一种SMCY性别特异融合抗原及其抗体和应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，涉及一种抗原，具体来说是一种SMCY性别特异融合抗原及其抗体和应用。

背景技术：

刑事案件急需我们通过快速识别现场物证特征，为快速侦破刑事案件提供技术支撑。目前性别鉴定主要使用核酸检测的方法，但该检测方法费时费力，甚至还会错失破案良机，因此需要现场快速的性别鉴定方法。

H-Y抗原是由Y染色体编码的、雄性动物特有的组织相容性抗原，是由Eichwald和Silmser在用纯系小鼠进行异体皮肤移植试验时首次发现的。H-Y抗原属于一类次要组织相容性复合物，区别于主要组织相容性复合物，H-Y抗原在同基因型雌雄个体之问的移植会有排斥反应。Shapiro M等通过抗血清吸附试验证明，血清学检测到的H-Y抗原的抗原决定簇是一种糖类。同时采用间接免疫荧光法发现，H-Y特异性荧光出现在细胞膜上，说明H-Y抗原为一种膜抗原，提示H-Y在哺乳动物中存在于所有含有Y染色体的雄性细胞表面。不同的发明者在对患者体内的T淋巴毒细胞进行发明时,发现了一系列的H-Y抗原的候选基因。1995年Scott等对呈H-Y抗原阴性的小鼠基因进行分析时，在Y染色体长臂发现一个保守的基因,具有广泛的组织表达性,命名为SMCY。该基因与X染色体上的SMCX具有非常高的同源性，男性的SMCY产物可诱发女性细胞对H-Y抗原的排斥。但是，在SMCY有些氨基酸区段与SMCX中相应区段存在较大差异，针对这些差异性肽段进行深入发明在性别鉴定中具有非常重要的意义。

H-Y抗原(histocompatibility antigen Y)由Y染色体编码，为雄性动物特有的组织相容性抗原，是结合在细胞表面的糖蛋白，在哺乳动物中存在于所有含有Y染色体的雄性细胞表面。在雄性个体中无组织和器官特异性。H-Y抗原属于弱组织相容性抗原，参与器官移植、血液移植和妊娠反应中特异性免疫反应。有发 明结果表明，从移植抗宿主疾病的患者中分离出来的H-Y抗原肽可以与MHC分子结合，细胞毒性T淋巴细胞技术利用这一特性来鉴别不同H-Y抗原肽。国内外许多实验室利用H-Y抗血清或单抗进行了大量的早期胚胎的性别鉴定的工作，并取得了初步的成效。SMCY(selected mouse cDNA on Y)是第一个确定的H-Y抗原候选基因，只在雄性组织中都表达，编码1500个氨基酸序列。序列比对分析结果显示SMCY与X染色体上的SMCX有很高的同源性，但是仍然有超过200个氨基酸与X染色体上的SMCX不同，有可能产生性别特异性肽段。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种SMCY性别特异融合抗原及其抗体和应用，所述的这种一种SMCY性别特异融合抗原及其抗体和应用要解决现有技术中使用核酸检测性别的方法费时费力的技术问题。

本发明提供了一种重组抗原(SMCY)，其含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

进一步的，由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成，所述的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列之间无连接片段，所述的EQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列之间具有一个连接片段，所述的连接片段由两个或者三个丝氨酸组成。

本发明还提供了编码上述重组抗原的核苷酸序列。

本发明还提供了一种包涵体，含有上述的重组抗原。

本发明还提供了一种载体，含有编码上述重组抗原的核苷酸序列。

本发明还提供了一种多克隆抗体，由上述的重组抗原免疫产生。

本发明还提供了一种胶体金快速检测性别的试纸条，含有上述的重组抗原和上述的多克隆抗体。

进一步的，所述的胶体金快速检测性别的试纸条包括一个背板，所述的背板的上侧的一端设置有一个样品垫，背板的上侧的另外一端设置有一个吸水垫，在所述的样品垫和吸水垫之间设置有一个纤维素膜，吸水垫和所述的纤维素膜紧密连接，在样品垫和纤维素膜之间设置有一个金标垫，所述的样品垫、金标垫和纤维素膜之间紧密连接，在纤维素膜上靠近吸水垫的一端设置质控线，所述的质控线上包被有上述的重组抗原，在所述的质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检 测线，所述的检测线上设置有上述的多克隆抗体，所述的金标垫上设置有胶体金标记的探针，所述的纤维素膜的一端设置在所述的金标垫的下侧，所述的金标垫的一端设置在所述的样品垫的下侧，所述的金标垫中的胶体金标记探针是以上述的重组抗原作为抗原免疫兔获得的多克隆抗体。

