专利名称：一种黄芩毛状根保藏和复壮方法
技术领域：
本发明属于植物细胞保藏技术领域，涉及ー种黄芩毛状根的保藏和复壮方法。
背景技术：
植物细胞保藏技术是生产和研究的基础，其原理是通过人工方法使细胞进入休眠状态，降低其生长代谢活动，达到抑制细胞增殖和减少变异的目的。常用的植物细胞保藏方法有液氮超低温保藏法和低温冷蔵法液氮保藏需专用器具、成本高，一般只在专业保藏机构中使用；实验室多采用低温冷蔵法保藏植物细胞，但保存过程会因代谢产物累积而改变其生存环境，一般I 4个月须重新进行转接保藏，虽不需特殊设备，但烦琐费吋，故仅限于短期保藏，且经常移植容易弓I起细胞退化。黄岑(Scutellariabaicalensis Georgi),为唇形科(Labiatae)植物，其药用部位为黄芩干燥根，性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。黄芩主要分布于河北、辽宁、陕西、山东、内蒙古等地，主要成分是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、黄芩酮1、黄芩酮I1、千层纸黄素A及菜油留醇等。近年来，研究发现其主要有效成分黄芩苷有抗HIV、抗肿瘤、抗氧化及清除氧自由基等作用，随着新药不断开发，黄芩用量在迅速増加，黄芩资源的可持续发展问题日显重要。毛状根培养技术是20世纪80年代后期在植物细胞领域发展起来的一项新技木，与一般的植物细胞培养相比，毛状根可以生长在不含激素的培养基上。在诱导出毛状根的基础上，结合细胞培养技术建立起毛状根培养系统。这ー培养系统对传统药材来说很重要，因为约1/3的传统中药材是植物的根部，曾经被认为难以通过细胞培养来生产的许多源于植物根部的药物，现在正被设法通过培养毛状根来生产。毛状根培养遵循一般的生长模式，代谢产物不一定是生长相关的，但是毛状根的遗传性能和次级代谢产物合成能力比较稳定，为进行毛状根的高密度培养创造了较好的有利条件。因此，毛状根培养技术已被认为是生产药用植物次生代谢产物的一条重要途径，具有非常广泛的应用前景。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，通过对保藏和复壮条件的优化，实现了黄芩优良毛状根株系的保存。本发明是通过以下技术方案来实现—种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，包括以下步骤I)挑选处于对数生长期的黄芩毛状根，接种入保藏培养基中，室温下，避光静置保藏；所述的保藏培养基pH为5. 5 6. 5,包括I 4g じ1鹿糖、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、
0.5 1. Omg じ1盐酸硫胺素、0.1 0. 5mg じ1盐酸批P多醇、0.1 1. Omg じ1烟酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分；2)取保藏培养的黄芩毛状根，接种到活化培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养20 25天；所述的活化培养基 pH为5. 5 6. 5，包括10 30g じ1蔗糖、100 500mg じ1水解乳蛋白、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、0. 5 1. Omg じ1盐酸硫胺素、0.1
0.5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0.1 1. Omg じ1烟酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分；3)取活化后的黄芩毛状根，接种入复壮培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养20 25天；所述的复壮培养基pH为5. 5 6. 5，包括0.1 0. 4mmol じ1苯丙氨酸、30 60g じ1葡萄糖、500 IOOOmg じ1水解乳蛋白、1. 0 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5
2.5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5 1. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1烟酸和50 200mg じ1肌醇，以及无机盐部分；所述的无机盐部分包括50 150mg L-1KH2PO4^OO 2000mg じ1KNO3UOO 300mg じ1MgSO4 7H20、200 500mg じ1CaCl2 2H20、10 30mg じ1Na2EDTA 2H20、
