专利名称：一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法
技术领域：
本发明属于细胞工程培育领域，涉及海水鱼类雌核发育方法，尤其涉及一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法。
背景技术：
利用细胞工程技术培育水产优良品种具有重要的理论意义和广阔的应用前景。雌核发育作为一种细胞工程技术，是进行鱼类品种改良的重要途径。在鱼类养殖中采用雌核发育技术的主要目的就是建立纯系和生产全雌鱼。通过不同纯系间杂交技术，把一些隐性基因几乎全部去掉，从杂交后代中筛选培育出性状优良的新品种(系)。人工诱导雌核发育 已经广泛应用于国内外多种鱼类遗传育种的研究与实践中。例如日本利用该技术培育出全雌虹鳟和牙鲆等供养殖利用，美国则利用该技术培育出草鱼优良品系。我国自20世纪70年代中期开始展开雌核发育研究，在鲤、鲫、草、鲢等人工诱导雌核发育取得了一定的成就。在海水鱼类中，我国利用雌核发育技术已经在牙鲆、大黄鱼等重要经济鱼类培育出新品种，在养殖过程中显示了明显的优势。黄姑鱼是我国是重要的海水经济鱼类。近年来，随着黄姑鱼繁育技术的日趋成熟，其养殖规模也逐渐扩大，成为继大黄鱼后我国网箱养殖的重要品种。借鉴其他海、淡水鱼养殖中良种培育的经验，对黄姑鱼进行品种改良是保证其养殖业健康持续发展的重要因素。采用传统的育种方式(定向选择+近交)基因纯合速度慢，育种周期长，不符合当前养殖业发展的迫切需要。利用雌核发育技术可以快速排除与减少群体中存在的不良及有害基因，增加优良基因与基因型的频率，是对黄姑鱼进行遗传改良的有效方法。另一方面，黄姑鱼的雌雄两性个体的生长存在着显著的差异，雌鱼生长显著快于雄鱼。因此有必要开展可加速育种进程的人工雌核发育技术研究，而关于黄姑鱼人工雌核发育研究，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明提供了一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，本发明的目的是建立人工诱导黄姑鱼雌核发育诱导方法，培育雌核发育二倍体苗种。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，它包括以下步骤(I)黄姑鱼或条石鲷精子的遗传灭活黄姑鱼精子的遗传物质灭活将黄姑鱼精液用精子稀释液稀释25 75倍，置于18 72mJ/mm2紫外线强度照射；条石鲷精子的遗传物质灭活将条石鲷精液用精子稀释液稀释20 50倍，置于12 54mJ/mm2紫外线强度照射；(2)未受精卵与灭活精子的授精将经紫外照射的灭活精液5 30mL与成熟的黄姑鱼卵子20 200mL混合，轻轻摇动混匀，加入5 IOmL海水后继续混匀，再加入20 200mL海水置于22 23°C室温下放置I 4min,用于染色体加倍处理；(3)雌核发育鱼卵染色体加倍在授精后I 4min，将卵浸入0 4. 5°C的海水浴中进行处理5 20min，取出处理后的卵在12 15°C海水过渡10 15min，然后放入22 23°C海水中准备进行孵化；(4)染色体加倍冷休克诱导处理在休克温度0 4. 5°C、冷休克时间5 20min条件下诱导雌核发育二倍体。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(I)中精子稀释液配方为NaC16g/L，KCl
0.4g/L, CaCl2O. 2g/L, pH 值 7. O。
对上述技术方案的进一步改进所述步骤(I)中黄姑鱼精液稀释40 50倍，黄姑鱼精子紫外灭活的最适剂量为42mJ/mm2。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(I)中条石鲷精液稀释30 40倍，条石鲷精子紫外灭活的最适剂量为30mJ/mm2。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(I)中黄姑鱼精子和条石鲷精子遗传物质灭活所用稀释液的厚度为0.1 0. 3cm。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(3)中授精后2min染色体开始加倍的诱
导率最闻。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(4)中在2. 5 3. 5°C下冷休克处理Smin的雌核发育诱导率最高。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是1、本发明利用异源精子和同源精子诱导黄姑鱼雌核发育，首次建立了黄姑鱼人工雌核发育诱导方法，获得了雌核发育二倍体苗种，所述诱导方法操作方便，高效、实用、可靠，获得了较高的雌核发育诱导率。2、通过本发明诱导获得的黄姑鱼后代只含有雌性亲本的遗传物质，可加速优良基因纯化，使优良的遗传性状得以迅速固定，因此，本发明可以应用于黄姑鱼的快速育种，在黄姑鱼遗传分析和性别控制研究方面也具有重大的应用价值和推广应用前景。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
