一种dna片段的拼接方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学及生物工程技术领域，涉及一种在基因工程操作中的DNA 片段克隆和拼接方法。具体地，本发明涉及一种将多个DNA片段首尾拼接形成更长的DNA片 段的方法及该方法的应用。
【背景技术】
[0002] DNA(Deoxyribonucleic acid)，又称脱氧核糖核酸，是生命体内重要的遗传物质， 也是生命科学和生物技术研究的重要对象和工具。随着基因工程技术和应用的发展，在体 外对DNA的操作方式越来越多，比如对DNA分子的扩增、切割、修饰与重新组装等，也称为重 组DNA技术，是现代分子生物学发展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技术。
[0003] 在这些体外DNA操作中，有一个重要的环节是将DNA片段连接到载体中，从而可以 利用生物(细菌、酵母、细胞等)对DNA进行扩增、筛选、表达等操作。将DNA片段连接到载体的 过程也称为狭义的DNA克隆。
[0004] 可以作为DNA载体的有质粒、粘粒、噬菌体、人工染色体等，其中质粒载体是应用最 为广泛的分子克隆载体。
[0005] 实现DNA片断克隆到载体中的方法也有多种。比如酶切连接的方法，即DNA分子的 切割与连接可以通过限制性内切酶和连接酶来完成，即分别用相应的限制性内切酶切割目 标DNA分子和载体DNA分子，使其两端分别获得含有部分单链突出的末端(粘性末端），含有 互补序列的末端（由同一个酶或同尾酶切割获得)在DNA连接酶的作用下形成一条完整的 DNA链。也有TA克隆的方法，即在DNA片段末端各添加一个3 ' -dA碱基，在载体末端各添加一 个3'-dT碱基，即可实现DNA片段与载体的连接。还有基于同源片段的连接方法，即在片段和 线性化的载体两端分别有相同的序列，通过酶的作用将其连接在一起。
[0006] 实现单个DNA片段与载体的连接的方法相对比较简单和成熟。如上所述的方法中， 分别用一个步骤即可完成。在研究中，尤其是合成生物学应用中，经常需要用到将多个片段 连接到一起形成一个更长的DNA分子的过程，通常的方法，可以先将多个片段通过PCR的方 法连接到一起，再克隆连接到载体中。也可以先将其中的一个片段克隆到载体中，形成新 的载体后再加入新的片段。但这些方法都存在明显的缺点，PCR的方法得到的序列存在一定 的突变率，往往需要重新筛选正确克隆，而且PCR方法所能操作的DNA片段数量和长度都有 限。先后加入的方法，一方面受酶切位点的限制，随着片段的增加，可选的酶切位点越来越 少，另外一方面，遇到片段比较多的时候，该方法需要比较长的时间。
[0007] 为了解决多个片段拼接的问题，尤其是大量DNA片段需要拼接形成较长的DNA分子 的问题。本发明提出了一种"递归"克隆的方法，根据该方法设计的载体和片段，可以方便 地，并行和递归地将多个DNA片段首尾拼接，形成大的DNA分子。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种将多个DNA片段首尾拼接形成更长的DNA片段的方法。
[0009] 一种将多个DNA片段拼接形成更长的DNA片段的拼接方法，包括下列步骤：
[0010] 1)提供一种DNA载体，所述载体上至少顺序包含四个不同的酶切位点，即酶切位点 A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D，其中，酶切位点A和酶切位点B之间设有载体左同源 臂，酶切位点C和酶切位点D之间设有载体右同源臂；
[0011] 2)提供多个待拼接的目标DNA片段，相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠， 且首个待拼接目标DNA片段的首部设有与步骤1)所述DNA载体的载体左同源臂同源的左臂 序列，末个待拼接片段的尾部设有与步骤1)所述DNA载体的载体右同源臂同源的右臂序列；
[0012] 3)将步骤2)所述的多个待拼接的目标DNA片段经无缝克隆的方法一并克隆入步骤 1)所述的DNA载体，获得的载体中，所述多个待拼接的目标DNA片段按照设计顺序相连。
[0013] 步骤1)中，所述DNA载体的关键设计在于左右同源臂及四个酶切位点，其他设计并 无特殊，因此可以采用各种常规载体为出发载体改造获得。该载体中可包含常规载体包含 的其他酶切位点和特征序列。
[0014] 本发明实施例所用载体以pUC57载体为出发载体改造获得。
[0015] 进一步的，所述酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D均在所述DNA载体 中为唯一。
[0016] 所述酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D可选自各种常规酶切位点。实 施例列举的载体中，酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D顺次分别为限制性内切 酶Sbf I、Bpi I、Esp3I和AsiS I的酶切位点。