进一步的，所述的纤维素膜选自硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述的支持胶体金标记探针的金标垫选自玻璃纤维膜或聚脂膜，所述样品垫选自滤血膜、玻璃纤维或吸水纸，所述吸水垫为吸水纸。

本发明还提供了上述的一种重组抗原在鉴定人类性别中的用途。

本发明将针对人类SMCY抗原的氨基酸序列，筛选与SMCX具有较大差异性的片段，运用分子生物学的方法将其连接在一起，形成一个新的SMCY基因重组体，与SMCX的同源性显著降低，从而提高SMCY性别特异融合抗原的雄性特异性。SMCY基因重组体进行原核表达，并以纯化的抗原免疫动物制备抗体，在获得特异性抗体的基础上建立双抗体夹心ELISA检测技术，并初步建立一种通过检测人类生物样本的SMCY抗原并进行性别判定的现场快速检测方法。

本发明为了建立现场快速性别鉴定方法，针对人类SMCY抗原的氨基酸序列，筛选出与SMCX具有较大差异性的三个片段，即片段1：256-293aa，片段2：814-845aa，片段3：1467-1560aa。运用分子生物学的方法将其连接在一起，形成一个新的只编码这三个片段的SMCY基因重组体，与SMCX的同源性显著降低，从而大大提高了SMCY性别特异融合抗原的雄性特异性。然后进行原核表达，获得在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达的SMCY性别特异融合抗原，通过镍柱亲和层析纯化得到的目的蛋白纯度为90％以上，并以此纯化的抗原免疫纯种大白兔成功制备了多克隆抗体，Western印记检测结果显示表达的融合蛋白可与多抗发生特异性结合，ELISA检测500倍酶稀释的效价为10⁶，抗原最低检测线为1ng；1000倍酶稀释的效价为2×10⁶，抗原最低检测线为2ng。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明建立了基于性别特异SMCY抗原的胶体金快速检测试纸条，采用胶体金免疫层析技术的双抗体夹心检测方法，在金标垫上包被胶体金标记的SMCY兔多抗，用于定性检测血清或血浆样品中的SMCY蛋白。经过对随机男女血清样本的检测，本胶体金快速检测试纸条基本可以区分男性和女性血清样本；另外，经过对雌雄性小鼠血清样本进行检测，结果无反应，说明SMCY性别特异融合抗原具有种属特异性，本试剂 条适用于人类样本性别的鉴定。

附图说明

图1显示了SMCY和SMCX氨基酸序列差异区段。

图2显示了性别特异融合抗原B细胞表位分析。

图3显示了pET-28a/SMCY表达质粒构建示意图。

图4是PCR扩增产物电泳鉴定图，其中M.DL2000DNA标志物；1.SMCY融合区段的编码基因(516bp)。

图5是SMCY融合抗原SDS-PAGE电泳鉴定图，1.全菌；2.超声破碎上清；3.超声破碎沉淀；4.Ni柱纯化抗原；M.蛋白相对分子质量标志物。

图6.显示了多克隆抗体制备流程。

图7显示了纯化后的多克隆抗体，M.蛋白相对分子质量标志物；1.纯化后多抗。

图8是Western Blotting实验结果，1.0.1mg/ml SMCY抗原；2.0.05mg/ml SMCY抗原；3.0.02mg/ml SMCY抗原。

图9是双抗体夹心检测法示意图。

图10显示了检测结果。

图11是30例男性血清样本检测结果。

图12.是男性血清样本阳性检测结果。

图13是20例女性血清样本检测结果。

图14是小鼠血清样本检测结果。

具体实施方式

实施例1 SMCY序列比对与分析

如图1所示，从NCBI上查询并下载了SMCY和SMCX三个变体的氨基酸序列，利用序列分析软件将SCMY(1539aa)与SMCX variant 1(1560aa)、variant2(1379aa)、variant 3(1559aa)分别进行序列比对，发现了三段差异片段：

