专利名称：去酰基化头孢菌素的发酵生产的方法
技术领域：
本发明涉及N-去酰基化头孢菌素类化合物如7-ADCA的发酵生产的领域发明背景β-内酰胺类抗生素是抗生素类化合物中最重要的一组，具有很长的临床应用史。该组中杰出的代表是青霉素类和头孢菌素类。这些化合物分别由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和Acremoniumchrysogenum天然产生。
通过经典性菌株改良技术，在过去的数十年中产黄青霉和Acremonium chrysogenum中的抗生素生产水平大大提高。随着对青霉素类和头孢菌素类的生物合成途径知识的不断增加以及重组DNA技术的出现，出现了用于提高菌株产量和化合物体内衍生化的新工具。
参与β-内酰胺生物合成的大多数酶已经被鉴别，且其相应的基因已经被克隆。如Ingolia与Queener在医学研究综述(Med.Res.Rev.)9(1989)，245-264(生物合成路线和酶)，以及Aharonowitz，Cohen与Martin在Ann.Rev.Microbiol.46(1992)，461-495(基因克隆)中所述。
在产黄青霉中青霉素生物合成的头两步是三个氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)，L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩合形成一个三肽LLD-ACV，随后该三肽环化形成异青霉素N。此化合物含有典型的β-内酰胺结构。
青霉素生物合成的头两步在生产青霉素、头霉素和头孢菌素的真菌及细菌中是相同的。
第三步涉及异青霉素N的亲水性D-α-氨基己二酸侧链通过酰基转移酶(AT)的作用与L-5-氨基-5-羧基戊酸交换。通过AT调节的酶促交换反应发生在细胞的细胞器微体中，如EP-A-0448180中所述。
在产头孢菌素的生物中，第三步是异青霉素N在差向异构酶作用下异构化形成青霉素N，于是，青霉素类特征性的五元环结构通过扩环酶(expandase)的作用形成了头孢菌素类特征性的六元环结构。
仅通过直接发酵生产的具有工业意义的青霉素是青霉素V和青霉素G，它们分别是通过在产黄青霉发酵过程中添加疏水性侧链前体物质苯氧乙酸或苯乙酸而得到的，藉此由苯氧乙酸或苯乙酸取代了天然β-内酰胺类的侧链。
头孢菌素类比青霉素类要贵许多。一个原因就是一些头孢菌素(如头孢氨苄)是通过大量的化学转化由青霉素衍生而来的。至今在这方面仍是最重要的起始原料的头孢菌素C在任何pH条件下均易溶于水，这暗示着要应用繁重而昂贵的柱层析技术来进行时间更长、成本更高的分离过程。以这种方式获得的头孢菌素C又不得不通过大量的化学和酶学转化而形成具有治疗价值的其它头孢菌素。
目前通过青霉素G的化学衍生化生产头孢菌素的中间体7-ADCA。这个必需的生产7-ADCA的化学步骤包括了由青霉素五元环结构向头孢菌素六元环结构转化的扩环。
近来，已公开了获得7-ADCA的发酵方法。
在EP-A-0532341中己二酸(5-羧基戊酸)原料的应用表明可以形成一种带己二酰基侧链的青霉素衍生物，即己二酰基-6-氨基青霉烷酸。这种整合是由于酰基转移酶已被证实了的具有广泛的底物特异性(Behrens等人，生物化学杂志(J.Bid.chen)175(1948)，751-809；Cole，生物化学方法(Process Biochem.)1(1966)，334-338；Ballio等人，自然(Nature)185(1960)，97-99)。另外，当己二酸被加入到一种表达一种扩环酶的重组产黄青霉菌株中时，己二酰基-6-APA被扩环形成了其相应的头孢菌素衍生物。最终，建议将己二酰侧链消除，产生作为终产物的7-ADCA。
专利申请EP-A-0540210描述了一种相似的制备7-ACA的方法，包括将ADCA环的3-甲基基团转化成为ACA的3-乙酸基甲基基团的额外的步骤。
WO95/04148和WO95/04149公开了加入一种特定的含硫基团的二羧酸原料到表达扩环酶(expandase)的产黄青霉菌株中，使得这些前体物质被整合到青霉素骨架上并随后扩环形成了相应的7-ADCA衍生物。