I 5mg [1H3BO3J 20mg じ1FeSO4 7H20、0. 01 0. 05mg じ1CuSO4 5H20、2 IOmg じ1 ZnSO4 7H20、0.1 0. 5mg じ1Na2MoO4 2H20、0. 01 0. 05mg じ1CoCl2 6H20、
0.2 0. 5mg じ1KI 和 5 20mg じ1MnSO4 4H20。所述的对数生长期的黄芩毛状根的获得为将挑选的黄芩毛状根的根尖部，接种入液体培养基，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养至对数生长期；所述的液体培养基pH为5. 5 6. 5，包括30 50g じ1蔗糖，300 IOOOmg じ1水解乳蛋白，0. 5 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5 2. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5
1.5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1烟酸和50 200mg じ1肌醇，以及无机盐部分。所述挑选是选取毛状根生物量和黄芩苷含量高的株系，在无菌条件下挑取色浅、根系直、分枝多且根表面微绒毛明显的黄芩毛状根根尖部，挑取部位包含I 5个生长点，分枝长度0. 2 1. 0cm。所述将黄芩毛状根的根尖部以0. 5 0. 8%的接种量接入液体培养基，IlOr min'25 28°C避光培养15 20天至对数生长期。所述取活力旺盛、同步生长、处于对数生长期的黄芩毛状根，按0. 5 0. 8%的接种量接种入保藏培养基中，于24 26°C避光，静置保藏5 18个月。所述取保藏培养的黄芩毛状根，按0. 2 0. 6%的接种量接种到活化培养基中后，在 25 28°C、110r mirT1 下培养 20 25 天。所述在活化后的黄芩毛状根新鮮根部位挑取色浅、根系直，包含I 5个生长点，分枝长度0. 2^0. 5cm的根尖部黄芩毛状根，按0. 2 0. 6%的接种量接种到复壮培养基中后，在25 28°C、110r mirT1下培养20 25天。所述取复壮后的黄芩毛状根作为种子，接种入用于生产黄芩苷的培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养35 50天生产黄芩苷。所述用于生产黄岑苷的培养基pH为5. 5 6. 5,包括0.1 0. 4mmol じ1苯丙氨酸、30 60g じ1鹿糖、500 IOOOmg じ1水解乳蛋白、1. 0 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5
2.5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5 1. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1烟酸和50 200mg じ1肌醇，以及无机盐部分。—种黄岑毛状根的室温保藏培养基,该培养基pH为5. 5 6. 5,包括I 4g L 1鹿糖、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、0. 5 1. Omg じ1盐酸硫胺素、0.1 0. 5mg じ1盐酸卩比ロ多醇、0.1 1. Omg じ1烟酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。所述的无机盐部分包括50 150mg L-1KH2PO4^OO 2000mg じ1KNO3、100 300mg じ1MgSO4 7H20、200 500mg じ1CaCl2 2H20、10 30mg じ1Na2EDTA 2H20、I 5mg [1H3BO3J 20mg じ1FeSO4 7H20、0. 01 0. 05mg じ1CuSO4 5H20、2 IOmg じ1 ZnSO4 7H20、0.1 0. 5mg じ1Na2MoO4 2H20、0. 01 0. 05mg じ1CoCl2 6H20、
0.2 0. 5mg じ1KI 和 5 20mg じ1MnSO4 4H20。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明 提供的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，通过对黄芩毛状根培养条件的优化，将对数生长期的黄芩毛状根在保藏培养基中。在室温时，通过控制培养基中营养物质组成和比例，特别是在超低碳源和氮源条件下，使黄芩毛状根细胞进入休眠状态，从而抑制其生长增殖和代谢活动，以大幅降低黄芩毛状根在保藏期间的代谢，所需的传代或转接次数仅为低温冷藏法的1/6，实现了黄芩优良毛状根株系的保存，而其保藏成本低于60元/kg/年。利用本方法进行黄芩毛状根保藏，本发明在室温条件下保藏黄芩毛状根的时间可长达
