活化的介质（Sepharose 4B)，通过上述介绍的固定化酶的方 法，将肠激酶固定到介质上，装在第一根层析柱内，融合蛋白和酶切后的非目的蛋白部分均 带有His标签，因此第二层析柱选择Ni亲和柱(NI Sepharose FF层析）；
[0071 ] 层析柱：固定化肠激酶的Sepharose 4B )(K16/20柱，5ml
[0072] 平衡液：25mM Tris，pH8.0;50mM NaCl
[0073] 样品：GH融合蛋白PA沉淀 1.2g，（H401-2),用Buffer:50mM Tris，pH8.0;50mM NaCl 充分溶解，离心去除沉淀，〇D为7.50D/ml。
[0074] 为了检测酶切是否完全，重复上样多次，用来增加酶切时间，以便于判断不同酶切 时间的酶切梯度效果，并电泳检测其酶切结果。
[0075] 上样1:上样流速5ml/min,保留时间lmin，上样温度为25°C
[0076] 上样2:上样流速2.5ml/min,保留时间2min，上样温度为25°C
[0077]上样3:收集上样2穿透峰，重复上样，流速为2.5ml/min，保留时间4min，上样温度 为 25°C
[0078] 上样4:收集上样3流穿液重复上样一次，保留时间6min，上样温度为25°C
[0079] 上样5:收集上样4流穿液重复上样一次，保留时间8min，上样温度为25°C
[0080] 上样6:收集上样5流穿液重复上样一次，保留时间lOmin，上样温度为25°C
[0081] 上样7:收集上样6流穿液重复上样一次，保留时间12min，上样温度为25°C
[0082] 收集流穿，电泳检测如图5所示。
[0083] 从电泳结果可以看出，酶切条件为50mM Tris，pH8.0;50mM NaCl在室温条件
[0084] 下酶切10-12分钟，均能将融合蛋白酶切掉90%以上。
[0085] 由此可见，固定化酶切比传统酶切无论在成本上，还是时间上都占有很大优势，详 见表2。
[0086] 固定化肠激酶柱在50mM Tris，pH8.0;50mM NaCl在室温条件下在酶切时间为10分 钟，对GH融合蛋白进行酶切，90%以上的融合蛋白被切开，本发明的固定化酶切对比传统静 态酶切数据如下：
[0087] 表2:传统酶切和固定化肠激酶酶切融合蛋白对照表
[0088]
[0089] 由上表可见，就肠激酶来说，在时间成本和酶的使用量上，本发明的固定化酶切的 方法也都显著优于静态酶切。
[0090] 固定化酶柱和层析柱的串联
[0091 ]利用融合蛋白的酶切得到目标蛋白时，通常在融合头和目的蛋白之间插入合适的 标签，如6His，GST，BMP等可以较为方便纯化的融合蛋白，同时也可以在酶切后方便的去除 融合头。固定化酶之后串联标记的亲和层析，可以方便的去除融合头和未切的融合蛋白，直 接得到目的蛋白。例如，对于带6His标签的融合蛋白经过固定化酶切之后，含有融合头、目 的蛋白和未被切的融合蛋白，酶切液直接通过串联的金属螯合层析柱，融合头和未被切的 融合蛋白被吸附在层析柱上，而目的蛋白流穿。通过一个步骤就可以得到高纯度的目的蛋 白，节省了时间，提高了效率。
[0092] 不带标记的融合蛋白也可以根据目的蛋白的性质串联层析柱，达到一步酶切和纯 化的目的。当目的蛋白和融合头的等电点相差较大，而目的蛋白的等电点高于酶切pH时，可 以用阴离子层析柱和固定化酶柱串联，经过酶切后的目的蛋白等不吸附在阴离子交换介质 上，而偏酸性会吸附在柱子上，同时脱离的酶也能吸附到阴离子介质上。
[0093] 实施例3:固定化凝血酶和阴离子交换柱的串联
[0094] 将固化凝血酶柱XK16/20柱（5ml)和Q sepharose Big Bead柱XK16/20(5ml)串联。 以下面程序进行层析操作：
[0095] 平衡液：25mM Tris-HCl(pH8.0)+50mM NaCl，平衡50ml
[0096] 上样：以21111/1^11流速将1'口-?1'!1加入串联的层析柱，酶切时间为2.5分钟
[0097] 收峰:收集穿透峰。
[0098] 收集到的穿透峰进行电泳。通过串联酶切和纯化一个步骤目的蛋白的纯度达到 90%以上。
[0099] 结果参见图6。
[0100]由上述结果可见，使用本发明的方法，不仅节省了时间和经济成本，简化了程序， 避免了污染的可能，还能保持甚至得到更高的目的蛋白纯度。
[0101 ]实施例4:固定化肠激酶和NI亲和柱的串联
[0102] 层析柱：固定化肠激酶的Sepharose 4B XK16/20柱，5ml串联NI FF层析柱5ml
