-5p 的扩增产物大小为 72bp，其具体序列为:CGTGTTCACAGCGGACCTTGATAAAAAA AAAAAAAAAAAATGGCTCTGGTGCGAATACCTCGGACCCTGCAC。假设本发明所用引物也存在针对 pre-microRNA的非特异扩增，则其扩增产物大小应为12 2bp，其具体序列应为 CGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAAATGTCCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAAT GGGGCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAATGGCTCTGGTGCGAATACCTCGGACCCTGCAC。电泳结果显示扩增产 物小于l(K)bp，大约为70bp-8化P。即不存在针对pre-microRNA的非特异扩增。通过将扩增产 物连入T载体(购自美国Clontech公司）进行基因测序，结果也显示PCR的扩增是特异的针对 成熟 microRNA-124-5p。
[0080] 实施例2
[0081] 对成熟microRNA扩增特异性的比较。利用在使用本发明所介绍的方法检验 microRNA-124-5p表达水平的同时，采用目前常用的Stem-loop PCR方法作对照。用两种方 法检测microRNA-124-5p在神经元内的表达水平，得到的PCR产物同时电泳，W检验两种方 法的特异性。使用本发明所介绍的检验步骤如具体实施例1。使用stem-loop PCR检测的步 骤如下：
[0082] 反转录过程：
[0083] 使用购买的microRNA stem-loop反转录及PCR试剂盒，按使用说明，反转录富集的 小RNA。具体反应体系如表3所示：
[0084] 表 3
[0085]
[0086] 具体反应过程为:37°06〇111111;85°05111111。反转录获得的〇0酷保存于-20°(3。
[0087] 实时定量PCR过程：
[008引实时定量PCR中，采用的引物，按试剂盒说明书准备：上游为microRNA-124-5p的 DNA序列：5'-CGTGTTCACAGCGGACCTTGAT-3' ；下游引物为microRNA stem-loop PCR试剂盒所 带通用下游引物。
[0089] 具体反应体系如表4所示：
[0090] 表 4 Γ00911
[0092] 实时定量PCR反应采用（如美国罗氏公司的）实时定量PCR仪，反应过程为：
[0093] Sl:agel:95°C 3min
[0094] Sl:age2:95°G lOsecond
[0095] 60°C SOsecond 40巧cles
[0096] 结果分析:如（图6)所示，采用本发明所介绍的方法得到的PCR扩增产物条带为单 一条带，小于10化P，大约为70bp-8化P，为特异扩增成熟mic;roRNA-124-5p的条带。采用目前 常用的Stem-loop PCR方法得到的PCR扩增产物条带为Ξ条带，说明采用Stem-loop PCR的 方法无法针对成熟microRNA-124-5p做特异性扩增。
【主权项】
1. 一种特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于，包括W下步骤： 1) 提取样品中包含microRNA组分的总RNA或小RNA，在反转录酶及聚合酶的作用下，反 转录获取cDNA;所述聚合酶为化Iy A聚合酶或化Iy U聚合酶； 2) 根据microRNA成熟序列及pre-microRNA序列，设计只针对microRNA成熟序列的上游 引物，然后进行实时定量PCR，特异性检测成熟mi croRNA表达水平。2. 根据权利要求1所述的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在 于，步骤1)所述的反转录采用一步法进行短时反应。3. 根据权利要求2所述的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在 于，短时反应条件为:37°C，10~15分钟;42°C，10~15分钟;85°C，5分钟。4. 根据权利要求1所述的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在 于，步骤1)中Poly A聚合酶或Poly U聚合酶的使用，由成熟microRNA序列信息和pre-mi croRNA序列信息进行选择。5. 根据权利要求4所述的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在 于： 在pre-mi croRNA序列中，位于待测mi croRNA的5p或化序列下游的两个碱基为-NA-时， 使用poly U聚合酶;其中，N为A，U，C或G中的一个； 在pre-mi croRNA序列中，位于待测mi croRNA的5p或化序列下游的两个碱基为-NU-时， 使用poly A聚合酶;其中，N为A，U，C或G中的一个； 在pre-mi croRNA序列中，位于待测mi croRNA的5p或化序列下游的两个碱基为-NS-时， 使用poly A聚合酶或poly U聚合酶中的任意一个，其中，N为A，U，C或G中的一个;S为C或G中 的一个。6. 根据权利要求1或5所述的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征 在于，步骤1)反转录过程中所用的引物根据所选的化Iy A聚合酶或化Iy U聚合酶而定。7. 根据权利要求1所述的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在 于： 当使用化Iy A聚合酶时，反转录引物序列如SEQ.ID.no. 1所示，且在3'端末尾为VN-;其 中，V为A，C或G中的一个;N为A，T，C或G中的一个； 当使用化Iy U聚合酶时，反转录引物序列如SEQ. ID. NO. 2所示，且在3 '端末尾为BN-;其 中，B为T，C或G中的一个;N为A，T，C或G中的一个。8. 根据权利要求1所述的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在 于，检测成熟microRNA的上游引物为成熟microRNA的DNA序列加上末尾两个碱基，该末尾两 个碱基是根据反转录过程中所选的化Iy A聚合酶或化Iy U聚合酶而定。9. 根据权利要求8所述的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在 于： 当使用化Iy A聚合酶时，检测成熟microRNA的上游引物的末尾添加的两个碱基为-AA; 当使用化Iy U聚合酶时，检测成熟microRNA的上游引物的末尾添加的两个碱基为-TT。10. 实现权利要求1~9中任意一项所述的特异性检测成熟microRNA表达水平的定量检 测方法的试剂盒，其特征在于，能够完成100次反应的试剂盒，包括W下两个部分： a)反转录部分，构成组分为:M-MLV逆转录酶50ul，Poly A聚合酶50ul，Poly U聚合酶 50ul，一步法反应缓冲液200ul，如SEQ. ID.NO. I所示的反转录引物200ul，如SEQ. ID. NO. 2所 示的反转录引物200ul; 所述一步法反应缓冲液包括25mM Tris-HCl，50mM KCl，5mM MgCl2，10mM DTT，120mM NaCiammol dNTP，pH值为7.6; b )定量PCR部分，构成组分为：PCR反应混合液Iml，PCR反应下游通用引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'80ul，PCR反应microRNA特异上游引物SOul; 所述 PCR 反应混合液包括 250U PCR 酶，20mM(NH4)2S〇4,4mM MgS〇4，lmM dNTPs，l% Glycerol, 0.02% Tween货 20，10X Sybr green,pH值为9.1。
【专利摘要】本发明公开了一种特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒，属于分子生物学技术领域，包括以下步骤：1)提取样品的microRNA，在反转录酶及Poly？A聚合酶或Poly？U聚合酶的作用下，反转录获取cDNA；2)根据microRNA成熟序列及pre-microRNA序列，设计只针对microRNA成熟序列的上游引物，然后进行实时定量PCR，特异性检测成熟microRNA表达水平。该方法检测过程简便，检测结果灵敏准确，能够有效用于成熟microRNA(mature？microRNA，长度为20-23个碱基)在细胞或组织内表达水平的检测，检测成熟microRNA的特异性高于目前广泛使用的基于实时定量PCR的其他方法。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105506146
【申请号】CN201610049596
【发明人】闫亚平, 崔浪军, 李科
【申请人】陕西脉元生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月25日