127] 本发明还设及上述多核巧酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋 白质片段、类似物和衍生物。此多核巧酸的变异体可W是天然发生的等位变异体或非天然 发生的变异体。运些核巧酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域 所知的，等位变异体是一个多核巧酸的替换形式，它可能是一个或多个核巧酸的取代、缺失 或插入，但不会从实质上改变其编码多肤的功能。
[0128] 如本文所用，术语"引物"指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能W其为 起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核巧酸的总称。引物可W是天然的RNA、DNA，也可 W是任何形式的天然核巧酸。引物甚至可W是非天然的核巧酸如LNA或ZNA等。引物"大 致上"（或"基本上"）与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一 条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3' 端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，运样的引物仍大致上与模板 互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可W与模板形成引 物-模板复合物，从而进行扩增。
[0129] 根据本发明提供的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本 发明的融合蛋白。运些方法例如但不限于：重组DNA法，人工合成等。
[0130] 本发明融合蛋白的元件（如IL12或CD62L)的核巧酸全长序列或其片段通常可W 用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核巧 酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的CDNA库或按本领域技术人员已知 的常规方法所制备的CDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行 两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 阳131] -旦获得了有关的序列，就可W用重组法来大批量地获得有关序列。运通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0132] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0133] 应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引 物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方 法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
[0134] 本发明也设及包含本发明的多核巧酸的载体，W及用本发明的载体或融合蛋白编 码序列经基因工程产生的宿主细胞，W及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
[0135] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核巧酸序列可用来表达或生产重组 蛋白。一般来说有W下步骤：
[0136] (1).用本发明的编码本发明蛋白的多核巧酸（或变异体），或用含有该多核巧酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞； 阳137] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0138] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0139] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适 的转录/翻译控制信号的表达载体。运些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内 重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，W指导mRNA合成。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0140] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，W提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氨叶酸还原酶、新霉素抗性W及绿色巧光蛋 白（GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨节青霉素抗性。 阳14U包含上述的适当DNA序列化及适当启动子或者控制序列的载体，可W用于转化适 当的宿主细胞，W使其能够表达蛋白质。 阳142] 宿主细胞可W是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是局 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞 如酵母准物细胞；果蛹S2或S巧的昆虫细胞；C册、COS、或293细胞的动物细胞等。
[0143] 一种特别优选的细胞为人和非人哺乳动物的细胞，尤其是免疫细胞，包括T细胞、NK细胞。
[0144] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用化Clz法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgClz。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：憐酸巧共沉淀法，常规机械方 法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0145]获得的转化子可W用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肤。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如溫度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。 阳146]在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果 需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。运些方法是 本领域技术人员所熟知的。运些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀 剂处理（盐析方法）、离屯、、渗透破菌、超处理、超离屯、、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、 离子交换层析、高效液相层析OffLC)和其它各种液相层析技术及运些方法的结合。 阳147]经修饰的免疫细胞
[0148] 本发明还提供一种表达本发明所述融合蛋白的免疫细胞（简称为"本发明免疫细 胞"），所述免疫细胞在细胞表面携带所述的融合蛋白。
[0149] 在本发明中，至少一部分或全部所述的融合蛋白位于所述免疫细胞的细胞膜上， 并且所述的第一蛋白元件即IL-12蛋白元件位于胞外。
[0150]一类优选的免疫细胞包括人的T细胞。优选地，所述的T细胞表面携带MRT-I TCR。 阳151]例如，在一个优选例中，提供了一种慢病毒表达体系基因修饰的T细胞，该T细 胞表达抗肿瘤TCRa-cellrec巧tor)同时表达CD62LhscIL-12(人源单链IL-12)及 hscIL-12/CD6化融合蛋白。 阳152]药物组合物及施用方法 阳153]本发明还提供了一种组合物，它含有（a)有效量的本发明融合蛋白和/或有效量 的本发明的免疫细胞，W及药学上可接受的载体。
[0154]通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体 介质中，其中抑通常约为5-8,较佳地，抑约为6-8。
[0K5]如本文所用，术语"有效量"或"有效剂量"是指可对人和/或动物产生功能或 活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0. 〇〇l-99wt% ;较佳的0. 01-95wt% ;更佳的， 0.I-QOwt%O
[0156]当本发明的药物组合物含有免疫细胞时，"有效量"或"有效剂量"是指 1X1〇3-1X1〇7个所述的免疫细胞/ml。 阳157]如本文所用，"药学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良 副反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上 可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0158] 本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白W及药学上可接受的 载体。运类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通 常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可W被制成针剂形式，例如用生理 盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无 菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
[0159] 本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。 优选的有效量的选择可W由本领域普通技术人员根据各种因素来确定（例如通过临床试 验）。所述的因素包括但不限于：本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代 谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径 等。通常，当本发明的融合蛋白每天W约5mg-20mg/kg动物体重（较佳的5mg-10mg/kg动 物体重）的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予 若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0160] 本发明融合蛋白特别适合用于治疗肿瘤等疾病。代表性的肿瘤包括（但并不限 于）：大肠癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、膜腺癌肿瘤。
[0161] 本发明的主要优点包括： 阳162] (a)本发明的融合蛋白对于T细胞无明显毒性；
[0163] 化）本发明的融合蛋白通过在T细胞攻击肿瘤时通过局部和定点和定时释放的 IL-12,从而有效改变T细胞-肿瘤组织的免疫微环境，进而非常有效地抑制肿瘤，并显著降 低毒副作用。
[0164] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork=ColdSpringHarbor UboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 阳1化]材料和通用方法
[0166]所用引物及DNA序列均由Invitrogen公司合成。 阳167] 本发明实施例所使用的质粒LVV的图谱如图5所示，为含有目的基因的工程载体 pLenti-MSCV，该载体由MSCV做为启动子，是最优化的可W有效转导T细胞的启动子；包膜 蛋白质粒pMD2.G含有VSV-G;gag/pol辅助质粒；及pRev质粒系统。所使用的质粒pRRLSIN. cPPT.MSCV/GFPJ93FT细胞为市售商品，所使用的试剂亦为市售商品。
[0168]肿瘤细胞及T细胞的培养 阳169] 肿瘤细胞938和526为常规的黑色素瘤细胞株（由美国国立癌症研究院的 Dr.Rosenberg所赠），体外传代培养条件为含10%FCSRPMI培养基，每2-3天通过0. 25% 的膜酶传代培养。两种肿瘤均表达MRT-I抗原，其中938为MHCIA2-(阴性），526为MHC IA2+(阳性），基因修饰的抗肿瘤MRT-IT细胞只识别A化细胞株，即526细胞。 阳170] PBMC来自健康人外周血，用CD3/CD28磁珠或CD3抗体刺激T细胞生长1天，并在 IL-2 (lOOIU/ml)的X-VIVO培养基