然而，我们通常认为，在青霉素N和头孢菌素生物合成过程中提供至关重要的纽带的扩环酶应具有窄的特异性(Maea，等人，酶和微生物技术(Enyme and Micoobiol.Technology)(1995)17231-234；Baldwin等人，J.Chem.Soc.Chem.Commu.374-375，1987)，这样可以防止用非天然侧链催化青霉素N氧化性扩环的可能性。
现在令人惊讶地发现一种碳链长度大于7个碳原子的二羧酸原料产生一种β-内酰胺衍生物，该衍生物所整合的侧链长度为6或7个原子。
发明概述本发明公开了一种制备N-去酰基化头孢菌素类化合物的方法，该方法含有以下步骤*发酵一种微生物菌株，该菌株能产生β-内酰胺、且表达酰基转移酶和扩环酶活性，并且选择性的表达乙酰基转移酶和/或羟化酶活性，在有如分子式(1)的侧链前体物质存在下HOOC-X-(CH2)n-COOH(1)其中n是至少为2的偶数，且X是(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q各自独立地是0、1、2、3或4，且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，N原子选择性地被取代或者S原子选择性地被氧化，且B可以是H、卤素、C1-3烷氧基、羟基或选择性地取代的甲基，前提是当A是CH＝CH或C≡C时应满足p+q＝2或3，而当A是CHB、C＝O、O、S或NH时应满足p+q＝3或4，或者在该前体物质为一种盐、酯或酰的形式存在下，该侧链前体物质可产生一种酰基-6-APA衍生物。该酰基基团有如分子式(2)的结构
HOOC-X-CO-(2)其中X如上文所述，该酰基-6-APA衍生物在原位扩环形成相应的酰基-7-ADCA衍生物，并且选择性地进一步反应生成酰基-7-ADAC或酰基-7-ACA衍生物，*从发酵培养基中回收酰基-7-头孢菌素衍生物，*对该酰基-7-头孢菌素衍生物进行去酰基化处理，且*回收7-头孢菌素化合物的结晶发明详述本发明公开了一种制备N-去酰基化头孢菌素类化合物(7-ADCA，7-ADAC或7-ACA)的方法，其是通过应用了一种新的侧链前体物质原料对其酰基化对应物进行发酵生产来实现的。
本发明令人吃惊的是当碳链长度大于7个碳原子的二羧酸存在时，发酵能产生β-内酰胺、且表达酰基转移酶和扩环酶活性的微生物菌株，可形成一种所整合的酰基基团之碳链长度分别为6或7个碳原子的酰基-7-ADCA衍生物。
根据本发明，如果所用可产生β-内酰胺、且表达酰基转移酶和扩环酶活性的微生物菌株分别额外地表达羟化酶或羟化酶加乙酰基转移酶活性，那么除了产生酰基-7-ADCA外，还分别额外产生了7-酰基化头孢菌素衍生物，即酰基-7-ADAC或酰基-7-ACA。
本发明方法中所用二羧酸有如分子式(1)的结构HOOC-X-(CH2)n-COOH(1)其中n是至少为2的偶数，且X是(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q各自独立地是0、1、2、3或4，且应满足p+q＝2、3或4，且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，N原子选择性地被取代或S原子选择性地被氧化，且B是H、卤素、C1-3烷氧基、羟基或选择性地取代的甲基。
根据本发明，在如分子式(1)所示前体物质或其盐、酯或酰胺的形式存在下发酵该微生物菌株，结果形成了一种酰基-7-头孢菌素衍生物，其中该酰基基团有如分子式(2)所示的结构HOOC-X-CO-(2)其中X如上所述。
为了分别获得链长为6或7个碳原子的酰基的酰基-7-头孢菌素衍生物，当A是CH＝CH或是C≡C时，p+q应分别为2或3，而当A是CHB、C＝O、O、S、NH时，p+q应该分别为3或4，N原子选择性地被取代或S原子选择性地被氧化，且B如上所述。
