，CD6化和 hsc]X-12通过连接肤进行连接。 阳202] T细胞通过两次转导即MRT-ITCR(第一天）及图示中S个载体的序贯转导（第 10天），于第14天，通过流式细胞仪检测T细胞表面CD6化的表达及膜表面hsc比-12的表 达。 阳203] 结果如图5所示。利用第=代慢病毒载体表达CD62L/IL-12融合蛋白，所选 用的启动子为MSCV，已经被广泛地应用于人体的肿瘤免疫细胞治疗，具有表达的稳定 性及安全性，表达基因构件可W替代为需要表达的基因，即CD62L，MRT-I TCR W及 ]X-12/CD62L融合蛋白等。该载体的5'及3' LTRdong terminal repeat)被改造成 SIN-LTR(self-inactivating-LTR),目的是降低慢病毒重组的机率，增强安全性能，联合 WPRE终止RNA转录的功能，是目前广泛应用于临床的最新一代的基因工程载体结构。人源 CD62Lhsc比-12化uman single chain比-12)及CD62L/hsc比-12的重组基因中，hsc比-12 融合了IL-12的分泌肤（lead seq)，通过基因克隆方法连接到慢病毒表达载体中，CD6化和 hsc比-12通过肤段SGSG链接。T细胞通过两次转导即MRT-ITCR(第一天）及图示中S个 载体的序贯转导（第10天），于第14天，通过流式细胞仪检测T细胞表面CD62L的表达及 膜表面hsc比-12的表达。实验数据显示，CD6化可W大量表达于抗肿瘤T细胞表面，膜细胞 表面的IL-12只有在表达IL-12/CD62L的融合蛋白组中可W检测出来，分泌型的IL-12膜 表面没有表达，充分验证了图4所示的机制。 阳204] 如图4所示，本发明的机制如下：比-12通过CD6化从膜表面的切割及释放，且说 明该种释放是肿瘤免疫应答所依赖的。根据该效应机制，释放的具有生物活性的IL-12能 够增加抗肿瘤T细胞的抗肿瘤反应，改善局部肿瘤免疫的微环境，实现优化的抗肿瘤免疫 反应。 阳205] 实施例6 阳206] IL-12/CD6化融合蛋白的增强免疫反应效应及肿瘤抗原依赖性的IL-12释放
[0207] T细胞序贯转导抗肿瘤TCR及CD62LASC比-12融合蛋白20天后，与肿瘤细胞526 及938共培养，24小时后，上清中IFN丫及IL-12表达水平通过化ISA试剂盒检测。 阳20引结果如图6所示。慢病毒载体hsc比-12/CD6化转导的T细胞与肿瘤共培养可W增 强IFN丫的表达水平及肿瘤抗原依赖的释放IL-12。T细胞序贯转导抗肿瘤TCR及CD62L/ hsc比-12融合蛋白20天后，与肿瘤细胞526及938共培养，2地后，上清中IFN丫及IL-12 表达水平通过化ISA试剂盒检测。正如预测的一样，经过IL-12可溶性基因修饰的抗肿瘤T 细胞，同膜表面的比-12/CD6化基因修饰的一样，与抗肿瘤T细胞组相比较，都可W显著增 加IFN丫的分泌水平，并且具有显著的统计学上的差异。本发明进一步证实，只有比-12/ CD6化组的IL-12的切割及释放与肿瘤抗原的激活相关，可溶性的IL-12的持续分泌不受肿 瘤抗原的调控，维持在较高的水平。同时本发明也观察到，膜表面切割及释放的IL-12水平 比持续分泌的IL-12的水平低，我们预测该发明具有较高的安全性及临床可操作性。 阳209] 实施例7
[0210] IL-12/CD6化基因修饰的抗肿瘤T细胞的显著体内抑瘤效果 悦11] 实验方法：雌性pmel小鼠（每组7只小鼠）通过B16F10细胞植入烦内（IC)S天， 细胞回输前1天小鼠接受5Gy全身放疗。鼠的T细胞取自小鼠的脾脏细胞，利用lOug/ml的刀豆蛋白（ConA)在IL-2巧lU/ml)存在的条件下活化；第2天，用图示中慢病毒载体转 导T细胞，然后继续培养6天，收集细胞，通过小鼠尾静脉注射（IV) 5XIO6个T细胞。DC组 小鼠的DC细胞取自骨髓细胞，经过体外诱导分化成熟8天，通过腹腔接种IX1〇6细胞。DC 和T细胞的各组说明见图7右边标识。星号表示该实验组与其它组比较，p<0. 001。 阳212] 结果如图7所示。慢病毒载体hsc比-12/CD6化转导鼠T细胞介导的细胞回输治 疗显著延长荷瘤小鼠的生存。 阳213] 实施例8
[0214]IL-12/CD6化基因修饰的抗肿瘤T细胞的安全性
[0215] 实验方法：T细胞序贯转导抗肿瘤TCR及CD62LASC比-12融合蛋白14天后，各组 细胞与对照转导组（T-cell)的扩增倍数比较，转导持续分泌hsclkl2组较其它各组的扩 增倍数显著降低，p<0.001。其中，转导hsc比-12/CD6化融合蛋白组同其它组比较扩增倍数 相同，未见显著差异。数据分析采用设定T-cell组的扩增倍数为100%,其它各组的值系 与T-cell组的比值。
[0216] 结果如图8所示。实验结果表明，慢病毒载体hsc比-12/CD6化转导的T细胞可W 有效避免持续性分泌IL-12造成的体外T细胞扩增的毒副作用。 阳217] 讨论
[0218] 本发明的研究表明，通过基因修饰抗肿瘤T细胞表达新的IL-12/CD6化分子，利用 CD62L肿瘤抗原反应性切割及释放的特性，可W实现IL-12的抗原反应性的肿瘤免疫反应 的局部释放，增强局部抗肿瘤的免疫反应，并且显著降低IL-12的毒副作用。
[0219] 同持续分泌IL-12基因修饰的抗肿瘤T细胞相比较，IL-12/CD6化融合蛋白基因 修饰的抗肿瘤T细胞不但可W显著延长荷瘤鼠的生存，还可W避免持续分泌IL-12诱导的 系统性细胞毒性，是一种全新的通过细胞膜表达IL-12,并通过CD6化来实现肿瘤抗原反应 性的切割及释放的全新的免疫细胞治疗策略，在肿瘤的免疫细胞的治疗中将发挥重要的作 用。
