低检出限样本，制备16个最低检出限重复样本。样本的处理方法同实施例1，将16个最低检出限重复样本分别放入16个样本反应孔中，采用实施例1的试剂盒进行检测。得到的扩增曲线如图3所示，数据如表格1所示。

表格116个最低检出限样本检测结果

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

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