述将抗体溶液通过蛋白A微球柱，且微球柱每毫升的湿微球能结合大约10 — 20ml抗体(I个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)，同时，记录装柱微球的大约体积，且微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量；
[0035]首先，用10倍柱体积的lOOmmol/LTris (pH8.0)洗涤微球；
[0036]然后，用10倍柱体积的10m mol/LTris (pH8.0)洗涤微球；
[0037]最后，用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入；接着用含1/10柱体积的lm0l/LTriS(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其PH值恢复至中性，将含抗体的收集管混合，-20 0C保存。用SDS-PAGE检测，纯化的样品(Elut1n)应有清晰的轻、重链带。
[0038]如图5所示=ELISA试剂盒检测图:阴性对照(图5左上一)、阳性对照(图5左下八)、检测样品用CBS PH9.6溶液配制，加入10uL于96孔硝酸纤维素板中，室温孵育I小时，PBS洗涤一遍。加入5%脱脂牛奶配制的EPSPS抗体(1: 1000)孵育I小时，PBS洗涤三遍，再加入HRP标记羊抗兔抗体(1:5000)孵育0.5小时，PBS洗涤5遍，加入1:1TMB配制好的液体100uL，反应约15分钟。加入50uL 2M HC1，即可显色，有颜色的样品孔即检测为转基因EPSPS的样品，其他不显色的为非转基因样品。
[0039]如图6所示:为一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，
[0040]包括如下步骤:
[0041]步骤一、标准品的稀释:所述在第一孔中分别加标准品100μ1，然后在第一孔中样品稀释液100 μ 1，混匀；然后从第一孔中取100 μ I分别加到第二孔，再在第二孔加样品稀释液100 μ 1，混匀；以此类推，到第七孔，混匀后取100 μ I弃掉，第八孔直接加加样品稀释液100 μ I ;所述对应第一孔至第八孔的浓度依次分别为10mg/L、5mg/L、2.5mg/L、l.2mg/L、0.6mg/L、0.3mg/L、0.15mg/L、0mg/Lo
[0042]步骤二、样品加样:所述在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液90 μ 1，然后再加待测样品10 μ 1，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
[0043]步骤三、温育、配液及洗涤:先用封板膜封板后置37°C温育60分钟；再将10倍浓缩洗涤液用蒸馏水10倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复2次，拍干；
[0044]步骤四、EPSPS抗体的加入:每孔加入酶标试剂50 μ I (EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育60分钟，洗涤5遍；
[0045]步骤五、HRP抗体的加入:每孔加入酶标试剂50 μ I (EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育30分钟，洗涤5遍。
[0046]步骤六、显色剂和终止液的加入:每孔先加入显色剂(A50 μ 1+Β50 μ I)，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟；每孔加终止液50 μ 1，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
[0047]步骤七、测定结果分析:以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。
[0048]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1.一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，其特征在于，包括免疫多肽混合样品的选择，EPSPS多克隆抗体的制备，EPSPS多克隆抗体的纯化，标准品的稀释，样品加样，温育、配液及洗涤，EPSPS抗体的加入，HRP抗体的加入，显色剂和终止液的加入及测定显示，其步骤如下: 步骤一、免疫多肽混合样品的选择:所述免疫多肽混合样品选择编号是Pc_19 - 32、Pc_67 - 77、Pc_141 - 156 和 Pc_312 - 324 的多肽混合样品； 步骤一■、EPSPS多克隆抗体的制备:第一次多妝混合样品加入等体积的完全弗氏佐剂完全乳化后，背部皮下注射免疫，每只兔子免疫用混合多肽0.5mg，且后三次直接用不完全弗氏佐剂完全乳化免疫，每次间隔14天，免疫剂量和部位与第一次相同，所述最后一次免疫10天后，心脏取血，4°C保存过夜，1000glOmin 4°C离心，收集上清即为抗血清(多克隆抗体)； 步骤三、EPSPS多克隆抗体的纯化:抗体样品(即抗血清)加入1/10体积的lmol/LTris (pH8.0)将PH调含至8.0，所述将抗体溶液通过蛋白A微球柱，且微球柱每毫升的湿微球能结合大约10 — 20ml抗体(I个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)，同时，记录装柱微球的大约体积，且微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量； 步骤四、标准品的稀释:所述在第一孔中分别加标准品100 μ 1，然后在第一孔中样品稀释液100 μ 1，混匀；然后从第一孔中取100 μ I分别加到第二孔，再在第二孔加样品稀释液100 μ 1，混匀；以此类推，到第七孔，混匀后取100 μ I弃掉，第八孔直接加加样品稀释液100 μ I ; 步骤五、样品加样:所述在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液90 μ 1，然后再加待测样品10 μ 1，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀； 步骤六、温育、配液及洗涤:先用封板膜封板后置37°c温育60分钟；再将10倍浓缩洗涤液用蒸馏水10倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复2次，拍干； 步骤七、EPSPS抗体的加入:每孔加入酶标试剂50 μ I (EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育60分钟，洗涤5遍； 步骤八、HRP抗体的加入:每孔加入酶标试剂50 μ I (EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育30分钟，洗涤5遍。 步骤九、显色剂和终止液的加入:每孔先加入显色剂(A50 μ 1+Β50 μ I)，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟；每孔加终止液50 μ 1，终止反应(此时蓝色立转黄色)； 步骤十、测定结果分析:以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。2.如权利要求1所述的转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，其特征在于:所述EPSPS多克隆抗体的纯化还包括如下步骤: 首先，用10倍柱体积的100mmol/LTriS(pH8.0)洗涤微球； 然后，用10倍柱体积的1m mol/LTris(pH8.0)洗涤微球； 最后，用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入；接着用含1/10柱体积的lm0l/LTriS(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其PH值恢复至中性，将含抗体的收集管混合，-20°C保存。3.如权利要求1所述的转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，其特征在于:所述对应第一孔至第八孔的浓度依次分别为10mg/L、5mg/L、2.5mg/L、l.2 mg/L、0.6mg/L、0.3mg/L、0.15mg/L、0mg/Lo
【专利摘要】本发明属于转基因作物食品检测技术领域，尤其涉及一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的检测方法，包括免疫多肽混合样品的选择，EPSPS多克隆抗体的制备，EPSPS多克隆抗体的纯化，标准品的稀释，样品加样，温育、配液及洗涤，EPSPS抗体的加入，HRP抗体的加入，显色剂和终止液的加入及测定显示。本试剂盒的抗体制备选择的多肽，具有极高的亲水性、免疫性以及特异性，产生抗体的效价高，特异性好，且检测的结果可靠。采用的该检测方法，通量高和灵敏度高，能同时快速检测多个样品。还可以定性检测样品是否含有epsps成分，更能根据标准品准确算出其具体含量，可以用肉眼观察，也可以用酶标仪读取(D450)。与标准曲线比较，可以精确定量EPSPS的含量。
【IPC分类】G01N33/573
【公开号】CN105092840
【申请号】CN201510505718
【发明人】刘登念, 凌琳
【申请人】湖北久华食安生物技术有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月18日