片段1：256-293aa(DKTVHKKVTCPPTVTVKDEQSGGGNVSSTLLKQHLSL)；

片段2：814-845aa(RLKNCLSEVEACIAQVLGLVSGQVARMDTPQL)；

片段3：1467-1560aa(QKVDQGRNVENLVQQELQSKRAR SSGIMSQVGREEEHYQEKADRENMFLTPSTDHSPFLKGNQNSLQHKDSGSSAACPSMPLLQLSYSDEQQL)。

利用BIOSUN软件对差异区段融合抗原进行B细胞表位分析(图2)，结果显示融合抗原仍维持了原有的B细胞表位，并且具有较好的抗原性。

实施例2 SMCY基因差异区段的合成

根据三段差异片段的氨基酸序列，反推核酸序列，并进行密码子优化，根据核酸序列设计引物，然后运用分子生物学的搭桥法，通过多轮PCR，将合成的引物一步步连接起来，形成一个新的只编码这三个片段的SMCY基因重组体：

由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成，所述的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列之间无连接片段，所述的EQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列之间具有一个连接片段，所述的连接片段由两个或者三个丝氨酸组成。

与SMCX的同源性显著降低，从而大大提高了SMCY性别特异融合抗原的雄性特异性。将该基因进行测序，选取序列完全正确的基因作为目的基因进行后续实验。

设计的引物序列如下(如SEQ ID NO.4～23)所示)

1F3：GCGGATCCGATAAAACCGTGCATAAGAAAGTTACGTGCCCGCCAACTGT

1F2：CGTGCCCGCCAACTGTGACCGTCAAAGACGAACAGAGCGGCGGTGGCAACG

1F1：AGCGGCGGTGGCAACGTTTCTTCCACTCTGTTGAAGCAACACCTGTCGTTA

1R1：CACGCTTCTACCTCGCTAAGACAATTTTTCAGACGTAACGACAGGTGTTGC

1R2：CCTGGCCACTAACGAGACCCAGCACCTGGGCAATGCACGCTTCTACCTCGC

1R3：GCTCTAGACAGTTGCGGCGTATCCATGCGCGCGACCTGGCCACTAACGAG

2F4：GCACTAGTCAGAAAGTGGATCAAGGCCGTAACGTTGAAAATCTGGTGCA

2F3：TTGAAAATCTGGTGCAGCAGGAGTTGCAAAGCAAGCGCGCGCGTTCTTCCGG

2F2：GCGCGCGTTCTTCCGGTATTATGTCGCAGGTCGGCCGCGAAGAAGAGCATTA

2F1：GCGAAGAAGAGCATTATCAGGAAAAAGCCGACCGTGAAAACATGTTTCTGAC

2R1：TTACCTTTTAAGAATGGACTGTGATCCGTGCTCGGGGTCAGAAACATGTTTT

2R2：CTGCTGCCCGAATCCTTATGCTGCAGAGAGTTTTGATTACCTTTTAAGAATG

2R3：AGCTGGAGCAGTGGCATAAGAGACGGGCATGCCGCGCTGCTGCCCGAATCCT

2R4：GCGAATTCCAGCTGTTGCTCGTCCGAGTAGGACAGCTGGAGCAGTGGCA

F1：AGCGCGCAGGATCTGCGTGGATCCGATAAAACCGT

F2：AGCGCGCAGGATCTGCGT

R1：GCTCTAGACAGCTGTTGCTCGTCCGAGTA

F3：GCACTAGTGATAAAACCGTGCATAAGAAAGT

R2：AAGGCAACAATCACAGAGGAATTCCAGCTGTTGCTCGT

R3：AAGGCAACAATCACAGAG

实施例3 SMCY融合抗原载体的构建与表达

选取序列完全正确的融合区段抗原基因经一次重复后用BamH1、EcoR1双酶切，回收切下的目的片段(约516bp)，再与经BamH1、EcoR1双酶切的pET-28a载体用T4连接酶连接，构建重组表达质粒pET-28a/SMCY(图3，图4)。然后转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，挑取阳性克隆菌落，接种含卡那霉素的LB培养液，待生长至对数期后，加入IPTG，37℃诱导过夜，收集菌液，SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达情况。结果显示SMCY性别特异融合抗原以包涵体方式表达，相对分子量约为43KD(图5)。