因此，在如分子式(1)所示的前体化合物存在下，对可产生β-内酰胺、且表达酰基转移酶和扩环酶活性的微生物菌株进行发酵可得到带分子式(2)的酰基基团的一种酰基-6-APA衍生物，该衍生物随后原位扩环形成相应的酰基-7-ADCA衍生物。换言之，该前体物质(如分子式(1)所示)为该微生物菌株所代谢而产生分子式(2)的酰基。该酰基基团随后在酰基转移酶介导的作用下整合到β-内酰胺骨架中。
如分子式(1)所示的前体化合物的碳链长度的上限，即n的上限值并不关键。上限主要由代谢该前体物质的微生物菌株的效率决定。方便地，该前体物质可带的最大碳链长度与该微生物菌株所能代谢的脂肪酸的最长碳链长度相似。
在本发明的一个实施方案中，应用了二羧酸，在该二羧酸存在时发酵可产生一个己二酰基-7-ADCA衍生物。适于产生己二酰基-7-ADCA的二羧酸有如分子式(1)所示的结构，其中n是一个至少为2的偶数；且X是(CH2)p-A-(CH2)q，其中p是1且q是2，并且A是CH2。优选地，产生己二酰基-7-ADCA的二羧酸是辛二酸或葵二酸(n分别为2或4)。
在本发明的另一个实施方案中，应用了一种产生酰基-7-ADCA衍生物的二羧酸，该衍生物含有如分子式(2)所示含有一个硫基团的酰基基团。适于产生这种酰基-7-ADCA化合物的二羧酸有如分子式(1)所示的结构，其中n是一个至少为2的偶数，且X是(CH2)p-A-(CH2)q，其中A是S。优选地，p和q是1、2或3，且p+q＝3或4。最优选地，p是1且q是2，或者p是2且q是1或2。
在本发明的另两个实施方案中，应用了产生新的酰基-7-头孢菌素衍生物的二羧酸。
首先，应用了一种二羧酸，在该二羧酸存在下发酵可产生一种庚二酰基-7-ADCA衍生物。适于产生庚二酰基-7-ADCA的二羧酸有如分子式(1)所示的结构，其中n是一个至少为2的偶数，且X是(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q是2，且A是CH2。优选地，产生庚二酰基-7-ADCA的二羧酸是壬二酸(n＝2)。
另外，应用了产生一种酰基-7-ADCA衍生物的二羧酸，该衍生物含有如分子式(2)所示含有一种不饱和键的酰基基团。适于产生这种酰基-7-ADCA化合物的二羧酸有如分子式(1)所示的结构，其中n是一个至少为2的偶数，且X是(CH2)p-A-(CH2)q，其中A是CH＝CH或C≡C。优选地，A是CH＝CH，且p和q都是1。最优选地是后一化合物的反式异构体。
本发明方法中应用的微生物菌株是可产生β-内酰胺且可表达酰基转移酶和扩环酶活性的菌株。选择性地，该微生物菌株也可额外表达出羟化酶或羟化酶加乙酰基转移酶活性。前一种菌株可产生酰基-7-ADCA衍生物，而后者则可产生酰基-7-ADAC或酰基-7-ACA衍生物。
这样的微生物菌株的实例包括带有可提供扩环酶表达的表达盒的产青霉素菌株和带有可提供酰基转移酶表达的表达盒的产头孢菌素菌株。
易于应用的扩环酶基因可来源于Acremonium chrysogenum，带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)，抗生链霉菌(Streptomycesantibioticus)或Nocardia lactamdurans。酰基转移酶基因可来源于产黄青霉(P.chrysogenum)，纳地青霉(P.nalgiovense)或无冠构巢曲霉(A.nidulans)。
在一个优选的实施方案中，应用了一种重组地表达扩环酶的产青霉素真菌菌株。更优选的，应用了曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)的真菌。最优选的，应用了一种产黄青霉的菌株。产黄青霉菌株Panlabs P14-B10，DS18541(保藏于CBS，保藏号为455.95)是一种用于扩环酶表达的适合的宿主实例。
重组表达扩环酶的菌株的构建在本领域普通技术人员知识范围之内。一些可用于重组表达扩环酶的真菌菌株构建的表达盒的实例公开在EP-A-0532341，Crawford等人，(生物技术，(Biotechnol.)13(1995)，58-62)和WO 95/04148中。在选择转化的菌株时应注意选择一种扩环酶表达水平足够高的菌株。可通过测试它们产生己二酰基-7-ADCA的能力来选择这样的转化子。如Crawford等人(出处同前)中所述。
