一步法实时荧光RT‑PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法与流程

本发明涉及一种一步法实时荧光rt-pcr检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法，属于蔬菜病毒检测技术领域。

背景技术：

植物病毒是植物的“癌症”，其流行依赖于载体的传播扩散，其中近80％的植物病毒通过特定的媒介昆虫进行传播，且以半翅目的刺吸式口器昆虫居多，例如蚜虫、粉虱、飞虱、木虱、叶蝉等。

随着全球气候变暖，以及经济贸易往来频繁，外来生物入侵加剧，植物病毒病的发生也日趋严重，由褐飞虱(nilaparvatalugens)传播的水稻矮缩病毒病和由烟粉虱(bemisiatabaci)传播的番茄黄化曲叶病毒病在世界范围内流行。近年来一种新入侵的植物病毒，番茄褪绿病毒(tomatochlorosisvirus,tocv)传入我国内陆地区，该病毒可以侵染番茄、辣椒、甜椒、烟草等多种作物，侵入植株后，导致叶脉间发黄褪绿，边缘卷曲变脆，阻碍植株正常生长发育，造成果实减产。最新监测结果表明，tocv在我国呈快速蔓延态势，目前已成功扩散至北京、天津、内蒙古、山东、山西和浙江等地。该病毒不能通过摩擦等方式接种，仅能够通过昆虫传播，主要介体有烟粉虱、温室白粉虱(trialeurodesvaporariorum)和纹翅粉虱(trialeurodesabutilonea)。

针对植物病毒，早期检测、监测和预警是重要的防治手段之一，准确、灵敏的检测手段对于开展tocv的早期诊断具有重要的实际意义。烟粉虱作为tocv的主要传播介体，相当于病毒的“采集器”和“注射器”，特定建立针对单头媒介昆虫的高灵敏性病毒分子检测技术体系，不仅能够实现tocv的快速、准确、灵敏检测，避免传统植物取样方法对植株本身造成的损伤，对于病毒流行的风险性评估以及蔓延趋势早期预测同样具有一定程度的科学指导价值。目前，tocv的分子生物学检测多采用普通pcr技术，灵敏度有限，无法满足低病毒含量样品的准确检测，而实时荧光定量pcr灵敏度高，可以满足病毒含量较低样本的检测。传统普通pcr和实时荧光定量pcr方法都需要进行rna提取、第一链cdna的合成、病毒检测三个阶段，耗时相对较多，无法满足大量待检样品的快速检测。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种灵敏、快速、准确的一步法实时荧光rt-pcr检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法。

本发明技术方案如下：

一步法实时荧光rt-pcr检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明所述的一步法实时荧光rt-pcr检测引物是根据ncbi数据库中番茄褪绿病毒的rna依赖的rna聚合酶(rna-dependentrnapolymerase，rdrp)基因(agn91001.1)的保守序列进行设计，并通过ncbi的primer-blast进行比对，保证引物的特异性。引物序列如下：

上游引物tocv-rqf：aactctcggcaccctgattg；seqidno.1

下游引物tocv-rqr：tgaccccgttctcctttgtg；seqidno.2

一步法实时荧光pcr检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取单头烟粉虱的总rna；

(2)制备tocv标准品，并按梯度稀释成不同浓度，制备标准曲线；

(3)以步骤(1)制备的单头烟粉虱的总rna，通过一步法实时荧光rt-pcr进行tocv的检测，结合检测得到的扩增曲线、熔解曲线判断待检样品是否含有该病毒，并根据检测得到的ct值，代入步骤(2)制备得到的标准曲线计算待检样品所含有的病毒量。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，提取单头烟粉虱的总rna，步骤如下：

1)取一头待检测烟粉虱，放入去除rnase的1.5ml离心管底部，将离心管置入液氮中冷冻5s后取出，用无rnase的研磨棒进行研磨，将烟粉虱研磨成粉末后，加入400～500μltrizol(trizol试剂购于赛默飞世尔公司)，充分震荡混匀后，室温静置10min；

2)加入80～100μl氯仿，震荡混匀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，取上清；

3)在上清液中加入200～250μl异丙醇，充分混匀后，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；

4)加入400～500μl体积浓度75％的乙醇溶液，充分洗涤沉淀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；

5)静置，待离心管中沉淀周围的体积浓度75％的乙醇溶液充分挥发后，加入8～10μlrnase-freewater，沉淀溶解后，即得到单头烟粉虱的总rna。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，制备tocv标准品和标准曲线步骤如下：

