专利名称：一种牙齿干细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及干细胞领域，涉及一种成体干细胞，尤其是一种牙齿干细胞及其制备方法。
背景技术：
干细胞(stemcell)研究是90年代以来医学和生物学领域中最引人注目的热点之一，它作为体外模型用于研究个体的发育机制，在临床组织缺陷性疾病的细胞替代治疗和基因治疗中具有巨大的应用价值.
干细胞是来自胚胎、胎儿或成人的有持久或终身自我更新能力的细胞，它能产生特异的细胞类型，形成人体组织和器官。目前对干细胞的研究一般可根据以下两种方法对其进行分类，一是根据分化能力的不同将其分为3类1)全能干细胞；2)多能干细胞；3)专能干细胞。二是根据分化类别的不同分为1)神经干细胞；2)造血干细胞；3)上皮干细胞；4)视网膜干细胞和5)胚胎干细胞等。
成年动物的组织和器官，如上皮和造血系统，之所以具有修复和再生能力，成体干细胞在其中起着关键的作用。它虽然不能产生完整的个体，但可向特定组织分化。当组织受到外界、老化、疾病等损伤时，这些干细胞增殖分化，产生新的组织予以代替，以保持机体的动态平衡。最近干细胞的研究有重大的技术突破之一就是成体干细胞的横向分化。取自小鼠大脑的神经干细胞能在外周血和骨髓中滞留，并分化发育为血细胞。小鼠骨髓中的干细胞可分化为肝脏细胞等。这表明成体干细胞具有多向分化的能力，具有高度的可塑性。不仅能分化成来源组织的细胞，而且还能转向分化成不同胚层起源的细胞，这是对传统发育生物学观点的革新。此外，由于利用胚胎干细胞面临复杂的伦理学问题和实际操作的困难，对成体干细胞的研究就更具有意义。
与胚胎干细胞相比，成体干细胞的研究只是处于初级阶段。过去认为，只有造血系统和上皮等组织含有成体干细胞，最近的研究表明，成体干细胞普遍存在于人体的各种器官，包括骨髓、外周血、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、牙髓、肝、肾、皮肤、胃肠道内皮和胰腺等。
牙齿干细胞研究的组织来源于流产胎儿，由于伦理和法律的限制，取材十分不便，而且无法对胚胎来源进行严格的控制，无法实现临床应用。也有一部分研究者采用幼儿时期脱落的乳牙进行研究，然而脱落的乳牙完全处于发育过程中的终末期，干细胞含量极低，不利于牙齿干细胞的分离与培养。
目前，关于牙源性干细胞的研究报道尚少，Gronthos等从已萌出的成人牙髓中分离出能够自我复制并能迅速增殖的干细胞群。与骨髓基质干细胞的对比研究表明，这些细胞与骨髓基质干细胞具有相似的免疫表型，移植入免疫缺陷型小鼠体内时产生了牙本质样结构，并附着有牙髓样间叶组织包绕的人成牙本质样细胞，表明牙髓干细胞具有形成牙髓-牙本质样复合体的能力。对其功能的进一步研究表明，牙髓干细胞具有自我更新和多系分化等干细胞的特征。长期以来，人们在分化的成釉细胞的研究中一直未发现牙上皮干细胞存在的证据。
人类牙及其支持组织是从上下颌突和额鼻突的外胚层及外胚间充质发育而来。牙的发育是一长期、复杂的生物学过程，包括牙胚的发生，组织形成和萌出。牙胚包括成釉器、牙乳头和牙囊。在人类牙齿发育的过程中，第三恒磨牙的牙胚在出生后4-5时开始发生，时间最晚，故在同一时刻，第三恒磨牙牙胚的发育最幼稚，原始细胞含量最高。与此同时，由于人类的进化，第三恒磨牙在萌出过程中经常出现阻生，并引发智齿冠周炎等严重感染性疾病，已经有口腔医学专家建议在第三恒磨牙的牙胚形成后，即通过手术的办法预防性拔除，以防止日后严重疾病的发生。申请人经过长期的研究和实践，发现利用第三恒磨牙牙胚作为牙干细胞的来源材料，不仅从胚胎发育来讲具备良好的组织条件，而且材料获得上更加方便可行，是牙齿干细胞最佳的组织来源，并且以此作为本发明技术方案的基本思想。
发明内容
本发明提供一种牙齿干细胞，其来源于人第三恒磨牙的牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙，可以用于破损牙齿的修复，并可以在牙齿脱落后再生新的牙齿，具有取材简便、修复后的牙齿为活牙生物特性优异的优点，可以解决现有牙齿修复技术中完全采用物理手段、修复后牙齿为死牙、仅具备物理功能而无生物功能的缺点，而且以人第三恒磨牙作为细胞来源也解决了其他技术采用胚胎来源而存在的伦理道德问题。
本发明还提供一种牙齿干细胞的制备方法，其特征在于该制备方法以人第三恒磨牙的牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙为牙齿干细胞的取材原料。
本发明所提供的牙齿干细胞的制备方法，是从人第三恒磨牙的牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙为牙齿干细胞取出部分组织，进行常规处理，进行细胞培养，从而得到牙齿干细胞。
具体的说，该方法可以包括以下步骤a)取出人第三恒磨牙的牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙的部分组织；b)清洗消毒后，将取得的组织剪碎，机械分离和离心处理后，在培养液中进行细胞原代培养；c)原代培养20～30小时后，更换培养液，继续培养、传代；d)细胞大部分融合后，以0.05～0.2％胰蛋白酶进行消化，同时使用吸管反复吹打，机械分离，继续培养，得到牙齿干细胞。
通常细胞传代过程中都使用较高浓度胰蛋白酶(0.5～2.0％)进行长时间的(10分钟)化学消化，但在此过程中经常出现细胞的损伤，本发明采用短时间低浓度化学消化(0.05～0.2％胰蛋白酶消化)而且消化时间不超过5分钟，结合机械手段进行消化过程可有效地避免细胞的损伤。