在另一个实施方案中，应用了一种重组地表达酰基转移酶的产头孢菌素菌株，例如一种产酰基转移酶的Acremonium chrysogenum菌株。由此，一种重组地表达酰基转移酶的A.chrysogenum菌株可产生一种酰基-7-ACA衍生物，因为这样一种菌株自身就可表达羟化酶和乙酰基转移酶。
本发明进一步描述了一种用特异性溶剂从根据本发明的微生物发酵的发酵培养基中例如从表达扩环酶的产黄青霉菌株的发酵培养基中回收酰基-7-ADCA衍生物回收酰基-7-头孢菌素衍生物的方法，例如酰基-7-ADCA衍生物，诸如己二酰基、庚二酰基、2-(羧基乙基硫代)乙酰基、3-(羧基甲基硫代)丙酰基或反式-β-氢化己二烯二酰基-7-ADCA的回收方法。
特别地，对发酵培养基滤液先用与水不混溶的有机溶剂在pH低于约4.5时萃取，再用pH为4-10之间的水溶液反萃取该有机相，从发酵培养基中回收得到7-酰基化头孢菌素衍生物。
过滤培养基后得到的滤液中加入与水不混溶的有机溶剂。为从水层萃取7酰基化头孢菌素衍生物调整滤液的pH值。该pH范围必须低于4.5；优选为pH4-1之间，更优选地在2-1之间。这样使7-酰基化头孢菌素衍生物从发酵培养基中许多其它杂质里分离出来。优选地应用较小体积的有机溶剂，例如相当与水层体积一半的溶剂体积，从而可得到7-酰基化头孢菌素衍生物的浓溶液，这样可使体积流率减小。第二种可能性是在pH为4或更低时对整个培养基进行萃取。优选地应用与水不混溶的有机溶剂在pH为4-1之间萃取培养基。
任何不影响头孢菌素分子的溶剂均可使用。适宜的溶剂是，如乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、醇类如丁醇等。优选地为正丁醇或异丁醇。
由此，7-酰基化头孢菌素衍生物可以用pH为4-10之间，优选地为6-9之间的水溶液反萃取。终体积再次减小。回收可在温度0-50℃之间进行，优选在室温中进行。
由本发明方法生产的7-酰基化头孢菌素衍生物在半合成头孢菌素的化学合成中方便地用作一种中间体，因为恰当的酰基侧链的存在充分地保护了7-氨基基团。
此外，7-酰基化头孢菌素衍生物可用合适的酶如假单胞菌SE83酰基转移酶在一步酶法中去酰基化。
为了可重复使用该酶，优选地使用固定化酶。这种颗粒制备和酶固定化的方法学在EP-A-0222462中已充分阐明。水溶液的pH值，为如pH4到pH9，这样可减少头孢菌素的降解反应，同时最适于期望的酶促转化。于是，当头孢菌素水溶液pH维持在合适水平时加入该酶。pH的维持可通过例如加入一种无机碱如KOH溶液，或应用一种阳离子交换树脂来实现。反应结束后可通过过滤移去固定化酶。另一种可能是在一种固定或流化柱床中应用固定化酶或在溶液中使用固定化酶且通过膜过滤移走产品。随后，在与水不混溶的有机溶剂存在下将反应混合物酸化。在pH调整为约0.1-1.5后分离两相，再将水层pH调整到2-5。过滤获得N-去酰基化头孢菌素结晶。
如先有技术所知，去酰基化亦可用化学方法进行，例如可通过在低于10℃的温度下加入五氯化磷，随后在室温或更低温度下加入异丁醇而形成偕氯代亚胺侧链来实现。
实施例1酰基-7-ADCA的发酵生产产黄青霉菌株Panlabs P14-B10(保藏于CBS，保藏号为455.95)用作扩环酶表达盒构建体的宿主菌株。
如Crawford等人(出处同前)所述所用的表达盒含有受产黄青霉IPNS基因转录和翻译调控信号所调控的扩环酶基因。转化和培养条件如Crawford等人(出处同前)所述。如Crawford等人(出处同前)所述，纯化转化子，且通过测试它们产生己二酰基-7-ADCA的能力来分析扩环酶的表达。
产酰基-7-ADCA的转化子以2×106个分生孢子/ml的浓度接种到一个种子培养基中，该种子培养基含有(g/l)葡萄糖，30；Pharmamedia(棉籽粉)，10；玉米浸液，20；(NH4)2SO4，20；碳酸钙，5；KH2PO4，0.5；乳糖，10；酵母提取物，10，灭菌前培养基pH为5.6。