1)以tocv感染的番茄植株cdna作为模板，用一步法实时荧光rt-pcr检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物进行pcr扩增，pcr反应体系如下：

10×pcrbuffer(mg²⁺plus)2.5μl、dntpmixture2μl、上游引物和下游引物各1μl、cdna模板1μl、rtaq0.25μl、ddh2o17.25μl；

pcr反应程序如下：

95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环；72℃后延伸10min，置于4℃保存；

2)将pcr产物经纯化后连接至pmd^tm18-tvector(购自宝生物工程有限公司)，然后转入大肠杆菌感受态细胞trans5α(购自北京全式金生物技术有限公司)，37℃过夜培养后，筛选阳性克隆，经测序正确，继续扩大培养，然后提取重组质粒，测定质粒浓度，计算出质粒浓度拷贝数，作为tocv质粒标准品使用，计算公式如下：

c＝a/b×6.02×10¹⁴

a代表质粒浓度ng/μl，b代表质粒dna分子量，c代表copies/μl；

3)将tocv质粒标准品按照10倍稀释得到10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³的8个浓度梯度的质粒样品作为模板进行实时荧光pcr；仪器自动生成标准曲线，扩增效率为99％，相关系数r²＝0.991，直线方程为：

y＝-3.34×lg(x)+44.28；

式中：y、循环阈值(ct值)；x、样品初始浓度。

所述步骤1)中，tocv感染的番茄植株cdna采用本领域常规技术制备，先利用trizol法提取实验室内已有tocv感染番茄植株的叶片总rna，然后通过rt-pcr进行cdna的合成，反转录反应用到的primescriptrtreagentkit购自宝生物生物工程有限公司，具体步骤如下：

去除总rna中的基因组dna，制得去除基因组dna的反应液，反应体系如下：

总rna1μg、5×gdnaeraserbuffer2μl、gdnaeraser1μl、rnasefreedh2o补至10μl；

反应条件：42℃反应2min；

进行反转录反应，反应体系如下：

primescriptrtenzymemixi1μl、rtprimermix1μl、5×primescriptbuffer2(forrealtime)4μl、rnasefreedh2o4μl，去除基因组dna的反应液10μl；

反转录条件：37℃反应15min，然后85℃反应5sec，即获得tocv感染的番茄植株cdna。

进一步优选的，所述步骤3)中，实时荧光pcr反应体系如下：

2×onestepsybrrt-pcrbufferiii10μl、extaqhs0.4μl、上游引物和下游引物各0.4μl、质粒样品1μl、ddh2o7.8μl；

实时荧光pcr反应程序为：95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，一步法实时荧光rt-pcr反应体系如下：

2×onestepsybrrt-pcrbufferiii10μl、extaqhs0.4μl、primescriptrtenzyme上mixii0.4μl、上游引物和下游引物各0.4μl、rna1μl、rnasefreeddh2o7.4μl；

一步法实时荧光rt-pcr反应程序为：42℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，根据检测得到的扩增曲线、熔解曲线判定待测样品是否携带病毒的步骤如下：

当特异扩增曲线中荧光吸收值有变化，则检测样品携带有病毒；如果特异扩增曲线中荧光吸收值没有变化，则检测样品不携带病毒；

当熔解曲线中出现单一特异吸收峰，则检测样品携带有病毒；如果熔解曲线中未出现单一特异吸收峰，则检测样品不携带病毒；

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，计算待测样品的含病毒量的步骤为：将ct值代入步骤(2)制得的标准曲线中，计算待测样品的病毒拷贝数。

有益效果

1、本发明中提到的tocv检测引物基于该病毒rdrp基因中的保守区域设计，经blast对比分析，特异性强；

2、本发明基于一步法实时荧光rt-pcr检测番茄褪绿病毒的方法直接检测样品rna中携毒情况，省略“反转录合成第一链cdna”这一步骤，检测灵敏度高并且检测所用时间少，从样品rna提取至检测完毕仅需2h，适用于样本量较少的单头媒介昆虫的病毒检测；检测所需样本量极少，能够检测单头烟粉虱体内是否带毒并计算其拷贝数，保证在有限的取样条件下完成病毒检测任务；本方法可同时进行多个样品的检测，通量高；