1.5 年。对保藏后的黄芩毛状根进行活化复壮培养后，用于黄芩的次生代谢产物——黄芩苷的生产，经活化复壮培养后，其遗传稳定性良好、生物量积累和次级代谢产物的合成能力未出现退化。经活化和复壮后于生产培养基培养4(T50天，仍具有生物量l(Tl5g(DW) じ1 周期黄芩苷含量15 19%的生长性能和代谢产物合成能力，均可达到保藏前的水平。本保藏和复壮方法成本低廉，操作简便，解决了液氮保藏专业性要求高、费用大和常规冷藏保藏操作过于繁琐的问题。
图1为挑选的优良黄芩毛状根株系。图2为室温保藏7个月的黄芩毛状根。图3为室温保藏后用于黄芩苷生产的黄芩毛状根。图4-1为黄芩苷标准品的HPLC色谱图；图4-2为黄芩毛状根样品的黄芩苷含量測定的HPLC色谱图
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进ー步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例1一种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，包括以下步骤(I)在无菌条件下，选取毛状根生物量和黄芩苷含量均较高的黄芩毛状根株系(Scutellaria baicalensis Georgi),挑取其色浅、根系直、分枝多且根表面微绒毛明显的黄芩毛状根根尖部，挑取部位应包含I 5个生长点，分枝长度0. 2 1. Ocm0(2)挑选的优良株系毛状根，按0. 5%的接种量接入液体培养基，培养条件为IlOr mirT1、25°C避光培养18天。液体培养基pH为6. 0，含30g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白、2. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5mg じ1烟酸和150mg じ1肌醇，以及无机盐部分。
(3)取活力旺盛、同步生长的黄芩毛状根(如图1所示)，按0. 5%的接种量接于有保藏培养基中，室温避光培养，静置保藏7个月。经保藏后，黄芩毛状根外观有明显变化，主要表现为颜色显著加深呈棕黄色、毛状根略增粗，并在极少数毛状根尖端有少许新鲜组织生长，但无新的生长点和分枝萌发(如图2所示)。保藏培养基pH为6.0，含Ig じ1蔗糖、1. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸批卩多醇、0. 2mg じ1烟酸和50mg I71肌醇，以及无机盐部分。(4)将经保藏的黄芩毛状根按0. 5%的接种量接种到活化培养基中，IlOr mirT1、
25°C避光培养20天。活化培养基pH为6. 0，含30g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白、1.Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸批卩多醇、0. 2mg じ1烟酸和50mg I71肌醇，以及无机盐部分。(5)将活化后的黄芩毛状根优选后以0. 6%接种量接入复壮培养基中，IlOr
25°C避光培养25天。经活化和复壮后，黄芩毛状根生长和増殖迅速，种子毛状根尖端萌发大量生长点，并不断伸长形成分枝，生物量快速増加，且新生毛状根较嫩、呈浅黄色或类白色(如图3所示)。复壮培养基pH为6. 0，含40g じ1葡萄糖、500mg じ1水解乳蛋白和0. 2mmol じ1苯丙氨酸、2. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、
0.5mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。
(6)将进行复壮后的黄芩毛状根以0. 5%接种量接入生产培养基中进行黄芩苷生产，IlOr min-l、25°C避光培养40天。生产培养基pH为6. 0，含50g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白和0. 4mmol じ1苯丙氨酸、2. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比B多醇、0. 5mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。以上所述的无机盐包括90mg [1KH2PO4' IOOOmg じ1KN03、200mg [1MgSO4 7H20、250mg じ1CaCl2 2H20、20mg じ1Na2EDTA 2H20、3mg L-1H3BO3^Hmg じ1FeSO4 7H20、0. Olmg じ1CuSO4 5H20、3mg じ1ZnSO4 7H20、0.1mg じ1Na2MoO4 2H20、