[0017] 较佳的，所述载体左臂同源序列及载体右臂同源序列的长度为15-100bp。
[0018] 如实施例列举的，步骤1)所用的DNA载体的序列为SEQ ID NO: 15。
[0019]优选的，无缝克隆时，步骤1)所述的DNA载体被线性化。较佳的，采用内切酶B(对应 酶切位点B)和内切酶C(对应酶切位点C)酶切线性化所述DNA载体。
[0020]优选的步骤2)中，相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠的区域为15-100bp， 优选25-100bp。
[0021 ]为防止连接顺序混乱，步骤2)中，当待拼接的目标DNA片段在两个以上时，各相邻 拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠的区域序列不同。
[0022] 可选的，步骤2)中，至少一个待拼接的目标DNA片段采用包括下列步骤的方法获 得：
[0023] a)提供两端附加有与步骤1)提供的DNA载体中所述载体左同源臂同源的左臂序列 及与所述载体右同源臂同源的右臂序列的待拼接的目标DNA片段；
[0024] b)将步骤a)的片段经无缝克隆的方法克隆入步骤1)提供的DNA载体中，获得克隆 有待拼接的目标DNA片段的载体；
[0025] c)将步骤b)获得的载体扩增后，经内切酶A和内切酶C酶切，或内切酶B和内切酶D 酶切，或内切酶B和内切酶C酶切获得所述待拼接的目标DNA片段。
[0026]进一步的，步骤c)中，当所述载体克隆有首个待拼接目标DNA片段时，采用内切酶A 和内切酶C酶切；当所述载体克隆有末个待拼接目标DNA片段时，采用内切酶B和内切酶D酶 切;若待拼接目标DNA片段数目超过两个，当所述载体克隆有中间待拼接目标DNA片段时，采 用内切酶B和内切酶C酶切。
[0027]进一步的，步骤3)、b)中，将DNA片段克隆到载体上以后，载体的酶切位点和特征序 列并不改变。
[0028]较佳的，步骤2)中，各待拼接的目标DNA片段均采用上述方法获得。
[0029]步骤3)获得克隆有拼接片段的DNA载体，可采用酶切的方式分离拼接好的DNA片 段。
[0030] 本发明的方法可循环使用，类似递归的方式，将步骤3)获得的载体中拼接好的DNA 片段酶切后进一步作为待拼接的目标DNA片段，用于拼接更长的DNA片段，如此递归一次或 数次，从而将DNA片段源源不断地拼接到一起。
[0031] 本发明的特点在于利用同一套载体和相应的酶切位点，结合使用无缝克隆的方 法，可以将两个或多个具有首尾重叠的DNA片段拼接到一起形成更长的片段。更重要的是， 由此拼接形成的片段又可以以同样的方式与其他片段进行排接，从而可以源源不断地将更 多的片段拼接在一起。在基因工程中，尤其在合成生物学中得到大段的DNA片段非常适用。
【附图说明】
[0032]图1是母载体(pMatric)结构示意图 [0033]图2是目标片段分段示意图
[0034]图3是目标片段基础载体(pMatric-Block)构建示意图
[0035]图4是两个片段一步拼接示意图
[0036]图5是三个片段一步拼接示意图
[0037]图6是四个片段一步拼接示意图
[0038]图7是四个片段两步拼接示意图
[0039] 图8是实施例中母载体(pSMl 447)构建示例
【具体实施方式】
[0040] 本发明的DNA载体，可以用于DNA片段的克隆，且添加了DNA片段后的载体，可以以 同样的方式吸收更多的DNA片段;添加了 DNA片段后的载体，也可以通过合适的酶切产生可 以装载到同类载体中的DNA片段;通过上述步骤的循环使用，可以将DNA片段源源不断地拼 接到一起。
[0041 ]步骤1)所用DNA载体
[0042]如图1所示，本发明的载体除了作为DNA载体应有的通用属性之外，还具有：
[0043] A、用于与DNA片段同源的左臂序列（长度为15-100bp);
[0044] B、该同源序列两端分别嵌合有固定的内切酶A和内切酶B识别位点；
[0045] C、用于与DNA片段同源的右臂序列（长度为15-100bp);
[0046] C、D、该同源序列两端分别嵌合有固定的内切酶C和内切酶D识别位点；
[0047] 单个DNA片段的拼接
[0048]用于单个DNA片段的拼接时，可以在目标DNA片段的两端附加同源的左臂序列和右 臂序列。通过内切酶B和内切酶C线性化该载体。DNA片段和载体通过无缝克隆的方法，在同 源的左臂序列和右臂序列之间进行连接。
[0049]多个DNA片段的拼接
[0050]对于多个DNA片段的拼接，首先通过合适的方法获得首尾相互重叠(重叠区域长度 15-100bp)的各个DNA片段，如图2所示。在第一个片段的首部和最后一个片段的尾部分别添 加与载体同源的左臂序列和右臂序列。
[0051] 随后，如图3所示，每一个基础片段都通过单个DNA片段拼接的方法克隆到载体中。
[0052] 然后，每两个相邻片段都可以通过下述的方法拼接到一起：
[0053] 如图4所示，
[0054]通过内切酶A和内切酶C释放含有第一个片段的载体pBlockl，得到片段1;
[0055]通过内切酶B和内切酶D释放含有第二个片段的载体pBlock2,得到片段2;