3、本方法以传毒媒介昆虫烟粉虱作为检测主体，避免了传统检测取样方法对植株本身的伤害，此外通过对媒介昆虫种群携毒率的准确监测，对病毒发生为害的风险性评估及蔓延趋势的预测预报均能提供科学的依据；

4、本发明中所使用的均为分子生物学的常规试剂和材料，检测引物不需要特殊修饰，相对于taqman探针法等病毒检测方法，成本低廉。

附图说明

图1、普通pcr扩增tocv目的片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图中：m为dnamakerdl2000，1、感染tocv的番茄样品，2、阳性对照，3、阴性对照，4、空白对照；

图2、tocv质粒标准品一步法实时荧光pcr的标准曲线图；

图中：纵坐标为循环阈值(ct)，横坐标为质粒初始浓度的对数值，质粒标准品浓度梯度范围为10³～10¹⁰；

图3、单头烟粉虱一步法实时荧光rt-pcr检测扩增曲线图；

图4、一步法实时荧光rt-pcr检测tocv的灵敏度测试结果图；

图中：曲线a-h分别为tocv质粒标准品溶液浓度稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的扩增曲线，曲线i为空白对照的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的原理和内容进行详细阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1、tocv的检测引物设计与克隆鉴定

(1)实时荧光定量检测引物的设计

首先从ncbi数据库中检索得到tocv的rna依赖的rna聚合酶(rna-dependentrnapolymerase，rdrp)基因(agn91001.1)的碱基序列，根据其保守区域设计定量检测引物，并通过ncbi的primer-blast进行比对，保证引物的特异性。引物序列如下：

上游引物tocv-rqf：aactctcggcaccctgattg；seqidno.1

下游引物tocv-rqr：tgaccccgttctcctttgtg；seqidno.2

上述检测引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。

(2)tocv目的基因片段克隆与鉴定

先利用trizol法提取实验室内已有tocv感染番茄植株的叶片总rna，然后通过rt-pcr进行cdna的合成，反转录反应用到的primescriptrtreagentkit购自宝生物生物工程有限公司，制得tocv感染的番茄植株cdna，具体步骤如下：

去除总rna中的基因组dna，制得去除基因组dna的反应液，反应体系如下：

总rna1μg、5×gdnaeraserbuffer2μl、gdnaeraser1μl、rnasefreedh2o补至10μl；

反应条件：42℃反应2min；

进行反转录反应，反应体系如下：

primescriptrtenzymemixi1μl、rtprimermix1μl、5×primescriptbuffer2(forrealtime)4μl、rnasefreedh2o4μl，去除基因组dna的反应液10μl；

反转录条件：37℃反应15min，然后85℃反应5sec，即获得tocv感染的番茄植株cdna。

将tocv感染番茄叶片的cdna作为模板，使用(1)中所设计检测引物进行普通pcr扩增，其中阳性对照为实验室保存的tocv样品cdna，阴性对照为健康番茄植株叶片的cdna(二者制备途径均和tocv感染叶片cdna合成途径一致)，空白对照为ddh2o。

反应为25μl体系：

10×pcrbuffer(mg²⁺plus)2.5μl、dntpmixture2μl、上游引物和下游引物各1μl、cdna模板1μl、rtaq0.25μl、ddh2o17.25μl；

pcr反应程序为：

95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环；72℃后延伸10min；

pcr反应结束后，将所有样品进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。

电泳结果发现，本发明中检测引物(tocv-rqf和tocv-rqr)扩增的感染tocv番茄植株样品的条带同阳性对照条带的长度一致(目的片段准确大小为250bp)(如图1所示)，将该条带切下后，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkit(购自宝生物工程有限公司)试剂盒进行回收，将纯化后的pcr产物连接至pmd^tm18-tvector(购自宝生物工程有限公司)后，将连接有目的基因的载体转入大肠杆菌感受态细胞trans5α(购自北京全式金生物技术有限公司)，37℃过夜培养，对单一菌落进行筛选检测得到阳性克隆并测序(由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成)，将测序得到的碱基序列进行blastn比对，结果证实该序列为tocvrdrp基因片段，测序结果如seqidno.3所示。

实施例2、单头烟粉虱总rna提取

1)取一头待检测烟粉虱，放入去除rnase的1.5ml离心管底部，将离心管置入液氮中冷冻5s后取出，用无rnase的研磨棒进行研磨，将烟粉虱研磨成粉末后，加入400～500μltrizol(trizol试剂购于赛默飞世尔公司)，充分震荡混匀后，室温静置10min；