[0220] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 阳221] 参考文献
[0222] 1.Zhang,L.等人（2011)."ImprovingadoptiveTcelltherapybytargeting andcontrollingIL-12expressiontothetumorenvironment."MolTher19(4) :751-759. 阳22引 2.Overwijk,W.W.等人（1998)."即 100/pmel17isamurinetumor rejectionantigen:inductionof"self"-reactive，tumoricidalTcellsusing high-affinity，alteredpeptideligand."JExpMed188(2):277-286.
[0224] 3.Yang,S.等人口008)?"Developmentofoptimalbicistroniclentiviral vectorsfacilitateshigh-levelTC民geneexpressionandrobusttumorcell recognition."GeneTher15 (21):1411-1423.
[0225] 4.Yang,S.，等人口Oil) ?"lliesheddingofCD62L(X-selectin)regulates化e acquisitionoflyticactivityinhumantumorreactiveTlymphocytes."PLoSOne 6(7) :e22560.
【主权项】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件： (i) 任选的位于N端的信号肽和/或前导肽； (ii) 第一蛋白元件； (iii) 第二蛋白元件；以及 (iv) 任选的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之间的连接肽元件； 其中，所述信号肽可操作地连于由（ii)、（iii)和（iv)所构成的融合元件； 并且第一蛋白元件为IL-12蛋白元件；第二蛋白元件为⑶62L的蛋白元件。2. 如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有选自下组的结构： (1) 式Ia所述结构： D-A-B(Ia)，或 (2) 式IIa所述结构： D-A-C-B(IIa)， 其中， A为IL-12蛋白元件； B为⑶62L蛋白元件； C为任选的连接肽元件； D为任选的信号肽信号肽和/或前导肽序列； 表示连接上述元件的肽键或肽接头。3. 如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述的第一蛋白元件包括连接在一起的 IL-12蛋白P40和P35亚基； 更佳地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. :2所示。4. 一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋 白。5. -种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的多核苷酸； 更佳地，所述的病毒载体包括：慢病毒载体、腺病毒载体、黄热病毒载体。6. -种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利 要求4所述的多核苷酸。7. -种产生权利要求1所述的蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤： (1) 在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所 述的融合蛋白；和 (2) 任选地分离所述融合蛋白。8. -种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含： 权利要求1所述的融合蛋白，以及 药学上可接受的载体。9. 一种免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞携带权利要求1所述的融合蛋白。10. -种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包含 权利要求9所述的免疫细胞，以及 药学上可接受的载体。
【专利摘要】本发明提供高效低毒的肿瘤治疗剂及其制法和用途。具体地，本发明提供了一种IL-12/CD62L融合蛋白。在本发明中，通过利用含IL-12/CD62L融合基因的慢病毒修饰抗肿瘤T细胞，通过CD62L肿瘤抗原依赖性的激活所诱导的特异性切割及释放，从而实现肿瘤抗原激活的细胞膜表面IL-12的释放。实验表明，在本发明中，可在T细胞攻击肿瘤的局部实现定点和定时释放IL-12，从而改变T细胞-肿瘤组织的免疫微环境，进而实现抗肿瘤免疫效果的最大化，并显著降低毒副作用。
【IPC分类】C07K19/00, C12N15/62, C12N15/861, A61K47/48, C12N15/867, C12P21/00, A61K38/20, C12N15/86, C12N5/10, A61P35/00
【公开号】CN105218682
【申请号】CN201510702467
【发明人】杨世成
【申请人】深圳精准医疗科技有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月26日