[0056] 通过内切酶B和内切酶C线性化任何一个同类载体（pBlockl，pBlock2,或 pMatric)，得到载体；
[0057]将两个片段和载体相连，即可得到片段1和片段2首尾相连的载体pBlockl2
[0058]每三个或多个相邻的片段的拼接
[0059]每三个或多个相邻的片段可以通过下述方法拼接到一起：
[0060] 如图5所示，
[0061]通过内切酶A和内切酶C释放含有第一个片段的载体pBlockl，得到片段1;
[0062]通过内切酶B和内切酶C释放含有第二个片段的载体pBlock2,得到片段2;
[0063]通过内切酶B和内切酶D释放含有第二个片段的载体pBlock3,得到片段3;
[0064] 通过内切酶B和内切酶C线性化任何一个同类载体(pBlockl，pBlock2，pBlock3或 pMatric)，得到载体；
[0065]将三个片段与载体相连，即可得到片段1、2、3首尾相连的载体pBlockl 23
[0066]片段多于三个时的拼接 [0067] 片段多于三个时，
[0068] 第一个片段通过内切酶A和内切酶C释放；
[0069] 最后一个片段通过内切酶B和内切酶D释放；
[0070] 其余片段均通过通过内切酶B和内切酶C释放；
[0071] 如图6所示的4个片段一次拼接;也可以适用于更多的片段；
[0072]循环拼接获得更长的DNA片段
[0073]需要拼接的DNA片段较多时，可以并行处理。
[0074]如图7所示，按照上述步骤，片段1和片段2拼接形成片段12;
[0075]同时，片段3和片段4拼接形成片段34;
[0076]片段12和片段34又可以采用同样的思路拼接形成片段1234;
[0077]如此循环，可以快速拼接到到长的DNA片段。
[0078] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限 制本发明所要保护的范围。
[0079] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等， 分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0080] 实施例1
[0081 ] 母载体pSM1447的构建
[0082] 1.1SM1447片段的制备
[0083] 根据SM1447片段序列，设计寡核苷酸DNA分子如下：
[0084]
[0085] SM1447片段按照基因合成的方法进行制备，反应体系如下：
[0086]
[0087] 反应程序：95°C for 2min, (95°C for 20sec，56°C for 30sec，72°Cfor 20sec)x 20cycles,72〇C for 5min〇
[0088] 反应结束后，吸取上述反应产物0.5yL作为模板，反应体系如下：
[0089]
[0090] 反应程序：95°C for 2min, (95°C for 30sec，56°C for 30sec，72°Cfor 30sec)x 30cycles,72〇C for 5min〇
[0091] 反应结束后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在目标位置200bp有明显条带。用生工 生物工程（上海）股份有限公司生产的"SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒"回收该条带，得到 SM1447片段（SEQ ID N0:11)。
[0092] 1.2载体片段的准备
[0093] 用Hind III和Esp3 I限制性内切酶对pUC57载体（SEQ ID NO: 14)进行酶切，反应 体系如下：
[0094]
[0095]
[0096] 酶切反应条件为:37°C，4小时。
[0097] 酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，得到2.2kb和426bp两条带。用生工生物工 程(上海)股份有限公司生产的"SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒"回收2.2kb的线性化载体片 段。
[0098] 1.3无缝克隆
[0099]用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的"即用型无缝克隆试剂盒"将上述1.1 中的200bp SM1447片段和1.2中的2.2kb线性化载体片段连接，反应体系如下：
[0100]
[0101] 连接反应条件为:50°C，1小时。
[0102] 1.4筛选阳性克隆
[0103]将上述1.3中的连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株感受态细胞，转化后用含有50mg/ L氨苄青霉素 LB培养基平板上进行筛选，转化后的感受态经活化后涂布与上述平板上，于37 °〇倒置培养过夜。
[0104] 对平板挑取菌斑经活化培养后菌液使用生工生物工程(上海）股份有限公司所生 产的^1^印柱式质粒0嫩小量抽提试剂盒"提取质粒，用組3-(-48)<