本发明利用第三恒磨牙牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙作为牙干细胞的来源材料，所得到的牙齿干细胞可以用于破损牙齿的修复，并可以在牙齿脱落后再生新的牙齿，修复后牙齿为活牙，具有生物特性优异的优点。本发明牙齿干细胞的制备方法，不仅在材料获得上更加方便可行，不存在胚胎干细胞所无法克服的伦理道德问题，而且更加简单方便。
具体实施例方式
以下将通过具体的实施方式来说明本发明，但是并不能用于限定本发明。
实施例1.干细胞的来源一名13岁男性，第二恒磨牙已萌出，第三恒磨牙尚未萌出，经X射线拍片证实第三恒磨牙牙胚已经形成，通过手术将预防性第三恒磨牙牙胚摘除，共获得4枚牙胚，在含100IU/ml的庆大霉素生理盐水中4℃条件下保存。
实施例2.干细胞的取材牙乳头标本的采集无菌条件下取材，将实施例1中获得的牙胚组织置于D-Hanks液中。使用含100IU/ml的庆大霉素进行冲洗，洗去组织残留的血污并消毒。在无菌条件下，切取牙乳头部位组织置于DMEM/F12培养基溶液中。
实施例3.干细胞的原代培养取材后12小时内进行细胞的原代培养。将取得的组织块剪碎，用吸管反复吹打，机械分离。1500rpm，离心10分钟。弃上清，加入含内皮细胞生长因子(ECGF)10ng/ml和10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，5％CO2、37℃培养。在35mm2塑料培养皿或25mm2培养瓶培养，调整细胞浓度为1～2×106/ml。
实施例4.细胞传代、筛选出人牙齿干细胞原代培养24小时后，弃去未贴壁的细胞，继续培养，每三天更换1次培养液，待细胞融合近90％皿底的时候以0.1％胰蛋白酶室温消化3分钟，同时使用Paspette管反复吹打，机械分离。1500rpm，离心10分钟，收集细胞悬浮于培养液分传3只培养瓶继续培养，从而得到人牙齿干细胞。
实施例5.牙齿干细胞的生物学特性检验形态学观察将实施例4得到的干细胞经过贴壁24小时后，在倒置显微镜下贴壁细胞成圆形，有小的胞质突起，72小时后大多数细胞有胞质突起。1周后以梭形细胞为主，胞质丰富，核大，于光镜下可见成纤维样细胞形态，细胞成平行排列生长或旋涡状生长。细胞生长旺盛，每周可以传代两次，每次按1∶3比例传代，此时细胞形态开始呈现短梭状，培养至第8代后有悬浮的圆形细胞出现，但再连续培养数代后悬浮的圆形细胞渐渐减少。
细胞周期相差显微镜观察发现体外培养的第10代细胞与成纤维细胞类似，进一步研究其细胞周期发现所培养的细胞中约10％处于S期、G2期和M期，其余90％则处于G0期、G1期。说明了细胞的高分化潜能。传代培养时，细胞表现出了高度的扩增能力。
细胞表型利用免疫组织化学和western blot方法研究，证明细胞有间叶系干细胞特有的两种蛋白(STRO-1和CD146/MUC18)。
分化的研究分别将实验室培养出的不同的干细胞克隆移植到一个羟基磷灰石(hydroxyapetite)载体上植入小鼠相应的位置，可产生出一个致密的牙本质和牙髓样结构，并与相应的上皮层发现出现成釉器样结构。
结论此细胞应为牙齿干细胞。
实施例6.另外个体的牙齿干细胞的培养一名20岁女性，双侧下颌第三恒磨牙已萌出但都发生阻生，左侧下颌第三恒磨牙已引发一次智齿冠周炎，通过手术行双侧下颌第三恒磨牙拔除，获得2枚牙胚。按照实施例2～4同样的方法进行处理和培养，经过实施例5的检测方法检验，得到相同的结果。
权利要求
1.一种牙齿干细胞，其特征在于，所述牙齿干细胞来源于人第三恒磨牙的牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙。
2.一种牙齿干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法以人第三恒磨牙的牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙为牙齿干细胞的取材原料。
3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤a)取出人第三恒磨牙的牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙的部分组织；b)清洗消毒后，将取得的组织剪碎，机械分离和离心处理后，在培养液中进行细胞原代培养；c)原代培养20～30小时后，更换培养液，继续培养、传代；d)细胞大部分融合后，以0.05～0.2％胰蛋白酶进行消化，同时使用吸管反复吹打，机械分离，继续培养，得到牙齿干细胞。
4.权利要求1所述的牙齿干细胞在修复破损牙齿上的应用。
5.权利要求1所述的牙齿干细胞在牙齿脱落后再生新牙齿上的应用。
全文摘要
本发明提供一种牙齿干细胞及其制备方法，所述牙齿干细胞来源于人第三恒磨牙的牙胚或者正在萌出的第三恒磨牙。本发明所得到的牙齿干细胞可以用于破损牙齿的修复，并可以在牙齿脱落后再生新的牙齿，修复后牙齿为活牙，具有生物特性优异的优点。本发明所提供的牙齿干细胞的制备方法，不仅材料获得上更加方便可行，不存在胚胎干细胞所无法克服的伦理道德问题，而且更加简单方便。
文档编号C12N5/08GK1896228SQ20051008301
公开日2007年1月17日 申请日期2005年7月12日 优先权日2005年7月12日
发明者叶庆良 申请人:叶庆良