00mg/L头抱霉素（Cef)的脱菌培养基上出现溢菌现象，则将毛状 根用无菌水清洗，吸除多于水分后，再置于含500mg/L头抱霉素（Cef)的脱菌培养基上继续 25 °C暗培养；
[0091] 将脱菌完全的毛状根转入筛选培养基中，培养15天W上。将长势仍然良好的毛状 根剪取一小段，采用CTAB法提取总DNA，W总DNA为模板PCR鉴定是否含巧8C1发根农杆菌 特有的rolB、role基因和目的基因CHI;
[0092] 目的基因CHI扩增引物为：
[0093] P皿-CHI-F: 5 > -CTCAAGCTTGGATCCATGGCTGCC-3 >
[0094] 和P皿-CHI-R:5，-CGATACCGTCACTAGTCAAACCATA-3 '
[0095]rolB基因扩增引物为：
[0096]rolB-F:5'-CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3，
[0097]和ro1B-R:5，-GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3， 阳〇9引 rolC基因扩增引物为：
[0099] rolC-F: 5' -TCGCCATGCCTCACCAACTCAC-3，
[0100] 和rolC-R:5, -CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA-3'
[0101] 反应体系均为（20yL) :d地20 Ty^Template DM 1 ykR)rward P;rime;r(10yM)lyL，Reverse P;rime;r(10yM)lyL2X;rTaq PCR SuperMix lOyL。
[0102]PCR反应条件为：94°C 5min，35个循环（94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 60sec)， 72°C 5min。 阳103] PCR反应结束后，将扩增产物在琼脂糖凝胶板中电泳。将琼脂糖凝胶板置于凝胶成 像仪下，观察到与rolB、rolC基因及目的基因大小一致的条带，结果如图1所示，表明筛选 获得的是由C58C1发根农杆菌诱导的含目的基因的毛状根。
[0104] 所述的筛选培养基为：B5培养基巧mg/L潮霉素B(Hyb)+30g/L薦糖巧.5g/L琼脂， pH5.8-6.0； 阳1化]7.将步骤6中PCR鉴定为阳性的毛状根，转移至液体培养基中，于25°C，100巧m暗培养60-90天，期间每隔12-15天更换一次液体培养基，所述的液体培养基为：B5培养基 +30g/L薦糖，pH5.8-6.0。 阳106] 最终获得可供后续分析的毛状根。如图2所示。 阳107] W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，运些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
【主权项】
1. 一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根转化方法，其特征在于该方法包括以下 步骤： a. 从灯盏花无菌苗上剪取0. 5-lcm2大小的叶盘，接种到预培养培养基上，25°C暗培养 2天，作为遗传转化的受体； 所述的预培养培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH5. 8-6. 0 ; b. 挑取含有携带目的基因的PHB-Flag表达载体的C58C1发根农杆菌单菌落，接种到 lml含40mg/L利福平及卡那霉素的YEB培养基，于28°C，200rpm振荡培养12-14h后，从 中取200μL菌液接种到30ml上述YEB培养基中，于28°C下，200rpm振荡培养至0D6。。为 0. 6±0. 1 ;常温下，5000rpm，离心lOmin，无菌条件下去上清，加30ml浸染培养基重悬菌体， 28°C，lOOrpm振荡孵育 30min; 所述的浸染培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+100μΜ乙酰丁香酮，pH5. 8-6. 0 ; c. 将步骤a中获得的外植体叶盘浸入步骤b中获得的发根农杆菌菌液中； d. 吸除步骤c中外植体上的多余菌液，接种到共培养培养基上，25°C无光条件下共培 养2天； 所述的共培养培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH5. 8-6. 0 ; e. 步骤d获得的外植体转入除菌培养基上，25°C无光条件进行除菌培养，所述的除菌 培养基为：B5培养基+500mg/L头孢霉素+30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH5. 8-6. 0 ; 待毛状根长出至2-3cm长后，将其剪下，于除菌培养基中25°C暗培养；若未溢菌，则每 隔12-15天转移至新的除菌培养基，所述新的除菌培养基其他成分不变，仅头孢霉素浓度 呈梯度降低，即由刚开始的500mg/L先降至300mg/L，再降至100mg/L，最后降至Omg/L，直至 除菌完全； 若除菌培养过程中出现溢菌现象，则将毛状根用无菌水清洗，吸除残留水分后，重新移 至前一个头孢霉素浓度的新的除菌培养基继续培养； f. 