2)加入80～100μl氯仿，震荡混匀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，取上清；

3)在上清液中加入200～250μl异丙醇，充分混匀后，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；

4)加入400～500μl体积浓度75％的乙醇溶液，充分洗涤沉淀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；

5)静置，待离心管中沉淀周围的体积浓度75％的乙醇溶液，充分挥发后，加入8～10μlrnase-freewater，沉淀溶解后，即得到单头烟粉虱的总rna。

实施例3、tocv标准品的制备与标准曲线的制作

根据实施例1中的测序结果，选择序列正确的阳性克隆样品，进行扩大培养，并使用tianprepminiplasmidkit(购自天根生化科技有限公司)提取tocv目的片段的质粒。

使用核酸蛋白浓度测定仪测定质粒浓度后，经公式：

c＝a/b×6.02×10¹⁴

a代表质粒浓度ng/μl，b代表质粒dna分子量，c代表copies/μl；

计算出质粒浓度拷贝数，即作为tocv质粒标准品使用，本方法获得的tocv质粒标准品浓度拷贝数为1.69×10¹¹copies/μl。

将质粒标准品按照10倍稀释得到10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³的8个浓度梯度的质粒样品作为模板。反应采用20μl体系，包括2×onestepsybrrt-pcrbufferiii10μl、extaqhs0.4μl、上游和下游引物各0.4μl、质粒样品1μl、ddh2o7.8μl。

其中sybr荧光染料购自宝生物工程有限公司。

反应程序为：95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。

仪器自动生成标准曲线(如图2所示)，扩增效率为99％，相关系数r²＝0.991，直线方程为：

y＝-3.34×lg(x)+44.28；

式中：y、循环阈值(ct值)；x、样品初始浓度。

实施例4、烟粉虱带毒情况检测

从种植番茄的温室蔬菜大棚中采集烟粉虱，挑取15头按照实施例2中的方法提取rna，运用一步法实时荧光rt-pcr进行检测，反应体系为：2×onestepsybrrt-pcrbufferiii10μl、extaqhs0.4μl、primescriptrtenzyme上mixii0.4μl、上游引物和下游引物各0.4μl、rna1μl、rnasefreeddh2o7.4μl；反应程序为：42℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。结果发现其中9头烟粉虱携带tocv，带毒率为60％，扩增曲线如图3所示。

根据实施例3中的标准曲线可最终计算出待测烟粉虱体内携毒量，如表1所示；

表1烟粉虱带毒情况检测表

注：“+”表示烟粉虱携带tocv，“-”表示烟粉虱不带tocv。

实施例5、灵敏度检测

将tocv质粒标准品溶液测定浓度并定为46.35ng/μl，按10倍梯度稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8(tocv浓度拷贝数为1.69×10¹⁰-1.69×10³copies/μl)的8个样品，进行一步法实时荧光rt-pcr的灵敏度测试，结果表明运用此方法的检测下限为10^-8，即浓度为0.4635fg/μl，能够检测到1.69×10³copies/μl的病毒样品，结果如图4所示。

对比例1

按照实施例1中的方法根据ncbi数据库中番茄褪绿病毒的热激蛋白70(heatshockprotein70，hsp70)基因(agn91005.1)的保守结构域设计一对tocv一步法实时荧光rt-pcr特异检测引物，序列如下：

上游引物tocv-hsp70-rqf：tgcaggcagtttgttcctct；

下游引物tocv-hsp70-rqr：cgcccaccaagaaacgaatc；

按照实施例3中的方法制作该特异引物的标准曲线，结果表明其扩增效率为122％，相关系数r²＝0.979，直线方程为：y＝-2.89×lg(x)+21.97；式中：y、循环阈值(ct值)；x、样品初始浓度。

同该对引物相比，本发明涉及的检测引物tocv-rqf和tocv-rqr扩增效率为99％，接近100％，在实际进行病毒检测和病毒量计算的过程中，以tocv-rqf和tocv-rqr作为检测引物的一步法实时荧光rt-pcr检测体系将更加准确。

sequencelisting

<110>青岛农业大学

<120>一步法实时荧光rt-pcr检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法

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ggagattgatttctcaaagtttgataagtctcaaggtatcctatttaaagtttatgaggg120

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