该种子培养基(20ml，于250ml带棉花塞的Erlemeyer瓶中)在25℃以220转/分进行培养。48小时后，取1ml接种到15ml生产培养基上。该培养基含有(g/l)KH2PO4，0.5；K2SO4，5；(NH4)2SO4，17.5；乳糖，140；Pharmamedia，20；碳酸钙，10；猪油，10，灭菌前培养基pH为6.6。
在接种了种子培养基的生产培养基中加入了浓度为20％的所选前体物质原液(pH用KOH调整为6.5)，使其终浓度为0.5％。
生产培养基被装入一种以牛奶过滤器封口的250ml的Erlemeyer瓶中在25℃以220转/分培养168小时。每隔一天补充蒸发掉的水。
发酵生产结束后，通过离心或过滤除去菌丝体，并用HPLC分析酰基-7-ADCA。
实施例2酰基-7-ADCA生产的分析来自转化的青霉属菌株的发酵产物用高效液相色谱(HPLC)进行分析。该HPLC系统由下述成分组成P1000溶剂输送系统(TSP)，基本马拉松(basic marathon)型自动进样器(Spark Holland)(进样体积3)，UV150(TSP)可变波长检测器(设定为260nm)和一个PC1000数据系统。固定相是YMC pack ODS AQ柱(150×4.6mm)。流动相由下述物质组成pH为6.0的加入了0.17％硫酸氢四丁基胺的84％磷酸盐缓冲液和16％的乙氰。通过与预期的酰基-7-ADCA的标准曲线比较可定量发酵产物。
实施例3酰基-7-ADCA产物的鉴定在下列前体物质存在下己二酸、辛二酸、葵二酸、庚二酸和壬二酸，按照实施例1培养一种重组表达扩环酶的产黄青霉菌株。
对在己二酸、辛二酸和葵二酸存在下进行发酵得到的这些发酵产物按照实施例2的方法进行分析，结果表明形成了己二酰基-7-ADCA，而在给予庚二酸或壬二酸时形成庚二酰基-7-ADCA。
发酵期间若应用高浓度辛二酸(2.0％，而不是0.5％)，则除了己二酰基-7-ADCA之外，还能检测到少量但明显的辛二酰基-7-ADCA。
权利要求
1.一种制备N-去酰基化头孢菌素类化合物的方法，其包括以下步骤*发酵一种微生物菌株，该菌株能产生β-内酰胺、且表达酰基转移酶和扩环酶活性、并且选择性的表达乙酰基转移酶和/或羟化酶活性，在如分子式(1)所示的侧链前体物质存在下HOOC-X-(CH2)n-COOH(1)其中n是至少为2的偶数，且X是(CH2)p-A-(CH2)q，其中p是1或2，q是2，且A是CH2，或者在该前体物质为一种盐、酯或酰胺的形式存在下，该侧链前体物质产生一种酰基-6-APA衍生物，该酰基基团有如分子式(2)所示的结构HOOC-X-CO-(2)其中X如上所述，该酰基-6-APA衍生物在原位扩环形成相应的酰基-7-ADCA衍生物，并且选择性地进一步反应生成酰基-7-ADAC或酰基-7-ACA衍生物，*从发酵培养基中回收酰基-7-头孢菌素衍生物，*对该酰基-7-头孢菌素衍生物进行去酰基化处理，且*回收7-头孢菌素化合物的结晶。
2.权利要求1的方法，其中该侧链前体物质为辛二酸、葵二酸或壬二酸。
3.权利要求1或2的方法，其中微生物菌株是可提供表达扩环酶的表达盒的产青霉素菌株。
4.权利要求3的方法，其中产青霉素菌株是产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。
5.权利要求3或4的方法，其中结晶头孢菌素化合物是7-ADCA。
6.权利要求1或2的方法，其中微生物菌株是可提供表达酰基转移酶的表达盒的产头孢菌素菌株。
7.权利要求6的方法，其中产头孢菌素菌株是Acremoniumchrysogenum。
8.权利要求6或7的方法，其中结晶头孢菌素化合物是7-ACA。
全文摘要
本发明公开了一种通过对N－去酰基化头孢菌素类化合物的7－酰基化对应物进行发酵生产而制备N－去酰基化头孢菌素类化合物的方法。
文档编号C12N9/02GK1706963SQ20051008234
公开日2005年12月14日 申请日期1998年4月22日 优先权日1997年4月22日
发明者M·尼博尔, E·德弗鲁姆, J·卢格特布格, D·希珀, A·W·H·沃勒里特, R·A·L·伯韦比格 申请人:吉斯特-布罗卡迪斯有限公司