0.Olmg じ1CoCl2 6H20、0. 35mg じ1KI 和 IOmg じ1MnSO4 4H20。实施例2(I)在无菌条件下，选取毛状根生物量和黄芩苷含量均较高的株系，挑取其色浅、根系直、分枝多且根表面微绒毛明显的黄芩毛状根根尖部，挑取部位应包含I 5个生长点，分枝长度0. 2 1. 0cm。(2)将挑选的优良株系毛状根，按0. 7%的接种量接入液体培养基，培养条件为IlOr mirT1、28°C避光培养20天。液体培养基pH为5. 8，含40g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白、0. 5mg じ1甘氨酸、2. 5mg じ1盐酸硫胺素、1. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、2. Omg じ1烟酸和50mg じ1肌醇，以及无机盐部分。(3)取活力旺盛、同步生长的黄芩毛状根，按0. 8%的接种量接于保藏培养基中，室温避光培养，静置保藏13个月。保藏培养基pH为5. 8,含2g じ1鹿糖、2. Omg じ1甘氨酸、
1.Omg じ1盐酸硫胺素、0.1mg じ1盐酸卩比卩多醇、0.1mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。(4)将经保藏的黄芩毛状根按0. 6%的接种量接种到活化培养基中，IlOr mirT1、28 °C避光培养20天。活化培养基pH为5.8，含30g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白、
2.Omg じ1甘氨酸、1. Omg じ1盐酸硫胺素、0.1mg じ1盐酸批卩多醇、0.1mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。(5)将活化后的黄芩毛状根优选后以0. 6%接种量接入复壮培养基中，IlOr .min'28°C避光培养20天。复壮培养基pH为5. 8，含50g じ1葡萄糖、500mg じ1水解乳蛋白和0. 2mmol じ1苯丙氨酸、4. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5mg じ1烟酸和50mg じ1肌醇，以及无机盐部分。(6)将进行复壮后的黄芩毛状根以0. 5%接种量接入生产培养基中进行黄芩苷生产，IlOr .mirT1、28°C避光培养50天。生产培养基pH为5. 8，含60g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白和0. 4mmol じ1苯丙氨酸、4. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比B多醇、0. 5mg じ1烟酸和50mg じ1肌醇，以及无机盐部分。以上所述的无机盐包括50mg じ1KH2PO4、2000mg L^1KNO3> IOOmg [1MgSO4 7H20、200mg じ1CaCl2 2H20、10mg じ1Na2EDTA 2H20、5mg L_1H3B03>5mg じ1FeSO4 7H20、0. 035mg じ1CuSO4 5H20、5mg じ1ZnSO4 7H20、0. 5mg じ1Na2MoO4 2H20、
0.05mg じ1CoCl2 6H20、0. 5mg じ1KI 和 20mg じ1MnSO4 4H20。实施例3(I)在无菌条件下，选取毛状根生物量和黄芩苷含量均较高的株系，挑取其色浅、根系直、分枝多且根表面微绒毛明显的黄芩毛状根根尖部，挑取部位应包含I 5个生长点，分枝长度0. 2 1. 0cm。(2)将挑选的优良株系毛状根，按0. 8%的接种量接入液体培养基，培养条件为IlOr mirT1、26°C避光培养 15天。液体培养基pH为5. 5，含50g じ1蔗糖、IOOOmg じ1水解乳蛋白、4. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 2mg じ1烟酸和200mg じ1肌醇，以及无机盐部分。(3)取活力旺盛、同步生长的黄芩毛状根，按0. 8%的接种量接于保藏培养基中，室温避光培养，静置保藏18个月。保藏培养基pH为5. 5,含4g じ1鹿糖、0. 5mg じ1甘氨酸、
1.Omg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、1. Omg じ1烟酸和IOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。(4)将经保藏的黄芩毛状根按0. 2%的接种量接种到活化培养基中，IlOr mirT1、