[0103] 平衡液：25mM Tris，pH8.0;50mM NaCl
[0104] 样品：GH融合蛋白PA沉淀 1.2g，（H401-2),用Buffer:50mM Tris，pH8.0;50mM NaCl 充分溶解，离心去除沉淀，〇D为7.50D/ml
[0105] 上样流速lml/min,保留时间4min，上样温度为25°C
[0106] 收集穿透峰，电泳检测纯度。
[0107] 参见图7可见，得到的蛋白纯度较高
[0108] 由上述结果可见，使用本发明的方法，不仅节省了时间和经济成本，简化了程序， 避免了污染的可能，还能保持甚至得到更高的目的蛋白纯度。
[0109] 使用后，拆开两根串联柱，分别清洗，保存备用。
[0110] 另外，发明人经反复试验发现，本发明中的酶切柱可以保存在20%酒精内，不影响 其酶切效率。因此，本发明的试剂盒能够长久保存，而且不影响其效果，适合商品化出售。
[0111] 虽然上文结合具体实施例示例性说明了本发明，但是在不脱离本发明的精神的情 况下，本领域技术人员可以根据本领域知识对其进行适当的修改，这些修改也应落入本发 明保护的范围内。本发明的范围由权利要求书限定。
【主权项】
1. 一种从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤： 将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱内的介质上； 将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白 酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附目的蛋白； 将含有所述融合蛋白的样品依次流经第一层析柱和第二层析柱。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述酶为凝血酶、肠激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰 蛋白酶。3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一层析柱内的介质选自高交联的琼脂糖、 葡聚糖和纤维素中的一种。4. 如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第二层析柱的介质选自用于纯化含有 标签蛋白的亲和层析填料、离子交换类填料和分子筛类填料中的一种。5. 如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶的固定在4±2°C，pH8-8.5条件下进 行12-20小时。6. -种纯化蛋白的试剂盒，包括第一层析柱和第二层析柱，其中第一层析柱中的介质 固定有能够从融合蛋白酶切得到目的蛋白的酶，第二层析柱中的介质能够吸附所述融合蛋 白被酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附所述目的蛋白，所述试剂盒在使用时依次串 联连接第一层析柱和第二层析柱。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其中所述酶为凝血酶、肠激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或 膜蛋白酶。8. 如权利要求6所述的试剂盒，其中所述第一层析柱内介质选自高交联的琼脂糖、葡聚 糖和纤维素中的一种。9. 如权利要求6所述的试剂盒，其中所述第二层析柱内介质选自用于纯化含有标签蛋 白的亲和层析填料、离子交换类填料和分子筛类填料中的一种。
【专利摘要】本申请公开了一种从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱上；将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附目的蛋白；将融合蛋白依次流经第一层析柱和第二层析柱。本发明的方法采用一步层析法，节省了纯化步骤，并且提高了纯化效率。
【IPC分类】C07K1/22, C07K1/18, C12P21/06, C07K1/16
【公开号】CN105483193
【申请号】CN201510823449
【发明人】李浩冬, 顾湘英, 郭鸿
【申请人】上海联合赛尔生物工程有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月24日