实施例4 SMCY融合抗原的提取与纯化

表达菌经大样发酵后，收集菌液，超声波破碎法从表达菌中提取包涵体，并用溶解液(25mmol/LTE、1％β-巯基乙醇、8mol/L脲，pH8.5)将其溶解，收集样品进行Ni柱纯化，用洗涤缓冲液(25mmol/L TE、1％β-巯基乙醇、6mol/L脲，pH8.5)洗涤柱体，SMCY样品上样过柱。上样结束后用含25mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗脱杂蛋白，最后用含250mmol/L咪唑洗涤缓冲液洗脱并收集目的蛋白，最后SDS-PAGE电泳分析所收集的各洗脱峰及上样前的样品(图5)。

实施例5 多克隆抗体制备和纯化

用纯化后的SMCY融合抗原免疫新西兰大白兔，首次免疫前取血作为阴性对照，皮下多点注射法进行免疫，经过初免、二免和加强免疫，每次免疫间隔一个月，制备抗SMCY抗原多克隆抗体(图6)。第三次免疫后心脏取血，离心收 集血清，利用 Antibody purification-G kit试剂盒对其进行纯化，过柱后得到纯化后SMCY多克隆抗体(图7)，经检测浓度为3.1mg/ml，成功制备了多克隆抗体，并可以进行后续实验。

实施例6 多克隆抗体特异性和反应性鉴定

将纯化的SMCY抗原(1.0mg/ml)按照10×、20×、50×进行稀释，使终浓度分别为0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.02mg/ml，加入3×样品稀释液，煮沸5min，上样量为10ul，浓度为15％，电压为160V，进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后取出凝胶，安装转膜装置，以滤纸，NC膜，凝胶，滤纸的顺序逐张叠放对齐，避免产生气泡。转膜条件为4℃，300mA电转移2h。取出NC膜，裁剪至合适大小，用含5％脱脂奶粉的TBST室温下封闭1h；加入H-Y多克隆抗体(1:6000稀释)，4℃振荡孵育过夜；TBST洗膜3次，每次8min。加入对应的HRP标记的山羊抗兔IgG(1:2000稀释)，室温下振荡孵育1h。TBST洗膜3次，TBS洗膜1次，每次8min，化学发光A、B液(ECL)以1:1比例混合后，将膜浸入显色液，1min后于发光显色仪中显色并拍照。结果显示所制备的多克隆抗体可以特异性识别免疫用的抗原(图8)。

实施例7 多克隆抗体反应效价的测定

多抗标记HRP：取纯化的SMCY抗体2mg于透析袋，pH9.6碳酸盐缓冲液透析过夜。取2mg HRP溶于0.2mL双蒸水中，加入新配置的0.06M NaIO₄水溶液0.2mL，混匀后避光搅拌20min。加入0.16M的乙二醇水溶液0.2mL，室温避光放置30min，加入2mg透析好的SMCY抗体水溶液，混匀后透析6h。取出加入5mg/mL的NaBH₄溶液0.2mL，4℃放置2h，按1:1加入甘油后保存。

双抗体夹心ELISA方法的建立(图9)：用包被液将SMCY抗体稀释成5μg/mL的浓度包被酶联板，4℃包被过夜。将SMCY板洗板两次后拍干，加110μL封闭液封闭5h，拍干后室温风干。加样品稀释液稀释1mg/ml的SMCY抗原，稀释倍数为：100，500，1000，2000，4000，8000，16000，32000，64000，1.282×10⁵，2.56×10⁵，5.12×10⁵，1×10⁶，2×10⁶，4×10⁶，8×10⁶，1.6×10⁷，3.2×10⁷，6.4×10⁷，1.28×10⁸，2.56×10⁸，5.12×10⁸，1×10⁹，加样后加37℃反应30min。洗板5次后拍干，分别加酶标抗体，37℃反应20min。洗板5次 后拍干，显色剂A液B液各50μL，充分混匀，37℃避光反应10分钟。加入终止液50μL，10分钟内测定OD值，检测双波长为450nm/630nm。检测结果为SMCY抗体效价分别为：500倍酶稀释的效价为10⁶，抗原最低检测线为1ng；1000倍酶稀释的效价为2×10⁶，抗原最低检测线为2ng。