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图1为本发明实施例获得的黄姑鱼初孵仔鱼图，其中图1a为雌核发育二倍体初孵仔鱼图，图1b为单倍体初孵仔鱼图。图2为本发明实施例获得的黄姑鱼初孵仔鱼的细胞流仪检测图，其图2a为正常二倍体初孵仔鱼的细胞流仪检测图，图2b为黄姑鱼单倍体初孵仔鱼的细胞流仪检测图，图2c为黄姑鱼雌核发育二倍体初孵仔鱼的细胞流仪检测图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例1本发明所述黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法包括以下步骤1、黄姑鱼和条石鲷精子的遗传物质灭活；2、未受精卵与灭活精子的授精；3、确定染色体加倍的起始时间；4、确定染色体冷休克温度及处理时间。1、黄姑鱼和条石鲷精子的遗传物质灭活利用浙江省海水增养殖重点实验室培育的黄姑鱼雌鱼和雄鱼(采集自舟山海域)各10尾，条石鲷雄鱼(采集自舟山海域)5尾，经人工催产后采集精子和卵子。经过实验表明，同源的黄姑鱼精子和异源的条石鲷精子均可诱导黄姑鱼卵子进行雌核发育。黄姑鱼精子的遗传灭活条件为将黄姑鱼精液用预冷的精子稀释液(配方为NaCl6g/L，KCl 0. 4g/L，CaCl2O. 2g/L，pH值7. 0)稀释25 75倍，平铺于培养皿中，调整稀释液厚度0.1 0. 3cm，设置18、30、36、42、48、60、72、84mJ/mm2等不同紫外线强度照射，然后与黄姑鱼卵混合。条石鲷精子的遗传物质灭活条件为将条石鲷精液用精子稀释液稀释20 50倍，平铺于培养皿中，调整稀释液厚度0.1 0. 3cm，用12、18、24、30、36、42、48、54、60mJ/mm2等不同紫外线强度照射，然后与黄姑鱼卵子混合。人工授精后在22 23 °C的海水中孵化，培育期间统计受精率、孵化率和单倍体率。综合考虑受精率、孵化率和单倍体率的情况，表明黄姑鱼精液稀释40 50倍，紫外灭活的最适剂量为42mJ/mm2 (如表I所示)；条石鲷精液稀释30 40倍,紫外灭活的最适剂量为30mJ/mm2 (如表2所示)。表I不同紫外照射剂量对受精率、孵化率和单倍体诱导率的影响(黄姑鱼，n=3)
权利要求
1.一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于它包括以下步骤(1)黄姑鱼或条石鲷精子的遗传灭活黄姑鱼精子的遗传物质灭活将黄姑鱼精液用精子稀释液稀释25 75倍，置于18 72mJ/mm2紫外线强度照射；条石鲷精子的遗传物质灭活将条石鲷精液用精子稀释液稀释20 50倍，置于12 54mJ/mm2紫外线强度照射；(2)未受精卵与灭活精子的授精将经紫外照射的灭活精液5 30mL与成熟的黄姑鱼卵子20 200mL混合，轻轻摇动混匀，加入5 IOmL海水后继续混匀，再加入20 200mL海水置于22 23°C室温下放置 I 4min,用于染色体加倍处理；(3)雌核发育鱼卵染色体加倍在授精后I 4min，将卵浸入O 4. 5°C的海水浴中进行处理5 20min，取出处理后的卵在12 15°C海水过渡10 15min，然后放入22 23°C海水中准备进行孵化；(4)染色体加倍冷休克诱导处理在休克温度O 4. 5°C、冷休克时间5 20min条件下诱导雌核发育二倍体。
2.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于所述步骤(I)中精子稀释液配方为 NaCl 6g/L, KCl O. 4g/L, CaCl2 O. 2g/L，pH 值 7· O。
3.根据权利要求2所述的一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于所述步骤(I)中黄姑鱼精液稀释40 50倍，黄姑鱼精子紫外灭活的最适剂量为42mJ /mm2。
4.根据权利要求1或2所述的一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于 所述步骤(I)中条石鲷精液稀释30 40倍，条石鲷精子紫外灭活的最适剂量为30mJ/mm2。
5.根据权利要求1或2所述的一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于 所述步骤(I)中黄姑鱼精子和条石鲷精子遗传物质灭活所用稀释液的厚度为O.1 O. 3cm。
6.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于所述步骤(3)中授精后2min染色体开始加倍的诱导率最高。
7.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于所述步骤(4)中在2. 5 3. 5°C下冷休克处理8min的雌核发育诱导率最高。
全文摘要
本发明提供了一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，包括(1)黄姑鱼或条石鲷精子的遗传灭活；(2)黄姑鱼未受精卵与灭活精子的授精；(3)雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定；(4)染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选。本发明首次建立了采用黄姑鱼精子和条石鲷精子诱导黄姑鱼卵子进行雌核发育并获得雌核发育二倍体鱼苗的方法，筛选到适合黄姑鱼卵雌核发育的冷休克起始时间、冷休克温度和持续时间。本发明具有操作方便，高效、实用、可靠的特点；通过本发明诱导获得的黄姑鱼后代只含有雌性亲本的遗传物质，可加速优良基因纯化、使优良的遗传性状得以迅速固定，在黄姑鱼育种和性别控制研究方面具有重要的应用价值和推广应用前景。
文档编号A01K61/00GK102986571SQ20121055510
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者徐冬冬, 楼宝, 薛宝贵, 史会来, 詹炜, 马世磊, 毛国民 申请人:浙江省海洋水产研究所