26°C避光培养25天。活化培养基pH为5. 5，含IOg じ1蔗糖、IOOmg じ1水解乳蛋白、0. 5mg じ1甘氨酸、1. Omg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、1. Omg じ1烟酸和IOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。(5)将活化后的黄芩毛状根优选后以0. 2%接种量接入复壮培养基中，IlOr
26°C避光培养20天。复壮培养基pH为5. 5，含30g じ1葡萄糖、IOOOmg じ1水解乳蛋白和0.1mmol じ1苯丙氨酸、1. Omg じ1甘氨酸、2. 5mg じ1盐酸硫胺素、1. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、
2.Omg じ1烟酸和200mg じ1肌醇，以及无机盐部分。(6)将进行复壮后的黄芩毛状根以0. 5%接种量接入生产培养基中进行黄芩苷生产，IlOr mirT1、26°C避光培养30天。生产培养基pH为5. 5，含30g じ1蔗糖、IOOOmg じ1水解乳蛋白和0.1mmol じ1苯丙氨酸、1. Omg じ1甘氨酸、2. 5mg じ1盐酸硫胺素、1. 5mg じ1盐酸卩比B多醇、2. Omg じ1烟酸和200mg じ1肌醇，以及无机盐部分。以上所述的无机盐包括150mg L-1KH2PO4^OOmg T1KNO3JOOmg [1MgSO4 7H20、500mg じ1CaCl2 2H20、30mg じ1Na2EDTA 2H20、lmg IZ1H3BO3JOmg じ1FeSO4 7H20、0. 05mg じ1CuSO4 5H20、0. 2mg じ1K1、10mg じ1ZnSO4 7H20、0. 125mg じ1Na2MoO4 2H20、0. 0125mg じ1CoCl2 6H20 和 5mg じ1MnSO4 4H20。实施例4(I)在无菌条件下，选取毛状根生物量和黄芩苷含量均较高的株系，挑取其色浅、根系直、分枝多且根表面微绒毛明显的黄芩毛状根根尖部，挑取部位应包含I 5个生长点，分枝长度0. 2 1. Ocm。
(2)将挑选的优良株系毛状根，按0. 7%的接种量接入液体培养基，培养条件为IlOr mirT1、28°C避光培养20天。液体培养基pH为6. 5，含40g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白、2. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。(3)取活力旺盛、同步生长的黄芩毛状根，按0. 6%的接种量接于保藏培养基中，室温避光培养，静置保藏6个月。保藏培养基pH为6. 5,含2. 5g じ1鹿糖、2. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。(4)将经保藏的黄芩毛状根按0. 5%接种量接种到活化培养基中，IlOr
避光培养25天。活化培养基pH为6. 5，含25g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白、2. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸批P多醇、0. 5mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。(5)将活化后的黄芩毛状根优选后以0. 6%接种量接入复壮培养基中，IlOr
28°C避光培养25天。复壮培养基pH为6. 5，含50g じ1葡萄糖、500mg じ1水解乳蛋白和0. 2mmol じ1苯丙氨酸、2. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比卩多醇、0. 5mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。(6)将进行复壮后的黄芩毛状根以0. 5%接种量接入生产培养基中进行黄芩苷生产，IlOr .mirT1、28°C避光培养50天。生产培养基pH为6. 5，含60g じ1蔗糖、500mg じ1水解乳蛋白和0. 4mmol じ1苯丙氨酸、2. Omg じ1甘氨酸、0. 5mg じ1盐酸硫胺素、0. 5mg じ1盐酸卩比B多醇、0. 5mg じ1烟酸和IOOmg じ1肌醇，以及无机盐部分。以上所述的无机盐包括85mg L-1KH2PO4^SOmg L^1KNO3> 185mg [1MgSO4 7H20、220mg じ1CaCl2 2H20、18. 