实施例8 基于性别特异SMCY抗原的胶体金快速检测试纸条的研制

双抗体夹心检测方法采用胶体金免疫层析技术，在金标垫上包被胶体金标记的SMCY兔多抗，用于定性检测血清或血浆样品中的SMCY蛋白。检测男性样品时，样品中的SMCY蛋白与胶体金标记的SMCY兔多抗结合，形成复合物，由于层析作用复合物及样品在硝酸纤维素膜内部向前流动。当复合物经过T线时与包被的SMCY兔多抗结合，形成“Au—兔多抗—SMCY蛋白—兔多抗”而凝集显色，剩余的胶体金标记SMCY兔多抗与C线中的SMCY蛋白结合而凝集显色。检测女性样品时，样品中不含SMCY蛋白，因此不能形成复合物，则只在C线处有显色。

制备胶体金：取0.8g柠檬酸三钠溶于5mL双纯水中；取1.2L双纯水加入圆底烧瓶中用电热套加热煮沸5min；取2.4mL氯金酸加入上述煮沸的双纯水中，煮沸5min；将溶解好的柠檬酸三钠溶液一次性加入氯金酸溶液中，煮沸10min；自然冷却至室温。

金标SMCY兔多抗：纯化的SMCY兔多抗经过PH9.6的CB透析48h；取制备好的胶体金溶液1mL，分别向其中加入15、20、25、30μL 0.1mol/L K₂CO₃溶液调节PH；向上述溶液中分别加入15μL 1.0mg/mL的SMCY兔多抗溶液，充分混匀静置30min；继续向上述溶液中加入100μL 10％BSA溶液，充分混匀后静置20min；不同PH的金溶液分别加入100μL 10％氯化钠溶液，观察是否变蓝而沉淀，结果选择最优组25μL 0.1mol/L K₂CO₃溶液调节PH；取制备好的胶体金溶液10mL，分别向其中加入250μL0.1mol/LK₂CO₃溶液调节PH；向上述溶液中分别加入150μL 1mg/mL的纯化SMCY兔多抗溶液，充分混匀静置30min；继续向上述溶液中加入200μL 10％BSA溶液，充分混匀后静置20min；将上述溶液4℃离心，14,000r/min离心30min；弃去上清液后加入6.0mL重悬液，超声2min混匀；Fusion5胶体金垫上涂金后，50℃过夜烘干。

包被SMCY兔多抗：SMCY兔多抗经过PH9.6的CB透析48h，包被条件为 PH9.6的50mM CB稀释兔多抗包被浓度为1mg/mL；NC膜上滑膜仪的速度为1μL/cm，划线略下，为T线。

包被质控线：包被SMCY蛋白，蛋白经过PH9.6的CB透析48h，包被条件为PH9.6的50mM CB稀释蛋白包被浓度为1mg/mL；NC膜上滑膜仪的速度为1μL/cm，划线略上，为C线。

检测步骤：

检验前准备：100μL微量移液器及配套枪头若干。

检验过程：将检测卡置于干燥的水平工作台上，用微量移液器向检测卡的加样孔内加入50μL待测血清或血浆样品，然后加入50μL样品稀释液(约两滴)，加入样品后计时，15至20分钟内观察结果。

检测过程注意事项：①本试剂盒与待测样品均放置于室温环境下至平衡后才可使用于检测；②检测卡开封后30分钟内使用；③20分钟后观察结果无效。

检测结果的解释(图10)：C线、T线均显色：阳性；仅C线显色：阴性；仅T线显色：无效；C线、T线均不显色：无效。

实施例9 样本检测结果

一、人类血清样本检测结果

随机选取人类血清样本50例，其中男性30例，女性20例，按照上述检测步骤进行检测，结果显示如表1、图11、图12和图13。男性血清样本反应性明显强于女性血清样本；男性30例血清样本中有27例呈现阳性反应，阳性率为90.0％；女性20例血清样本中仅3例呈现可疑结果，其余均为阴性反应。

表1.血清样本检测结果

二、小鼠血清样本检测结果

随机选取成熟BALB/c小鼠血清样本4例，其中雄性2例，雌性2例，按照上述检测步骤进行检测，结果显示如图14。雄性和雌性小鼠血清样本均无反应，说明本试剂盒适用于鉴定人类样本的性别，与小鼠无交叉反应。