将步骤e所得的脱菌完全的毛状根转入筛选培养基中，培养15天以上，将长势仍然 良好的毛状根剪取一小段，采用CTAB法提取总DNA，以总DNA为模板PCR鉴定是否含C58C1 发根农杆菌特有的rolB、rolC基因和目的基因； 所述的筛选培养基为：B5培养基+5mg/L潮霉素B+30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH 5. 8~6. 0 ； g. 将步骤f中PCR鉴定为阳性的毛状根，转移至液体培养基中，于25°C，lOOrpm暗培养 60-90天，期间每隔12-15天更换一次液体培养基； 所述的液体培养基为：B5培养基+30g/L蔗糖，pH5. 8-6. 0。2. 根据权利要求1所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方 法，其特征在于，所述目的基因为查尔酮异构酶基因CHI。3. 根据权利要求2所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方 法，其特征在于，所述的含有携带目的基因的PHB-Flag表达载体的C58C1发根农杆菌是通 过以下方法构建获得的： 将带有BamHI和SacI两个酶切位点的目的基因CHI和PHB-Flag表达载体都利用BamHI和SacI两种限制性内切酶双酶切，再将CHI用1\连接酶与PHB-Flag表达载体连接之后， 对其进行测序，测序正确则载体构建成功； 用冻融法将构建好的重组质粒导入C58C1发根农杆菌，经抗性筛选及PCR菌检鉴定，获 得含有携带目的基因的PHB-Flag表达载体的C58C1发根农杆菌。4. 根据权利要求1所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方 法，其特征在于，步骤a灯蓋花无菌苗的获得方法如下： 将灯盏花种子用0. 1 %升汞消毒lOmin后，无菌水漂洗3-5次，吸除残留水分，接种到MS培养基上，在温度25±1°C、光照强度40001x、光周期为16h光照8h黑暗的条件下培养 45-60天，获得灯盏花无菌苗； 所述MS培养基为：MS培养基+30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH5. 6-5. 8。5. 根据权利要求1所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方 法，其特征在于，所述的步骤c为， 将步骤a获得的外植体叶盘浸入步骤b中获得的发根农杆菌菌液中，不断轻轻摇晃使 浸染充分，时间为lOmin左右，不超过12min。6. 根据权利要求2所述的一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方 法，其特征在于，步骤f中以总DNA为模板PCR鉴定是否含C58C1发根农杆菌特有的rolB、 rolC基因和目的基因的扩增引物如下： 目的基因CHI扩增引物为： PHB-CHI-F:5' -CTCAAGCTTGGATCCATGGCTGCC-3'（SEQIDN0:1) PHB-CHI-R:5' -CGATACCGTCACTAGTCAAACCATA-3'（SEQIDN0:2)r〇lB基因扩增引物为： rolB-F:5' -CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3'（SEQIDN0:3)rolB-R:5, -GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3,(SEQIDNO:4) rolC基因扩增引物为： rolC-F:5' -TCGCCATGCCTCACCAACTCAC-3'（SEQIDN0:5)rolC-R:5' -CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA-3'（SEQIDN0:6)。
【专利摘要】本发明属于植物生物技术中的植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法。本发明将预培养后的灯盏花无菌苗叶片外植体浸入携带重组质粒的C58C1发根农杆菌菌液中，经侵染、共培养及除菌处理后，将毛状根培养在含潮霉素B(Hyb)的筛选培养基上进行筛选，利用PCR扩增方法进一步鉴定携带目的基因的转基因发根后，液体培养基培养。采用本发明提供的技术方案，可将目的基因导入灯盏花，与聚乙二醇等化学方法的遗传转化相比，减少了原生质体分离和培养的环节；与基因枪等物理方法的遗传转化相比，不需要昂贵的仪器设备，且操作技术简单。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/06
【公开号】CN105255938
【申请号】CN201510710821
【发明人】张磊, 黄鑫, 陈瑞兵, 刘江华
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月28日