7mg じ1Na2EDTA 2H20、3mg L-1H3BO3^Hmg じ1FeSO4 7H20、0. 0125mg じ1CuSO4 5H20、4. 5mg じ1ZnSO4 7H20、0. 125mg じ1Na2MoO4 2H20、0. 0125mg じ1CoCl2 6H20、0. 42mg じ1KI 和 11. 2mg じ1MnSO4 4H20。对保藏和复壮后培养的黄芩毛状根进行如下检测I)采用干重法測定黄芩毛状根生物量培养结束后取出黄芩毛状根，水洗、抽滤，60°C鼓风干燥箱中干燥至恒重，干燥器中冷却后称毛状根干重。2)采用高效液相色谱法測定黄芩苷含量色谱柱为化学键合型十八烷基柱(SCiC18色谱柱)，检测器为PUMP K-1001、K-1501，流动相为甲醇:水:磷酸=50:50:0. 2，检测波长为274nm,柱温为室温,流速为ImL mirT1。測定结果按实例I所述具体方法保藏，经活化复苏后，黄芩毛状根在生长培养基中获得的生物量为10. 72g(Dff) じ1，黄芩苷含量为18. 2%(黄芩苷含量的HPLC检测结果如图4-2所示，图4-1为标准品对照);按实施例2所述具体方法保藏，经活化复苏后，黄芩毛状根在生长培养基中获得的生物量为12. 05g (Dff) じ1，黄芩苷含量为16. 4% ;按实施例3所述具体方法保藏，经活化复苏后，黄芩毛状根在生长培养基中获得的生物量为9. 55g (Dff) じ1，黄芩苷含量为16. 1% ;按实施例4所述具体方法保藏，经活化复苏后，黄芩毛状根在生长培养基中获得的生物 量为12.95g(DW) じ1，黄芩苷含量为19. 1%。表明本保藏和复壮方法对黄芩毛状根生长性能和次生代谢产物合成能力的保持效果良好。
权利要求
1.一种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，包括以下步骤 1)挑选处于对数生长期的黄芩毛状根，接种入保藏培养基中，室温下，避光静置保藏；所述的保藏培养基pH为5. 5 6. 5,包括I 4g · L-1鹿糖、O. 5 2. Omg · L-1甘氨酸、O.5 1. Omg *L_1盐酸硫胺素、O.1 O. 5mg *L_1盐酸批卩多醇、O.1 1. Omg *L_1烟酸和10 IOOmg · L-1肌醇，以及无机盐部分； 2)取保藏培养的黄芩毛状根，接种到活化培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养20 25天；所述的活化培养基pH为5. 5 6. 5，包括10 30g Γ1蔗糖、100 500mg Γ1水解乳蛋白、O. 5 2. Omg · L—1甘氨酸、O. 5 1. Omg · L—1盐酸硫胺素、O.1 O. 5mg · L—1盐酸批卩多醇、O.1 1. Omg · L-1烟酸和10 IOOmg · L-1肌醇，以及无机盐部分； 3)取活化后的黄芩毛状根，接种入复壮培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养20 25天；所述的复壮培养基pH为5. 5 6. 5，包括O.1 O. 4mmol Γ1苯丙氨酸、30 60g *L_1 葡萄糖、500 IOOOmg *L_1 水解乳蛋白、1. O 4. Omg *L_1 甘氨酸、O. 5 2. 5mg *L_1盐酸硫胺素、O. 5 1. 5mg · L—1盐酸批B多醇、O. 5 2. Omg · L—1烟酸和50 200mg · L—1肌醇，以及无机盐部分； 所述的无机盐部分包括50 150mg · L-1KH2PO4^OO 2000mg · T1KNO3UOO 300mg · IZ1MgSO4 · 7H20、200 500mg · IZ1CaCl2 · 2H20、10 30mg · IZ1Na2EDTA · 2H20、I 5mg · IZ1H3BO3J 20mg · IZ1FeSO4 · 7Η20、0· 01 O. 05mg · !/1CuSO4 · 5H20、2 IOmg · T1ZnSO4 · 7Η20、0· I O. 5mg · L^1Na2MoO4 · 2Η20、0· 01 0. 05mg · T1CoCl2 · 6H20、0.2 0. 5mg · L-1KI 和 5 20mg · L-1MnSO4 · 4H20。
2.如权利要求1所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，所述的对数生长期的黄芩毛状根的获得为 将挑选的黄芩毛状根的根尖部，接种入液体培养基，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养至对数生长期；所述的液体培养基pH为5. 5 6. 5，包括30 50g · Γ1蔗糖，300 IOOOmg · L—1水解乳蛋白，O. 5 4. Omg · L—1甘氨酸、O. 5 2. 5mg · L—1盐酸硫胺素、O. 5 1.5mg · L-1盐酸批B多醇、O. 5 2. Omg · L-1烟酸和50 200mg · L-1肌醇，以及无机盐部分。
3.如权利要求2所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，所述挑选是选取毛状根生物量和黄芩苷含量高的株系，在无菌条件下挑取色浅、根系直、分枝多且根表面微绒毛明显的黄芩毛状根根尖部，挑取部位包含I 5个生长点，分枝长度O. 2 1. Ocm0
4.如权利要求2所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，将黄芩毛状根的根尖部以O. 5 O. 8%的接种量接入液体培养基，IlOr · min'25 28°C避光培养15 20天至对数生长期。
5.如权利要求1所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，取活力旺盛、同步生长、处于对数生长期的黄芩毛状根，按O. 5 O. 8%的接种量接种入保藏培养基中，于24 26°C避光，静置保藏5 18个月。
6.如权利要求1所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，取保藏培养的黄芩毛状根，按O. 2 O. 6%的接种量接种到活化培养基中后，在25 28°C、110r .mirT1下培养20 25天。
7.如权利要求1所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，在活化后的黄芩毛状根新鲜根部位挑取色浅、根系直，包含I 5个生长点，分枝长度O. 2^0. 5cm的根尖部黄芩毛状根，按O. 2 O. 6%的接种量接种到复壮培养基中后，在25 28°C、110r ^mirT1下培养20 25天。
8.如权利要求1所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，取复壮后的黄芩毛状根作为种子，接种入用于生产黄芩苷的培养基中，在25 28°C、避光震荡或摇瓶培养35 50天生产黄芩苷。
9.如权利要求8所述的黄芩毛状根的保藏和复壮方法，其特征在于，所述用于生产黄岑苷的培养基pH为5. 5 6. 5,包括O.1 O. 4mmol · L—1苯丙氨酸、30 60g · L—1鹿糖、500 IOOOmg · L—1水解乳蛋白、1. O 4. Omg · L—1甘氨酸、O. 5 2. 5mg · L—1盐酸硫胺素、.O.5 1. 5mg · L—1盐酸批B多醇、O. 5 2. Omg · L—1烟酸和50 200mg · L—1肌醇，以及无机盐部分。
10.一种黄芩毛状根的室温保藏培养基，其特征在于，该培养基pH为5. 5 6. 5，包括I 4g *L_1 鹿糖、O. 5 2. Omg *L_1 甘氨酸、O. 5 1. Omg *L_1 盐酸硫胺素、O.1 O. 5mg *L_1盐酸卩比卩多醇、O.1 1. Omg · L-1烟酸和10 IOOmg · L-1肌醇，以及无机盐部分； 所述的无机盐部分包括50 150mg · L-1KH2PO4^OO 2000mg · T1KNO3UOO 300mg · IZ1MgSO4 · 7H20、200 500mg · IZ1CaCl2 · 2H20、10 30mg · IZ1Na2EDTA · 2H20、I 5mg · IZ1H3BO3J 20mg · IZ1FeSO4 · 7Η20、0· 01 O. 05mg · !/1CuSO4 · 5H20、2 IOmg · T1ZnSO4 · 7Η20、0· I O. 5mg · L^1Na2MoO4 · 2Η20、0· 01 0. 05mg · T1CoCl2 · 6H20、.0.2 0. 5mg · L-1KI 和 5 20mg · L-1MnSO4 · 4H20。
全文摘要
本发明公开了一种黄芩毛状根的保藏和复壮方法，属于植物细胞保藏技术领域，本发明的技术方案主要包括以下步骤将经挑选的黄芩毛状根根尖部在液体培养基中避光培养至对数生长期；挑选经液体培养得到的黄芩毛状根，加入保藏培养基中，室温下，避光静置保藏；取保藏培养的黄芩毛状根，接种到活化培养基中，避光培养20～25d；取活化后的黄芩毛状根，接入复壮培养基，25～28℃避光培养15～20d。本发明提供的保藏和复壮方法成本低廉，操作简便，解决了液氮保藏专业性要求高、费用大和常规冷藏保藏操作过于繁琐的问题。
文档编号A01N1/02GK103039436SQ20121055577
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者施春阳, 齐香君, 钱卫东, 李雅 申请人:陕西科技大学